Name: generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model
Uploaded: 2015-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model at JoVE.com

This work was supported by The British Heart Foundation and The Oak Foundation.

Laboratuvar Hayvanları Kullanımı ve Bakımı Kurumsal Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre tüm hayvan deneyleri. Kültür Medya 1. Hazırlık <ol><li> F-12K ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 100 U / ml penisilin ve streptomisin: insan fibroblast hücre çizgisi CCL-153 kültür ortamı olun. </li><li> PiPSC üretimi için yeniden programlanması Ortamın: Nakavt Dulbecco modifiye kartal ortamı (DMEM)% 20 Nakavt serum değiştirilmesi, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 0.1 mM Minimum Esansiyel Medium (MEM) Aslî Olmayan Amino Asitler, 10 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü 2 (bFGF-2) ve 100 U / ml penisilin ve streptomisin üzerine yayıldı. Medyayı kullanmadan önce bFGF-2 taze her zaman ekleyin. </li><li> Düz kas hücresi uyarılması için Farklılaşma Ortamı (DM) olun (SMC) farklılaşması:% 10 FBS, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 100 U / ml penisilin ve streptomisin ve 25 ng / ml Platelet Derive Büyüme Faktörü içeren medya-MEM α(PDGF-ββ). </li><li> Yap Endotel Farklılaşma Ortam endotel hücre (AK) farklılaşmasını uyarması (AT-DM): Endotel Büyüme ortamı-2 (EGM-2), 50 ng içeren ortam / ml Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF) ve 100 U / ml penisilin ve streptomisin üzerine yayıldı. </li></ol> Kısmen kaynaklı Pluripotent Kök Hücre içine 2. yeniden programlanması İnsan Fibroblastlar (PiPSC) <ol><li> Kültür ortamı içinde,% 0.04 jelatin çözeltisi kaplamalı şişeler Kültür insan fibroblast hücre çizgisi CCL-153. </li><li> Geçiş hücreleri 1 arasında bir oranda her 3 günde bir, 6. PiPSC kuşak en yüksek verimlilik için geçit 9 önce hücrelerin kullanın. % 90 ortak akışkanlığa - Hücreler 80 ulaştıktan sonra transfeksiyon için hazırdır. </li><li> 4 yeniden programlama faktörleri içeren polisistronik plazmid pCAG2LMKOSimO linearize oktamer bağlayıcı transkripsiyon faktörü 4 (Oct4), Sox2 Kruppel benzeri faktör 4 (Klf4) ve c-myc (pCAG-OSKM). 37 ° C&#39;de 3 saat Pvu I kısıtlama enzimi 5 adet olan plazmid 5 ug Digest. Arındırmaküreticinin protokolüne göre, ticari bir kit kullanılarak plazmid. </li><li> Transfekte üreticinin protokolüne uygun olarak insan deri fibroblast (NHDF) nucleofection kiti ile elektroporasyon yoluyla doğrusallaştırılmış pCAG-OSKM plazmid 4 ug 2 x 10 6, insan fibroblast. Yavaşça önceden ısıtılmış yeniden programlanması Medya 5 ml ihtiva eden ön% 0.04 jelatin kaplı T25 şişesi üzerine transfekte edilmiş hücreleri, tohum. </li><li> 24 saat sonra, transfekte edilen hücrelerin saf popülasyonu seçmek için 25 ug / ml neomisin ve ek orta değiştirin. </li><li> 4 gün kadar her gün orta değiştirin. Not: İnsan fibroblastları yeniden programlama 4 gün sonra PiPSC olur. </li></ol> Endotel ve düz kas hücrelerinin içine PiPSC 3. Farklılaşma <ol><li> 4 gün boyunca DM içeren kolajen IV önceden kaplanmış yemekleri Tohum PiPSC SMC&#39;ler içine farklılaşmayı teşvik etmek. 4 gün kadar her gün orta değiştirin. </li><li> Kolajen IV önceden kaplanmış yemekleri c Tohum PiPSC6 gün süre ile endotelyal-DM ontaining endotel hücrelerine farklılaşmasını uyarması. 6 gün kadar her gün orta değiştirin. </li></ol> 4. decellularized Aort Greft Hazırlanması Not: Tüm çözümler ve ekipman steril olmalıdır. <ol><li> Servikal dislokasyon ile fare Kurban ve diseksiyon mikroskop altında yatar pozisyonda fare sabitleyin. </li><li> Göğüs boşluğu açmak için sternum üzerinden ve göğüs kafesi etrafında kesin. Aorta maruz kalp, akciğerler ve yemek borusu çıkarın. Yavaşça forseps ile peri-aort yağ çıkarmak. </li><li> Makasla ön ucundan aort kesin ve hafifçe künt forseps ile sona tutun. Künt diseksiyon ile arkasında omurga sütununda aort ayırın. Dikkatle bipolar elektrokoagulatör ile ligasyonu ile aort tüm dallanma arterlerin kapatın ve makas ile ligasyon uzak ucundan kesim. </li><li> 3 m ile aort lümeni temizlemek için bir 5 ml şırınga kullanınkan pıhtılarının oluşumunu önlemek için, heparin, 100 U ihtiva eden tuz çözeltisi l. </li><li> Böbrek içine şube önce aort arka ucunu kesin. Aort bütünlüğünü tutulması tüm prosedür sırasında çok önemlidir. </li><li> Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde sulandırılmış% 0.075 sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisi, 5 ml ile aort lümeni yıkayın. </li><li> 10 cm Petri kabındaki 0.075% SDS çözeltisi içinde torasik aorta bekletin. Oda sıcaklığında 150 rpm&#39;de 2 saat boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde Petri tabağına yerleştirin. </li><li> PBS 5 ml aort lümeni yıkayın. </li><li> 10 cm Petri için PBS içinde aort bekletin. Oda sıcaklığında 150 rpm&#39;de 2 saat boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde Petri tabağına yerleştirin. PBS her 20 dakikada yenileyin. </li><li> PBS 5 ml aort lümeni yıkayın. </li><li> En fazla bir hafta boyunca 4 ° C&#39;de PBS içinde hücresizleştirilmiş aort greft tutun. </li></ol> PiPSC ve Biyoreaktör Havalandırma 5. Çift Tohumculuk Not: Tüm çözüms ve ekipmanlar steril olmalıdır. Bir doku kültürü kaputu tüm işlemleri gerçekleştirin. <ol><li> Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi. Biyoreaktör akış devreyi kurunuz boru ile kuluçka odasına, medya rezervuar, peristaltik pompa ve uyum odasını bağlayın. Dolaşımı için gerekli ortamın az hacmi 40 ml&#39;dir. </li><li> Ön-koşul, bir 10 cm Petri için DM ortamı aortu ıslatılması ile kültür ortamı ile hücresizleştirilmiş damar. Oda sıcaklığında 50 rpm&#39;de 1 saat boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde Petri tabağına yerleştirin. </li><li> Mikroskop altında decellularized kabın iki ucunda içine 1 cm uzunluğunda Naylon tüpleri (OD 0.9 mm, ID 0.75 mm) takın. Gemi ve 8-0 ipek dikişlerle tüpleri kravat. </li><li> Bölme duvar giriş ve çıkış portları (1/32 &quot;boru) ile Naylon tüpler bağlanarak kuluçka odasında decellularized aort greft birleştirin. Orta 5mls her seferinde inkübasyon odası koruyun. </li><li> Ekleyerek önceden ısıtılmış tarafından Trypsinize PiPSCtripsin kültür çanak kapağı ve hafifçe çanak 10 kez rock. Tripsin atın ve 2 inkübatör çanak bırakın - 3 dk. Tabak önceden ısıtılmış bir kültür ortamı ilave edin ve hücreleri ile orta karıştırın. </li><li> Hemasitometre kullanarak hücre sayısını sayın. Santrifüj 300 x g 5 dakika boyunca 5 x 10 5 hücre, her biri hücre süspansiyonları iki alikot. Tamamen süpernatant aspire. </li><li> Tamamen süpernatant aspire sonra, DM 50 ul pip hücre pelet 1 pelletini. Decellularized damar lümenine bu hücre süspansiyonu enjekte. </li><li> Ardından, Matrigel 100 ul diğer tırtıl hücre pelletini. Dikkatle decellularized aort greft üzerine karışımı pipetle. </li><li> Karışım damar dış yüzeyi etrafında sarar eşit bir jel gibi devlet dönüşür kadar 15 dakika - 10 için bekleyin. DM inkübasyon odası doldurun. </li><li> 37 ° C&#39;de bir% 5 CO2 inkübatörü içinde ayarını bütün biyoreaktör yerleştirin. Elle ilk 2 saat içinde decellularized greft boyuna ekseni her yarım saatte yaklaşık 90 ° döndürün. </li><li> Hücre yapışmasını sağlamak için 12 saat için statik kültür tutun. </li><li> Düz kas hücre değişimini etkileme peristaltik pompa ile lümen yoluyla DM verin. 5 ml / dakika ve 24 saat boyunca 20 ml / dakika için adım adım artış, başlangıç ​​akış hızını başlatın. </li><li> 24 saat süre ile 20 ml / dak dolaşım aracı, akış hızı tutun. </li><li> Orta akışını durdurun ve inkübatör dışına ayarı biyoreaktör taşımak. </li><li> Yeniden tohum PiPSC ile greft lümen. 5.6 - Trypsinize, adımlarda 5.5 olarak saymak ve santrifüj 1 x 10 6 PiPSC. 50 ng / ml VEGF ihtiva eden EGM-2 ortamında 50 ul içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Greft lümenine hücre karışımı enjekte edilir. </li><li> Endotel değişimi etkilemek için 50 ng / ml VEGF ihtiva eden EGM-2 ortamında inkübasyon odası ve bütün dolaşımda orta değiştirin. </li><li> Inci geri ayarı biyoreaktör TaşıE inkübatör. Manuel greft ilk 2 saat içinde 90 ° her 30 dk döndürmek ve daha sonra 12 saat için statik bir kültür tutun. </li><li> 5 ml / dakika ve 35 ml / dak kadar adım adım artış, akışı dolaşan başlatın. 5 gün boyunca 35 ml / dakika akış hızındaki tutun. Her gün dolaşan ve oda ortamı değiştirin. </li><li> Fare daha fazla aşılama için tasarlanmış greft Hasat. </li></ol> Fareler içine Çift numaralı seribaşı PiPSC Graft 6. Tırnak <ol><li> Kullanım NOD.CB17-Prkdc scid / damar grefti alıcı olarak NcrCrl erkek fareler. 35 gr, ve iyi sağlık koşulları içinde - Her zaman fareler, yaklaşık 10 haftalık olan yaklaşık 25 tartmak emin olun. </li><li> Periton boşluğu içine Hypnorm (25 mg / kg) ve Hypnovel (25 mg / kg) &#39;in bir bileşimini vermek suretiyle alıcı fare anestezisi. Anestezi altında iken kuruluğu önlemek için göze vazelin oftalmik merhem sürün. Fareler rahat kasları var ve sürekli nefes sağlayarak verimli anesthetization onaylayın. <ol><li> Onun boynu tıraş ve genişletilmiş bir yatar pozisyonda fare sabitleyin. Fare solunum yolu açık kalmasını sağlamak için anestetikler ile kombinasyon halinde atropin sülfat (1,7 mg / kg) uygulayınız. </li></ol></li><li> Fare sternum alt çenenin bir orta hat kesi hazırlayın. 5- ila 10 kat büyütme ile bir mikroskop altında, yanal sağ tükürük bezleri kaldırın ve sağ karotis arter ortaya çıkarmak için doğru cleidomastoid kas çıkarın. </li><li> Yavaşça yakın ucuna doğru uzak ucundan sağ ortak karotid arteri harekete geçirmek için bağlanmış dokular çıkarın. Bir 8-0 ipek sütür ile iki kez karotis arter orta kısmını bağlayan ve iki bağları arasında teşrih. </li><li> Her gemi sonunda otoklav naylon tüp yapılmış bir manşet geçmek ve microhemostat kelepçeleri her ucunu sabitleyin. </li><li> Bir ucunda dikiş bağı sökün ve heparinin bir damla (100 U / ml) uygulanır. Hemen sonra, th uzak ucunu terse arter tüm manşet vücudu kapsayacak ve manşete bir 8-0 ipek sütür ile ters gemi düzeltmek için. <ol><li> Arterin diğer kısmına aynı işlemi tekrarlayın. Tuzlu su çözeltisi ile yıkayın arter kan pıhtıları kaldırmak için. </li></ol></li><li> Arter manşetleri aşkın decellularized damar uçlarını sürgülü ve 8-0 ipek sütür ile sabitlemek karotis arter iki ucu arasında bir decellularized damar grefti implante. Greft atışını değerlendiren önce ya biter vasküler kelepçeleri çıkartın. </li><li> Geri orijinal konumuna doğru tükürük bezi yerleştirin. 6-0 polyglactin sütür kullanarak bir kesintiye sütür ile cerrahi yere cilt kapatın. </li><li> Prosedür tamamlandıktan sonra bilincini yeniden başlayıncaya kadar tutarlı, fare hayati belirtilerini gözlemlemek. Servikal dislokasyon ve hasat damar grefti ile 24 saat ya da daha sonra daha fazla analiz için 3 hafta ya alıcı fareler Kurban. </li></ol>

<ol>
	<li>Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Tissue-Engineered+Vascular+Grafts+for+Cardiac+Surgery:+Past,+Present,+and+Future.">Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).</li><li>Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+follow-up+of+patients+with+synthetic+right+heart+conduits.">Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits.</a> Circulation. 72, II77-II83 (1985).</li><li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+insight:+the+evolution+of+tissue-engineered+vascular+grafts-from+research+to+clinical+practice.">Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice.</a> Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).</li><li>Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+blood+vessel.">Tissue engineering of blood vessel.</a> J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).</li><li>Cearbhaill, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+mesenchymal+stem+cells+to+the+biomechanical+environment+of+the+endothelium+on+a+flexible+tubular+silicone+substrate.">Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate.</a> Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).</li><li>Gong, Z., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+(hMSCs).">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs).</a> FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).</li><li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+HSP47+augments+mouse+embryonic+stem+cell+smooth+muscle+differentiation+and+chemotaxis.">Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis.</a> PLoS One. 9 (1), e86118 (2014).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+CD34++progenitor+cells+by+combined+modulation+of+the+MEK/ERK+and+BMP4+signaling+pathways.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways.</a> Blood. 116, 5762-5772 (2010).</li><li>Samuel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functionally+competent+and+durable+engineered+blood+vessels+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).</li><li>Margariti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+fibroblasts+into+endothelial+cells+capacble+of+angiogenesis+and+reendothelialization+in+tissue-engineered+vessels.">Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).</li><li>Karamariti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+cells+differentiated+from+reprogrammed+embryonic+lung+fibroblasts+through+DKK3+signaling+are+potent+for+tissue+engineering+of+vascular+grafts.">Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts.</a> Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).</li><li>Udelsman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+operator-independent+method+for+seeding+tissue-engineered+vascular+grafts.">Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).</li><li>Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+human+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin-based+vascular+tissue+engineering+constructs.">Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs.</a> Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).</li><li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+control+vascular+stem/progenitor+cell+plasticity+through+tumor+necrosis+factor-&#945;-mediated+nuclear+factor-&#954;B+activation.">Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-&#945;-mediated nuclear factor-&#954;B activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).</li><li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirolimus+stimulates+vascular+stem/progenitor+cell+migration+and+differentiation+into+smooth+muscle+cells+via+epidermal+growth+factor+receptor/extracellular+signal-regulated+kinase/&#946;-catenin+signaling+pathway.">Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/&#946;-catenin signaling pathway.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).</li><li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+matrices:+State+of+the+art.">Three-dimensional cell culture matrices: State of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).</li><li>Hung, H. S., Hsu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Advances+of+stem+cell-based+approaches+to+tissue-engineering+vascular+grafts.">Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts.</a> OA Tissue Engineering. 1 (1), 2 (2013).</li><li>Quint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit.">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).</li><li>Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+antiplatelet+adhesion+layer+on+an+electrospun+scaffold+using+porcine+endothelial+progenitor+cells.">Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells.</a> J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).</li><li>Hibino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+use+of+an+induced+puripotent+stem+cell+sheet+for+the+construction+of+tissue-engineered+vascular+grafts.">Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+to+engineer+small-diameter+vascular+grafts+from+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).</li><li>Tsai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+stem+cells+to+neointimal+formation+of+decellularized+vessel+grafts+in+a+novel+mouse+model.">Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model.</a> Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).</li><li>Kasimir, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+decellularization+procedures+of+porcine+heart+valves.">Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves.</a> Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).</li><li>Stephenson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+propagation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+from+frozen+embryos+in+an+animal+product-free+environment.">Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment.</a> Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).</li><li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures.">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).</li><li>McCall, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+infarction+and+intramyocardial+injection+models+in+swine.">Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine.</a> Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).</li><li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+an+allogeneic+vein+bioengineered+with+autologous+stem+cells:+a+proof-of-concept+study.">Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study.</a> Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).</li></ol>

Yazarlar herhangi çatışan mali çıkarları var.

Mevcut protokol fonksiyonel doku mühendisliği kaplar insan fibroblastlardan PiPSC kullanılarak üretilebilir olan bir ses, hızlı, basit, verimli ve tekrarlanabilir bir strateji gösterir. Bu teknik, yakın gelecekte rejeneratif tıp, doku mühendisliği ve potansiyel hastaya özgü hücre tedavisi için değerli bir araç temsil eder. Protokol etkinliğini sağlamak için kritik adım vasküler biyoreaktör içinde PiPSC hazırlanmasını, steril ve tamamen hücresizleştirilmiş aort greft, iskeleleri PiPSC başar...

vasküler kanalların yapımı kardiyovasküler hastalıklar sonucu hasar ve yaralı damarların cerrahi onarımı için bir temel stratejidir. , Alograftlarını, otolog doku (perikard veya safen ven) ve xenografts 1; Bugüne kadar, cerrahide kullanılan greft materyalleri biyouyumlu sentetik polimerler ([Gore-Tex ePTFE] veya polietilen tereftalat [Dacron] politetraflüoroetilen [Teflon], genişletilmiş politetrafloroetilen) içerir. Yapay greftler (örn, Gore-Tex ve Dacron) en sık kullanılan iken, bu malzemeler büyük olasılıkla darlık, kalsiyum birikimi, trombo-embolizasyon ve enfeksiyonlar dahil birçok kısa ve uzun vadeli komplikasyonlara neden. Ile mevcut biyolojik greft olan hastalar tromboembolik olaylar azalmış olsa da, hala bu tür kireçlenme bozulması 2 sayesinde ikincil greft yetmezliği ve kısaltılmış dayanıklılık gibi sınırlamalarla karşılaşabilirler. Bu nedenle, cerrahi t önemli gelişmelere rağmenyaş, araştırmacılar ve klinisyenler üzerinde tekniki hala damar hastalıkları için ideal bir kanal tanımlamak için ihtiyaç yükü vardır. Daha yakın zamanlarda, vasküler doku mühendisliği araştırma alanı hücreleri başarılı aşılama 1 için fonksiyonel gemi özetler bir biomimetic ortamı yaratmak amacı ile, biyolojik olarak parçalanabilen iskeleleri dahil edildiği bir kavram üretti. Temelde, vasküler yapıların başarısı üç temel bileşenleri bağlıdır; yani iskele, bir endotelyal hücre iç tabaka ve bir düz kas hücresi tabakası, ana damar karşılaştırılabilir mekanik özelliklerinin temin edilmesi için uygun olan hücre dışı matris içeren bir iskele ve / regülatör başlatılması için gerekli olan hücre / moleküler sinyali meydana getiren hücreler onarım. Uzun vadeli greft açıklığı ve neo-dokuların sürekli gelişim, inci iskelelerinin etkin hücre tohumlama son derece bağımlı olanereby kritik öneme sahip, hücre tipi kararını hale getirir. Çeşitli raporlar, küçük çaplı devreleri 3-6 geliştirmek için olgun endotelyal ve çeşitli kaynaklardan yumuşak kas hücrelerinin kullanımını göstermektedir. Umut verici olmasına rağmen, yeterli otolog damarların olmaması, olgun endotel ve düz kas hücrelerinin önemli bir yük olarak kalmaktadır elde edildi. Daha yakın zamanlarda, çeşitli kaynaklardan alınan kök hücreler vasküler doku mühendisliği uygulamaları için istismar edilmiştir. Gerçekten de, embriyonik kök hücreler 7 de dahil olmak üzere, kök hücre tipleri, çeşitli uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, kemik iliğinden türetilmiş mononükleer hücreler, 12, mezenkimal kök hücreler 13, endotelyal progenitör hücreler ve erişkin damar duvarı kök türevi hücre antijeni-1 (Sca-1) + 14,15 tanımlanmış tüm ortam yanıt olarak fonksiyonel endotel veya düz kas hücreleri ya da farklılaşma yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir kök / progenitör hücreleri veKültür koşulları. Ayrıca, kök hücrelerin sınırsız kendini yenileme kapasitesi onlara olgun endotel ve sadece büyüme tutuklama ve yaşlanmayı geçiren kez önce sonlu sayıda bölebilirsiniz düz kas hücrelerinin aksine daha aday olun. aşılama gibi biyouyumluluk, biyomekanik özellikleri ve biyolojik ayrışma oranı gibi çeşitli faktörlere bağlıdır için iskele malzemesinin seçimi başarılı doku mühendisliği gemi üretmek için. Temelde, malzeme biyobozunur olmalıdır greft için iskeleler oluşturmak için kullanılan ve gereksiz alıcı bağışıklık yanıtları monte olmaz. Ayrıca, hücre eki ve sonraki yaşam için uygun bir gözeneklilik ve mikro kapsaması gerekir. Bugüne kadar, vasküler doku mühendisliği iskeleleri için kullanılan en yaygın malzeme poliglikolik asit, polilaktik asit, ve poli ε-kaprolakton 16 polimerleri içerir. Daha yakın zamanlarda, decellularized biyolojik maddeler varAyrıca bazı başarı ile uygulanmıştır. Çeşitli laboratuarlar otolog hücreler hücresizleştirilmiş bir insan, köpek veya domuz damarları tohumlama pıhtılaşma ve intimal hiperplazi 17-19 karşı biyolojik bir greft mesafede olduğunu göstermiştir. Vasküler doku mühendisliğinde diğer stratejiler iskele desteği 20, 21 olmadan örneğin hücre dışı matriks proteinleri tabanlı vasküler greft, fibrin jel 13 tohumlama hücreleri ve üreten hücre tabakaları içerir. Mevcut protokol fonksiyonel endotel ve düz kas hücreleri, ağır kombine immün yetmezlik içine doku mühendisliği gemilerin fonksiyonel PiPSC türetilmiş damar hücrelerini liman için decellularized damar iskele oluşan biyoreaktör ve grefti nesil (SCID içine insan PiPSC farklılaşmasını gösteriyor ) fareler. PiPSC bu hücreler farelerde tümörler oluşturur ya da etik zam yok, çünkü damar greft doku mühendisliği için kullanılacak optimum hücre tipi veallo-immün yanıtlar. Ayrıca, biz pip-endotel hücreleri ve tırtıl-düz kas hücrelerinin üretilmesi için strateji verimli ve 10,11 tekrarlanabilir olduğunu göstermiştir. Bundan sonra, biz, böylece aşılama ve hayatta kalma etkinliğini arttırmak, yakından bir yerli geminin içinde var matriks proteinleri taklit etmek PiPSC türetilmiş vasküler hücrelerin tohumlama için bir decellularized gemi tasarladı. Bundan başka, tohumlama PiPSC damarların decellularization makrofajlar gibi bağışıklık hücre tipleri ile monte enflamatuar yanıtların ortaya çıkmasını engellemektedir. Daha da önemlisi, bu protokol sadece insanlar içine çeviri için damar olukları umut oluşturmak için bir metodoloji temsil etmez, aynı zamanda eğitim ve fare modelleri ile vasküler doku yenilenmesini yöneten moleküler mekanizmaları anlamak değerli bir araç sağlar.

<table><tbody><tr><td>Human Fibroblasts CCL-153</td><td>ATCC</td><td>CCL-153</td><td>Prenatal human embryonic fibroblasts</td></tr><tr><td>ATCC F-12K Medium (Kaighn&#039;s Modification of Ham&#039;s F-12 Medium)</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells</td><td>Life technologies (Gibco)</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Human Basic FGF-2&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-837</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM medium</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>32571093</td><td></td></tr><tr><td>Human PDGF</td><td>R&amp;amp;D System</td><td>120-HD-001</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin Solution 2%</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)</td><td>Addgene</td><td>20866</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;PvuI Restriction Enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>RO150S</td><td></td></tr><tr><td>SureClean Plus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>Nucelofection Kit (NHDF Kit)</td><td>LONZA</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>SIGMA</td><td>G418</td><td></td></tr><tr><td>KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy</td><td>SCHOTT</td><td>KL 1500 LCD</td><td>Cold light illumination for stereo microscopy</td></tr><tr><td>Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent</td><td>Severn Biotech</td><td>CAS 151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (10mg/ml)</td><td>BD</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7&amp;nbsp;</td><td>Jepson Bolton&#039;s, Janke&amp;amp;Kunkel</td><td>S32-102</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Pump Drive</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-15</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S large cartridges for pump head</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-75</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft</td><td>Cole-Parmer&amp;nbsp;</td><td>WZ-96410-14</td><td>Tubing goes through the peristaltic pump</td></tr><tr><td>0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing</td><td>SILEX</td><td>N/A</td><td>Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td>Adapter connect above two types of tubings</td></tr><tr><td>1/32&quot; Tubing, ID 0.01&quot; (250&amp;micro;m) Material: PEEK</td><td>LabSmith</td><td>T-132-010P</td><td>Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing</td></tr><tr><td>One-Piece Fittings&amp;nbsp;</td><td>LabSmith</td><td>T-132-100</td><td>Fix the above tubings through the incubation chamber wall</td></tr><tr><td>Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm)&amp;nbsp;</td><td>Smiths Medical</td><td>N/A</td><td>Tubings insert into two ends of the aorta graft</td></tr><tr><td>NOD.CB17-Prkdc&lt;sup&gt;scid&lt;/sup&gt;/NcrCrl mouse</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical sutures, 8-0&amp;nbsp; silk</td><td>ETHICON</td><td>W819</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>Vetapharm</td><td>Vm21757/4000</td><td>Neuroleptanalgesic for use in mice</td></tr><tr><td>Hypnovel (Midazolam)</td><td>Roche</td><td>59467-70-8</td><td>Induction of anaesthesia</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Tubing</td><td>Portex LTD</td><td>800/200/100/200</td><td>0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff</td></tr><tr><td>Electrocoagulator</td><td>Martin&amp;nbsp;</td><td>SN 54.131</td><td>Ligation of artery branches on aorta</td></tr><tr><td>Bipolar micro hemostat forceps</td><td>Martin</td><td>80-91-12-04</td><td>Fixation of vessel ends</td></tr><tr><td>Vessel Dilator</td><td>S&amp;amp;T</td><td>JFX-7</td><td></td></tr><tr><td>Vessel Dilator</td><td>S&amp;amp;T</td><td>JFL-3dZ</td><td></td></tr><tr><td>Vessel Dilator</td><td>S&amp;amp;T</td><td>D-5aZ</td><td></td></tr><tr><td>Mini applier&amp;nbsp;</td><td>AESCULAP</td><td>FE572K</td><td></td></tr><tr><td>Micro hemostats clips</td><td>AESCULAP</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>Surgical sutures, 6-0 VICRYL</td><td>ETHICON</td><td>V489</td><td></td></tr></tbody></table>

generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

PiPSC başarılı üretimi 4 transkripsiyon faktörleri, Oct4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) taşıyan bir doğrusallaştırılmış pCAG2LMKOSimO plazmitle insan fibroblastları nucleofecting 4 gün sonra doğrulanmıştır. PiPSC fibroblastlar (Şekil 2A) ile karşılaştırıldığında belirgin bir şekilde farklı bir fenotipini gösterdi ve mRNA (Şekil 2B) ve protein (Şekil 2C) seviyelerinin 10 4 yeniden programlama faktörleri olarak ifade edilmiştir. ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model at JoVE.com

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Burada, biz çift tohumlama kısmen uyarılmış pluripotent kök hücre ile farelere aşılama için fonksiyonel doku mühendisliği gemi greft oluşturmak için bir protokol mevcut (PiPSC) - Bir decellularized damar iskele biyoreaktör üzerinde elde edilen endotel hücreleri - düz kas hücreleri ve PiPSC türetilmiş.

Bir Fare Modeli Doku mühendisliği Kapların Üretimi ve Tırnak

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

generation-and-grafting-of-tissue-engineered-vessels-in-a-mouse-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.0K Görüntüleme.  King's College London BHF Centre.  Burada, biz çift tohumlama kısmen uyarılmış pluripotent kök hücre ile farelere aşılama için fonksiyonel doku mühendisliği gemi greft oluşturmak için bir protokol mevcut (PiPSC) - Bir decellularized damar iskele biyoreaktör üzerinde elde edilen endotel hücreleri - düz kas hücreleri ve PiPSC türetilmiş. 

Video: Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

Damar Hastalığı Çalışmaları Farelerde Ortotopik Aort Nakli

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Tıp

Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

Graft arteriosclerois (GA), also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over months to years in transplanted organs characterized by diffuse, circumferential stenosis of the entire graft vascular tree. The most critical component of GA pathogenesis is the proliferation of smooth muscle-like cells within the intima. When a human coronary artery segment is interposed into the infra-renal aortae of immunodeficient mice, the intimas could be expand in response to adoptively transferred human T cells allogeneic to the artery donor or exogenous human IFN-&gamma; in the absence of human T cells. Interposition of a mouse aorta from one strain into another mouse strain recipient is limited as a model for chronic rejection in humans because the acute cell-mediated rejection response in this mouse model completely eliminates all donor-derived vascular cells from the graft within two-three weeks. We have recently developed two new mouse models to circumvent these problems. The first model involves interposition of a vessel segment from a male mouse into a female recipient of the same inbred strain (C57BL/6J). Graft rejection in this case is directed only against minor histocompatibility antigens encoded by the Y chromosome (present in the male but not the female) and the rejection response that ensues is sufficiently indolent to preserve donor-derived smooth muscle cells for several weeks. The second model involves interposing an artery segment from a wild type C57BL/6J mouse donor into a host mouse of the same strain and gender that lacks the receptor for IFN-&gamma; followed by administration of mouse IFN-&gamma; (delivered via infection of the mouse liver with an adenoviral vector. There is no rejection in this case as both donor and recipient mice are of the same strain and gender but donor smooth muscle cells proliferate in response to the cytokine while host-derived cells, lacking receptor for this cytokine, are unresponsive. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, both models can be used to assess the effect of specific genes on GA progression. Here, we describe detailed protocols for our mouse GA models.

We describe protocols for our mouse graft arteriosclerois (GA) models which involve interposition of a mouse vessel segment into a recipient of the same inbred strain. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, the model can assess the effect of specific genes on GA.

Greft damar sertliği için fare modelleri

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Doku Engineered Vasküler Greftlerinin ve sonraki İmplantasyonunda Cerrahi Tekniği<em&gt; İn Vivo</em&gt; İzleme

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Biyomühendislik

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are available to perform mechanistic in vivo studies. While heart transplantation models using a suture technique were first successfully developed in rats, the translation into an equally widespread used murine equivalent was never achieved due the technical complexity of the microsurgical procedure. In contrast, non-suture cuff techniques, also developed initially in rats, were successfully adapted for use in mice1-3. This technique for revascularization involves two major steps I) everting the recipient vessel over a polyethylene cuff; II) pulling the donor vessel over the formerly everted recipient vessel and holding it in place with a circumferential tie. This ensures a continuity of the endothelial layer, short operating time and very high patency rates4.
Using this technique for vascular anastomosis we performed more than 1,000 cervical heart transplants with an overall success rate of 95%. For arterial inflow the common carotid artery and the proximal aortic arch were anastomosed resulting in a retrograde perfusion of the transplanted heart. For venous drainage the pulmonary artery of the graft was anastomosed with the external jugular vein of the recipient5.
Herein, we provide additional details of this technique to supplement the video.

The murine cervical heart transplantation model is well suited for immunological as well as ischemia reperfusion injury studies. We modified the procedure using a non-suture cuff technique and performed more than 1,000 successful transplants with this approach.
Herein, we provide additional details of this technique to supplement the video.

Modifiye Manşet Tekniği Sıçangiller Servikal Kalp Nakli Modeli

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

Fare Modeli Inferior Vena Cava İnterpozisyon Greft İmplantasyonu

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

3D Baskılı Kılavuzları ve Halka İstifleme Yöntemiyle Engineered Vasküler Greft ölçeklendirme

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

Farelerde A Novel Mikrocerrahi Heterotopik Modeli, En Bloku Göğüs Duvarı, Thymus ve Kalp Nakli

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional tissue. Tissue engineering holds great promise as a potential solution with its ability to integrate cells and signaling molecules into a 3-dimensional scaffold. Recent work with tissue engineered tracheal grafts (TETGs) has seen some success but their translation has been limited by graft stenosis, graft collapse, and delayed epithelialization. In order to investigate the mechanisms driving these issues, we have developed a mouse model for tissue engineered tracheal graft implantation. TETGs were constructed using electrospun polymers polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU) in a mixture of PET and PU (20:80 percent weight). Scaffolds were then seeded using bone marrow mononuclear cells isolated from 6-8 week-old C57BL/6 mice by gradient centrifugation. Ten million cells per graft were seeded onto the lumen of the scaffold and allowed to incubate overnight before implantation between the third and seventh tracheal rings. These grafts were able to recapitulate the findings of stenosis and delayed epithelialization as demonstrated by histological analysis and lack of Keratin 5 and Keratin 14 basal epithelial cells on immunofluorescence. This model will serve as a tool for investigating cellular and molecular mechanisms involved in host remodeling.

Graft stenosis poses a critical obstacle in tissue engineered airway replacement. To investigate cellular mechanisms underlying stenosis, we utilize a murine model of tissue engineered tracheal replacement with seeded bone marrow mononuclear cells (BM-MNC). Here, we detail our protocol, including scaffold manufacturing, BM-MNC isolation, graft seeding, and implantation.

Tohum ve bir biyosentetik doku Mühendisliği trakeal greft bir fare modeli implantasyonu

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the aorta in mice using the sleeve method was short and easy averaging 20 min, permitting studies of iso/allo grafts. The following article describes the aortic transplantation procedure used in our laboratory. The mice were anesthetized with a mixture of 1.5% volume isoflurane and 100% oxygen through a face mask. At this point, the segment of the aorta between the renal arteries and its bifurcation was separated from the vena cava, freely prepared and clampedat the proximal and distal segments with a single silk suture. Prior to the removal of the aorta, a saline solution containing heparin was injected into the inferior vena cava. Then the aorta was cut between the clamps and a saline heparin solution was used to flush the lumen. The sleeve technique with monofilament sutures was used in order to transplant the abdominal aorta in the orthotopic position.

We present an orthotopic aortic transplantation model using the sleeve technique in mice. It is a very rapid anastomosis method, which can be employed in studies of vascular disease.

Kol tekniği aort transplantasyonu - eğitici bir Video bir fare Model kullanma

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

Mouse Heterotopic Cervical Cardiac Transplantation Utilizing Vascular Cuffs

Murine models of cardiac transplantation are frequently utilized to study ischemia-reperfusion injury, innate and adaptive immune responses after transplantation, and the impact of immunomodulatory therapies on graft rejection. Heterotopic cervical heart transplantation in mice was first described in 1991 using sutured anastomoses and subsequently modified to include cuff techniques. This modification allowed for improved success rates, and since then, there have been multiple reports that have proposed further technical improvements. However, translation into more widespread utilization remains limited due to the technical difficulty associated with graft anastomoses, which requires precision to achieve adequate length and caliber of the cuffs to avoid vascular anastomotic twisting or excessive tension, which can result in damage to the graft. The present protocol describes a modified technique for performing heterotopic cervical cardiac transplantation in mice which involves cuff placement on the recipient's common carotid artery and the donor's pulmonary artery in alignment with the direction of the blood flow.

Mouse cardiac transplantation models represent valuable research tools for studying transplantation immunology. The present protocol details mouse heterotopic cervical cardiac transplantation that involves the placement of cuffs on the recipient's common carotid artery and the donor's pulmonary artery trunk to allow for laminar blood flow.

Bir Fare Modeli Doku mühendisliği Kapların Üretimi ve Tırnak

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler