This work was supported by The British Heart Foundation and The Oak Foundation.

Realice todos los experimentos con animales de acuerdo a los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio. 1. Preparación de Medios de Cultivo <ol><li> Hacer medios de cultivo para la línea celular de fibroblastos humanos CCL-153: F-12K mediana, suero bovino fetal al 10% (FBS) y 100 U / ml de penicilina y estreptomicina. </li><li> Hacer reprogramación de medios para la generación de PIPSC: medio de Eagle modificado de Knockout Dulbecco (DMEM) que contiene 20% suero sustitución Knockout, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM Medio Esencial Mínimo (MEM) de ácidos no esencial Amino, 10 ng / factor de crecimiento de fibroblastos básico ml 2 (bFGF-2) y 100 U / ml de penicilina y estreptomicina. Añadir bFGF-2 frescos cada vez antes de usar los medios de comunicación. </li><li> Hacer Diferenciación Media (DM) para inducir células del músculo liso (SMC) Diferenciación: α-MEM medios que contienen 10% de FBS, Factor de Crecimiento 0,1 mM β-mercaptoetanol, 100 U / penicilina y estreptomicina y 25 ml ng / ml derivado de las plaquetas(PDGF-ββ). </li><li> Hacer endotelial Diferenciación Media (EC-DM) para inducir células endoteliales (CE) Diferenciación: medios que contienen 50 ng de crecimiento endotelial medios de comunicación-2 (EGM-2) / ml factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y 100 U / ml de penicilina y estreptomicina. </li></ol> 2. Reprogramación fibroblastos humanos en células madre pluripotentes inducidas (parcialmente PIPSC) <ol><li> Cultura línea celular de fibroblastos humanos CCL-153 en 0.04% de la solución de gelatina frascos revestidos en medio de cultivo. </li><li> Células Passage cada 3 días en una proporción de 1: 6. Utilice las células antes del paso 9 para una óptima eficiencia de la generación PIPSC. Las células están listas para la transfección al llegar a 80 - 90% de confluencia. </li><li> Linealizar pCAG2LMKOSimO plásmido policistrónico que contiene 4 factores de reprogramación octamer vinculante factor de transcripción 4 (OCT4), Sox2, factor de Kruppel-like 4 (KLF4) y C-MYC (pCAG-OSKM). Digerir 5 g de plásmido con 5 unidades de enzima de restricción PvuI durante 3 horas a 37 ° C. Purificarel plásmido con un kit comercial según el protocolo del fabricante. </li><li> Transfectar 2 x 10 6 fibroblastos humanos con 4 g de plásmido pCAG-OSKM linealizado mediante electroporación con el kit de fibroblastos dérmicos humanos (NHDF) nucleofection según el protocolo del fabricante. Sembrar suavemente las células transfectadas en pre 0,04% de gelatina recubierta matraz T25 que contiene 5 ml de pre-calentado reprogramación de medios. </li><li> Después de 24 horas, cambio de medio con suplementos de 25 mg / ml de neomicina para seleccionar una población pura de células transfectadas. </li><li> Cambio de medio cada dos días hasta el día 4. Nota: Los fibroblastos humanos se convierten en PIPSC después de 4 días de reprogramación. </li></ol> 3. Diferenciación de PIPSC en células endoteliales y musculares lisas <ol><li> PIPSC Seed en platos de colágeno IV pre-recubiertos que contienen DM durante 4 días para inducir la diferenciación en las SMC. Cambio de medio cada dos días hasta el día 4. </li><li> PIPSC Semilla de colágeno IV pre-recubierto platos containing endotelial-DM durante 6 días para inducir la diferenciación en las células endoteliales. Cambie medio cada dos días hasta el día 6. </li></ol> 4. Descelularizado Aorta Preparación del injerto Nota: Todas las soluciones y equipos deben ser estériles. <ol><li> Sacrificar el ratón por dislocación cervical y fijar el ratón en una posición supina bajo microscopio de disección. </li><li> Corte a través del esternón y alrededor de la caja torácica para abrir la cavidad torácica. Quite el corazón, los pulmones y el esófago para exponer la aorta. Retire con cuidado la grasa peri-aorta con fórceps. </li><li> Cortar la aorta desde el extremo anterior con unas tijeras y coloque un lado del extremo con fórceps romos. Separe la aorta de la columna de la columna vertebral por detrás mediante disección roma. Cierre con cuidado todas las arterias de ramificación de la aorta por la ligadura con un electrocoagulador bipolar y el corte desde el otro extremo de la ligadura con unas tijeras. </li><li> Utilice una jeringa de 5 ml para limpiar el lumen de la aorta con 3 ml de solución salina que contiene 100 U de heparina para prevenir la formación de coágulos de sangre. </li><li> Cortar el extremo posterior de la aorta antes se ramifica en el renal. Mantener la integridad de la aorta es muy importante durante todo el procedimiento. </li><li> Enjuague el lumen de la aorta con 5 ml de dodecilsulfato de sodio (SDS) solución de 0,075% diluido en tampón fosfato salino (PBS). </li><li> Remojar la aorta torácica en solución de SDS al 0,075% en una placa de Petri de 10 cm. Coloque la placa de Petri en un agitador orbital durante 2 horas a 150 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague el lumen de la aorta con 5 ml de PBS. </li><li> Remoje la aorta en PBS en una placa de 10 cm de Petri. Coloque la placa de Petri en el agitador orbital durante 2 horas a 150 rpm a temperatura ambiente. Actualizar PBS cada 20 minutos. </li><li> Enjuague el lumen de la aorta con 5 ml de PBS. </li><li> Mantenga injerto aorta descelularizado en PBS a 4 ° C durante un máximo de una semana. </li></ol> 5. Dual Siembra de PIPSC y biorreactor acondicionado Nota: Todas solución des y el equipo deben ser estériles. Realizar todas las operaciones en una campana de cultivo de tejidos. <ol><li> Montar el circuito de flujo de biorreactor, como se ilustra en la Figura 1. Conectar cámara de incubación, depósito de medio, la bomba peristáltica y la cámara de cumplimiento de la tubería. Volumen mínimo de medio necesario para la circulación es de 40 ml. </li><li> Pre-condición del recipiente descelularizado con medio de cultivo empapando la aorta en un medio de DM en un plato de 10 cm Petri. Coloque la placa de Petri en el agitador orbital durante 1 hora a 50 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Introduzca 1 cm tubos de nylon de longitud (OD 0,9 mm, ID 0,75 mm) en ambos extremos de la vasija descelularizado bajo el microscopio. Ate el recipiente y los tubos con 8-0 suturas de seda. </li><li> Montar el injerto de aorta descelularizado en la cámara de incubación mediante la conexión de los tubos de nylon con los puertos de entrada y salida (1/32 &quot;) de tubos de la pared de la cámara. Mantener cámara de incubación con 5 ml de medio cada vez. </li><li> Trypsinize PIPSC añadiendo precalentadotripsina para cubrir la placa de cultivo y el rock suavemente el plato 10 veces. Deseche la tripsina y dejar el plato en la incubadora durante 2 - 3 minutos. Añadir medio de cultivo pre-calentado en el plato y mezclar el medio con las células. </li><li> Contar el número de células usando un hemocitómetro. Centrifugar dos alícuotas de suspensiones celulares que contienen 5 x 10 5 células cada uno durante 5 min a 300 x g. Aspirar el sobrenadante por completo. </li><li> Después de aspirar el sobrenadante por completo, resuspender 1 pellet de las pepitas sedimentos celulares en 50 l de DM. Inyectar esta suspensión de células en la luz del vaso descelularizados. </li><li> A continuación, volver a suspender el sedimento celular otra pips en 100 l de Matrigel. Pipetear con cuidado la mezcla sobre el injerto de aorta descelularizado. </li><li> Espere de 10 - 15 min hasta que la mezcla se convierte en un estado similar a un gel uniformemente y se envuelve alrededor de la superficie externa del vaso. Llene la cámara de incubación con DM. </li><li> Configuración de lugar en una incubadora de CO2 al 5% todo el biorreactor a 37 ° C. Girar manualmente el injerto descelularizado 90 ° alrededor del eje longitudinal cada media hora en el primero 2 hr. </li><li> Mantenga la cultura estática durante 12 horas para permitir la adhesión celular. </li><li> Entregar DM a través del lumen por la bomba peristáltica para inducir la diferenciación de células musculares lisas. Iniciar la velocidad de flujo inicial en 5 ml / min y aumento escalonado a 20 ml / min durante 24 hr. </li><li> Mantener la tasa de flujo del medio circulante a 20 ml / min durante 24 horas. </li><li> Detener el flujo del medio y mover el ajuste de la incubadora biorreactor. </li><li> Re-semilla del lumen del injerto con PIPSC. Trypsinize, recuento y centrifugar 1 x 10 6 PIPSC como en los pasos 5.5 a 5.6. Resuspender las células en 50 l de medio EGM-2 que contienen 50 ng / ml de VEGF. Inyectar la mezcla de células en el lumen del injerto. </li><li> Cambiar el medio en la cámara de incubación y toda la circulación en EGM-2 medio que contiene 50 ng de VEGF / ml para inducir la diferenciación endotelial. </li><li> Mueva retrasando a th el biorreactore incubadora. Gire manualmente el injerto 90 ° cada 30 minutos en las primeras 2 horas y luego mantener una cultura estática durante 12 horas. </li><li> Iniciar la circulación de flujo de 5 ml / min y aumento escalonado a 35 ml / min. Mantener el caudal a 35 ml / min durante 5 días. Cambiar circulante y medio cámara de cada dos días. </li><li> Se recoge el injerto de ingeniería para su posterior injerto de ratón. </li></ol> 6. El injerto de doble cabeza de serie PIPSC injerto en ratones <ol><li> Uso NOD.CB17-Prkdc scid / NcrCrl ratones macho como receptores de injertos buque. Asegúrese siempre de que los ratones son alrededor de 10 semanas de edad, pesan aproximadamente 25 - 35 g, y se encuentran en buenas condiciones de salud. </li><li> Anestesie ratón receptor mediante la administración de una combinación de Hypnorm (25 mg / kg) y Hypnovel (25 mg / kg) por vía intraperitoneal. Aplicar vaselina pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Confirme anestesia eficiente, garantizando que los ratones tienen los músculos relajados y están respirando constantemente. <ol><li> Fijar el ratón en una posición supina con su cuello afeitó y extendido. Administrar sulfato de atropina (1,7 mg / kg) en combinación con los anestésicos para asegurar que las vías respiratorias del ratón sigue siendo clara. </li></ol></li><li> Preparar una incisión en la línea media de la mandíbula al esternón del ratón. Bajo un microscopio de disección con 5 a 10 veces la amplificación, levantar las glándulas salivales derecha lateralmente y eliminar el músculo esternocleido- derecho a exponer la arteria carótida común derecha. </li><li> Retire con cuidado los tejidos unidos a movilizar a la arteria carótida común derecha desde el extremo distal hacia el extremo proximal. Ligar la porción media de la arteria carótida común dos veces con una sutura de seda 8-0 y disecar entre los dos lazos. </li><li> Pasar a través de un manguito de tubo de nylon autoclavable en cada extremo del vaso y fijar cada extremo con pinzas microhemostat. </li><li> Quitar el lazo de sutura en un extremo y aplicar una gota de heparina (100 U / ml). Inmediatamente después, invertir el extremo distal del ésimoe arteria para cubrir todo el cuerpo del manguito y fijar el recipiente invertido con una sutura de seda 8-0 en el manguito. <ol><li> Repetir el mismo procedimiento para la otra porción de la arteria. Arteria Lavar con solución salina para eliminar los coágulos de sangre. </li></ol></li><li> Implantar un injerto de vaso descelularizado entre dos extremos de la arteria carótida por deslizamiento los extremos de los vasos de la descelularizados a través de los puños de la arteria y la fijación con suturas de seda 8-0. Eliminar pinzas vasculares de cualquiera de los extremos antes de evaluar la pulsación del injerto. </li><li> Coloque la glándula salival de vuelta a su posición original. Cierre de la piel en la ubicación quirúrgica con una sutura interrumpida usando una sutura de poliglactina 6-0. </li><li> Consistentemente observar los signos vitales de ratón después de que se completa el procedimiento, hasta que se reanude la conciencia. Sacrificar los ratones receptores por dislocación y de los vasos de la cosecha injertos cervicales ya sea 24 horas o 3 semanas más tarde para su posterior análisis. </li></ol>

<ol>
	<li>Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Tissue-Engineered+Vascular+Grafts+for+Cardiac+Surgery:+Past,+Present,+and+Future.">Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).</li><li>Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+follow-up+of+patients+with+synthetic+right+heart+conduits.">Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits.</a> Circulation. 72, II77-II83 (1985).</li><li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+insight:+the+evolution+of+tissue-engineered+vascular+grafts-from+research+to+clinical+practice.">Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice.</a> Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).</li><li>Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+blood+vessel.">Tissue engineering of blood vessel.</a> J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).</li><li>Cearbhaill, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+mesenchymal+stem+cells+to+the+biomechanical+environment+of+the+endothelium+on+a+flexible+tubular+silicone+substrate.">Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate.</a> Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).</li><li>Gong, Z., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+(hMSCs).">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs).</a> FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).</li><li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+HSP47+augments+mouse+embryonic+stem+cell+smooth+muscle+differentiation+and+chemotaxis.">Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis.</a> PLoS One. 9 (1), e86118 (2014).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+CD34++progenitor+cells+by+combined+modulation+of+the+MEK/ERK+and+BMP4+signaling+pathways.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways.</a> Blood. 116, 5762-5772 (2010).</li><li>Samuel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functionally+competent+and+durable+engineered+blood+vessels+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).</li><li>Margariti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+fibroblasts+into+endothelial+cells+capacble+of+angiogenesis+and+reendothelialization+in+tissue-engineered+vessels.">Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).</li><li>Karamariti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+cells+differentiated+from+reprogrammed+embryonic+lung+fibroblasts+through+DKK3+signaling+are+potent+for+tissue+engineering+of+vascular+grafts.">Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts.</a> Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).</li><li>Udelsman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+operator-independent+method+for+seeding+tissue-engineered+vascular+grafts.">Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).</li><li>Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+human+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin-based+vascular+tissue+engineering+constructs.">Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs.</a> Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).</li><li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+control+vascular+stem/progenitor+cell+plasticity+through+tumor+necrosis+factor-&#945;-mediated+nuclear+factor-&#954;B+activation.">Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-&#945;-mediated nuclear factor-&#954;B activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).</li><li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirolimus+stimulates+vascular+stem/progenitor+cell+migration+and+differentiation+into+smooth+muscle+cells+via+epidermal+growth+factor+receptor/extracellular+signal-regulated+kinase/&#946;-catenin+signaling+pathway.">Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/&#946;-catenin signaling pathway.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).</li><li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+matrices:+State+of+the+art.">Three-dimensional cell culture matrices: State of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).</li><li>Hung, H. S., Hsu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Advances+of+stem+cell-based+approaches+to+tissue-engineering+vascular+grafts.">Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts.</a> OA Tissue Engineering. 1 (1), 2 (2013).</li><li>Quint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit.">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).</li><li>Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+antiplatelet+adhesion+layer+on+an+electrospun+scaffold+using+porcine+endothelial+progenitor+cells.">Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells.</a> J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).</li><li>Hibino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+use+of+an+induced+puripotent+stem+cell+sheet+for+the+construction+of+tissue-engineered+vascular+grafts.">Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+to+engineer+small-diameter+vascular+grafts+from+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).</li><li>Tsai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+stem+cells+to+neointimal+formation+of+decellularized+vessel+grafts+in+a+novel+mouse+model.">Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model.</a> Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).</li><li>Kasimir, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+decellularization+procedures+of+porcine+heart+valves.">Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves.</a> Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).</li><li>Stephenson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+propagation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+from+frozen+embryos+in+an+animal+product-free+environment.">Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment.</a> Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).</li><li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures.">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).</li><li>McCall, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+infarction+and+intramyocardial+injection+models+in+swine.">Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine.</a> Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).</li><li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+an+allogeneic+vein+bioengineered+with+autologous+stem+cells:+a+proof-of-concept+study.">Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study.</a> Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses financieros.

El protocolo actual indica un sonido, la estrategia rápido, simple, eficiente y reproducible en la que los vasos de ingeniería tisular funcionales se pueden generar utilizando PIPSC a partir de fibroblastos humanos. Esta técnica representa una herramienta valiosa para la medicina regenerativa, la ingeniería de tejidos y terapia celular específica del paciente potencialmente en el futuro cercano. Los pasos críticos para garantizar la eficacia del protocolo incluyen la preparación de PIPSC, preparación de injertos aórticos estériles y totalmente descelularizados, siembra exitosa y diferenciación de PIPSC en los andamios y el mantenimiento de la esterilidad de los injertos aórticos en el biorreactor vascular. Para iniciar la generación con éxito de los injertos de ingeniería tisular, es de suma importancia para asegurar que la preparación de PIPSC se lleva a cabo de manera efectiva. El protocolo ha exitosamente &#39;reprogramar&#39; una línea celular de fibroblastos humanos en PIPSC través nucleofection con un plásmido pCAG2LMKOSimO OSKM. El survival de los fibroblastos después de nucleofection se basa en varios puntos clave, tales como el uso de plásmidos OSKM de alta calidad, los plásmidos de concentraciones que oscilan entre 500 - 1000 ng / l, evitar retrasos en la siembra de los fibroblastos inmediatamente después de nucleofection como células son particularmente sensibles tras la introducción de relativamente grandes plásmidos y, finalmente, la adición de FGF-2, que es crucial y debe ser agregado en medios recién preparados justo antes de su uso. Además, se encontró que era crucial usar células de hasta el paso 9 para evitar la senescencia replicativa, para asegurar eficiente &#39;reprogramación&#39; en PIPSC y la posterior diferenciación en células endoteliales y de músculo liso. La pureza de PIPSC se puede mejorar mediante la selección de las células nucleofected con neomicina. El plásmido pCAG2LMKOSimO tiene un gen de resistencia a neomicina y por lo tanto la adición de neomicina en una gama de 25 mg / ml un día después de la nucleofection durante 3 días dará lugar a la selección de una población pura dePIPSC. Para diseñar un buque PIPSC eficiente para injertar en ratones, hemos considerado la integridad y la esterilidad de las aortas descelularizados sean de la más alta prioridad. Para mantener la integridad de las aortas antes y después descelularización, era necesario aplicar constantemente la destreza manual, mientras que el manejo de las embarcaciones, ya que eran relativamente frágil y diminuto considerablemente de tamaño. La eliminación eficaz del tejido perivascular y sellado de las arterias de ramificación utilizando un electro-coagulador bipolar era fundamental para garantizar la posterior siembra de células competentes y de evitar que los medios de comunicación. En cualquier punto, nos aseguramos de que todos los materiales y aparatos utilizados para generar el biorreactor (es decir, fórceps, tubos, botellas, cámaras, tijeras, adaptadores y conectores) eran esterilizable en autoclave, reduciendo así los riesgos de contaminación bacteriana y el fracaso de los injertos vasculares antes de la cirugía . Mientras que el protocolo actual tiene aplicaciones clínicas prometedoras en dise cardiovascularases, hay algunas limitaciones que deben ser mejorados en el futuro próximo para mejorar aún más la metodología. Hasta el momento, los factores de transcripción OSKM se introdujeron en fibroblastos humanos a través de nucleofection. Si bien esta técnica es relativamente simple y directo, que también dio lugar a eficiencias de transfección variables en diferentes momentos experimentales. En particular, esta inconsistencia puede ser superada mediante la introducción de una etapa adicional de la selección de neomicina antes mencionado. Del mismo modo, se podría considerar la introducción de los cuatro factores en fibroblastos humanos utilizando la integración lentivirus, que pueden potencialmente aumentar la eficiencia de &#39;reprogramación&#39; y mejorar la supervivencia de las células después de la infección. En términos del biorreactor, se encontró que descelularización completa de aortas se puede lograr usando 0,075% de SDS. Aunque esta técnica se consideró óptima para la eliminación de células en comparación con otros detergentes (por ejemplo, Triton X-100), puede sin embargo causar palteraciones otencial dentro de los ultra-estructuras de las proteínas de la matriz extracelular 23. Por tanto, este fenómeno amerita estrategias Descelularización más eficientes para minimizar la interrupción de las proteínas de la matriz extracelular asociados. Además, también consideramos que el diámetro y espesor de aortas descelularizados varían entre los ratones, dependiendo de su edad, la tensión y el fondo, y por lo tanto causan las posibles diferencias en la velocidad de flujo y la tensión de corte dentro de biorreactores y la distribución de PIPSC siguiente PIPSC siembra . Todo esto queda por aclarar. Este protocolo se describe aquí la generación de ingeniería tisular injertos funcionales utilizando PIPSC que mantienen un potencial prometedor para futuras aplicaciones clínicas en terapia con células madre para la enfermedad cardiovascular. Este proceso que utiliza la reprogramación directa de un linaje somáticas (fibroblastos) a otro (cualquiera de las células musculares lisas endoteliales o) saltando por pluripotencia puede ser una manera para obtener células seguras y adecuadas de interés. De hecho, varios protocolos se han publicado para describir la generación de líneas de células madre a partir de embriones humanos, células iPS y células madre adultas 24-26, todas las cuales sin embargo, todavía plantean sobre cuestiones con respecto a su uso en clínica. Ahora se sabe que PIPSC no desarrollan teratomas en ratones SCID, eliminando así la preocupación de la formación de tumores. Además, las células toman un tiempo significativamente más corto para generar, cultura y diferenciar 10,11, y se ha demostrado para generar exitosas y funcionales vasos de ingeniería tisular injertos que son comparables a aortas nativas. Por lo tanto, PIPSC presente como una fuente de células prometedora para el tratamiento de pacientes que utilizan la terapia de células personalizado porque fibroblastos (por ejemplo, de la piel) se pueden derivar de un individuo específico. El sistema de vasos decellularised en este protocolo ofrece un modelo más biomimético que proporciona células sembradas con una extracellulproteína de la matriz ar que es más representativo a la de una aorta nativa 11. Estos puntos clave son críticos para asegurar la supervivencia, la diferenciación y la funcionalidad de las células sembradas y los vasos de ingeniería tisular a partir de entonces. Estudio reciente de Sumitran-Holgersson y colegas demostraron una repoblación con éxito de un injerto de vena ilíaca previamente descelulariza de una persona fallecida antes de injerto 27, postulando así un valor de traslación de la actual protocolo en humanos en un futuro próximo. Por otra parte, los injertos de vasos descelularizados pueden representar un buen modelo en el que el papel y el comportamiento de otros tipos de células vasculares que también contribuyen a los injertos de ingeniería tisular se pueden evaluar. Este sistema modelo en ratones podría proporcionar una herramienta poderosa para la detección de drogas futuro y también en la elucidación de los mecanismos celulares y moleculares implicados en la biología de células madre vascular. En conjunto, el protocolo actual tiene un valor prometedor para su aplicación en Vascingeniería de tejidos ular y un gran avance en la medicina personalizada.

La construcción de conductos vasculares es una estrategia fundamental para la reparación quirúrgica de los vasos dañados y heridos resultantes de enfermedades cardiovasculares. Hasta la fecha, los materiales utilizados en la cirugía de injerto biocompatible incluyen polímeros sintéticos (politetrafluoroetileno [teflón], politetrafluoroetileno expandido [ePTFE; Gore-Tex] o tereftalato de polietileno [Dacron]), aloinjertos, tejido autólogo (pericardio o vena safena) y xenoinjertos 1. Mientras que los injertos artificiales (por ejemplo, Gore-Tex y Dacron) son los más utilizados, estos materiales probablemente causan numerosas complicaciones a corto y largo plazo que incluyen la estenosis, la deposición de calcio, trombo-embolia y las infecciones. Aunque los pacientes con injertos biológicos presentes con una disminución de eventos tromboembólicos, todavía se encuentran con limitaciones, como el fracaso del injerto secundaria y durabilidad acortada debido a la degradación de la calcificación 2. Por lo tanto, a pesar de las mejoras significativas en t quirúrgicaechniques largo de los años, los investigadores y los médicos todavía están cargados con la necesidad de identificar el conducto ideal para enfermedades vasculares. Más recientemente, el campo de la investigación de la ingeniería de tejido vascular ha generado un concepto en el que las células se incorporan en estructuras biodegradables, con el objetivo de crear un entorno biomimético que personifica un recipiente funcional para injerto realizado con éxito 1. Fundamentalmente, el éxito de las construcciones vasculares depende de tres componentes esenciales; las células que componen el andamio, es decir, una capa interna de células endoteliales y una capa de células del músculo liso, un andamio que contiene la matriz extracelular apropiado para proporcionar propiedades mecánicas comparables a la vasculatura nativa, y la señalización molecular / celular que se requiere para iniciar / regulador reparación. La permeabilidad del injerto a largo plazo y el desarrollo sostenido de los neo-tejidos son altamente dependientes de la siembra de células eficaz de andamios, THereby haciendo que la decisión del tipo de célula de importancia crítica. Varios informes demuestran el uso de endoteliales maduras y las células musculares lisas de diferentes fuentes para desarrollar conductos de pequeño diámetro de 3-6. Aunque prometedores, la falta de vasos autólogos suficiente para obtener endoteliales maduras y las células musculares lisas siguen siendo una carga considerable. Más recientemente, las células madre a partir de diversas fuentes han sido explotados para aplicaciones de ingeniería de tejidos vasculares. Células mononucleares de hecho, las células madre pluripotentes una variedad de tipos de células madre, incluyendo células madre embrionarias 7, inducida (CMPI) 8,9, PIPSC 10,11, derivadas de la médula ósea 12, células madre mesenquimales 13, las células progenitoras endoteliales y la pared del vaso adulto -derivado células madre antígeno-1 (Sca-1) + células madre / progenitoras 14,15 todos se han demostrado que son capaces de diferenciarse en células endoteliales ya sea funcional o de músculo liso en respuesta a los medios de comunicación definidos ycondiciones de cultivo. Además, la capacidad ilimitada de auto renovación de las células madre a tomar mejores candidatos a diferencia endoteliales maduras y las células musculares lisas que sólo se puede dividir por un número finito de veces antes de someterse a la detención del crecimiento y la senescencia. La selección del material de andamio para generar tejido éxito recipiente diseñado para el injerto depende de varios factores tales como la biocompatibilidad, propiedades biomecánicas, y la velocidad de biodegradación. Fundamentalmente, los materiales utilizados para crear andamios para los injertos deben ser biodegradables y no se montarán las respuestas inmunes receptores innecesario. Además, debe abarcar una porosidad adecuada y la microestructura para la fijación celular y la supervivencia posterior. Hasta la fecha, los materiales más comunes usados ​​para andamios en la ingeniería de tejidos vascular incluyen polímeros de ácido poliglicólico, ácido poliláctico, y poli ε-caprolactona 16. Más recientemente, los materiales biológicos descelularizados tienenTambién ha aplicado con cierto éxito. Varios laboratorios han demostrado que la siembra de los vasos porcina humana descelularizado, canino o con células autólogas proporciona un injerto biológico que resistió la coagulación y la hiperplasia intimal 17-19. Otras estrategias de ingeniería de tejidos vascular incluyen injertos vasculares extracelulares basado proteínas de matriz por ejemplo, células de siembra en gel de fibrina 13 y generando láminas de células sin el apoyo del andamio 20, 21. El protocolo actual demuestra la diferenciación de PIPSC humano en endotelial funcional y células musculares lisas, la generación de un biorreactor que consiste en un andamio recipiente descelularizado para albergar células vasculares derivadas de PIPSC funcionales, y el injerto de los vasos de ingeniería tisular en la inmunodeficiencia combinada severa (SCID ) ratones. PIPSC son un tipo de célula óptima a utilizar para la ingeniería de tejidos de injertos de vasos ya que estas células no forman tumores en ratones o plantean ético yallo respuestas inmunes. Por otra parte, hemos demostrado que la estrategia para la generación de células musculares Pipa-células endoteliales y Pipa-lisas es eficiente y reproducible 10,11. A partir de entonces, se diseñó un recipiente de descelularizado para la siembra de las células vasculares derivadas de PIPSC para imitar las proteínas de la matriz que existe dentro de un vaso nativo, mejorando así la supervivencia de injerto y la eficacia. Además, la descelularización de los vasos antes de la siembra PIPSC previene la aparición de las respuestas inflamatorias montadas por tipos de células inmunes, tales como macrófagos. Más importante aún, este protocolo no sólo representan una metodología para generar prometiendo conductos vasculares para la traducción a los seres humanos, sino que también proporciona medios valiosos para el estudio y la comprensión de los mecanismos moleculares que regulan la regeneración del tejido vascular a través de modelos de ratón.

<table><tbody><tr><td>Human Fibroblasts CCL-153</td><td>ATCC</td><td>CCL-153</td><td>Prenatal human embryonic fibroblasts</td></tr><tr><td>ATCC F-12K Medium (Kaighn&#039;s Modification of Ham&#039;s F-12 Medium)</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells</td><td>Life technologies (Gibco)</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Human Basic FGF-2&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-837</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM medium</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>32571093</td><td></td></tr><tr><td>Human PDGF</td><td>R&amp;amp;D System</td><td>120-HD-001</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin Solution 2%</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)</td><td>Addgene</td><td>20866</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;PvuI Restriction Enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>RO150S</td><td></td></tr><tr><td>SureClean Plus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>Nucelofection Kit (NHDF Kit)</td><td>LONZA</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>SIGMA</td><td>G418</td><td></td></tr><tr><td>KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy</td><td>SCHOTT</td><td>KL 1500 LCD</td><td>Cold light illumination for stereo microscopy</td></tr><tr><td>Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent</td><td>Severn Biotech</td><td>CAS 151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (10mg/ml)</td><td>BD</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7&amp;nbsp;</td><td>Jepson Bolton&#039;s, Janke&amp;amp;Kunkel</td><td>S32-102</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Pump Drive</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-15</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S large cartridges for pump head</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-75</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft</td><td>Cole-Parmer&amp;nbsp;</td><td>WZ-96410-14</td><td>Tubing goes through the peristaltic pump</td></tr><tr><td>0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing</td><td>SILEX</td><td>N/A</td><td>Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td>Adapter connect above two types of tubings</td></tr><tr><td>1/32&quot; Tubing, ID 0.01&quot; (250&amp;micro;m) Material: PEEK</td><td>LabSmith</td><td>T-132-010P</td><td>Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing</td></tr><tr><td>One-Piece Fittings&amp;nbsp;</td><td>LabSmith</td><td>T-132-100</td><td>Fix the above tubings through the incubation chamber wall</td></tr><tr><td>Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm)&amp;nbsp;</td><td>Smiths Medical</td><td>N/A</td><td>Tubings insert into two ends of the aorta graft</td></tr><tr><td>NOD.CB17-Prkdc&lt;sup&gt;scid&lt;/sup&gt;/NcrCrl mouse</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical sutures, 8-0&amp;nbsp; silk</td><td>ETHICON</td><td>W819</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>Vetapharm</td><td>Vm21757/4000</td><td>Neuroleptanalgesic for use in mice</td></tr><tr><td>Hypnovel (Midazolam)</td><td>Roche</td><td>59467-70-8</td><td>Induction of anaesthesia</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Tubing</td><td>Portex LTD</td><td>800/200/100/200</td><td>0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff</td></tr><tr><td>Electrocoagulator</td><td>Martin&amp;nbsp;</td><td>SN 54.131</td><td>Ligation of artery branches on aorta</td></tr><tr><td>Bipolar micro hemostat forceps</td><td>Martin</td><td>80-91-12-04</td><td>Fixation of vessel ends</td></tr><tr><td>Vessel Dilator</td><td>S&amp;amp;T</td><td>JFX-7</td><td></td></tr><tr><td>Vessel Dilator</td><td>S&amp;amp;T</td><td>JFL-3dZ</td><td></td></tr><tr><td>Vessel Dilator</td><td>S&amp;amp;T</td><td>D-5aZ</td><td></td></tr><tr><td>Mini applier&amp;nbsp;</td><td>AESCULAP</td><td>FE572K</td><td></td></tr><tr><td>Micro hemostats clips</td><td>AESCULAP</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>Surgical sutures, 6-0 VICRYL</td><td>ETHICON</td><td>V489</td><td></td></tr></tbody></table>

generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

La generación exitosa de PIPSC fue confirmado 4 días después nucleofecting fibroblastos humanos con un plásmido linealizado pCAG2LMKOSimO llevar 4 factores de transcripción, Oct4, SOX2, KLF4 y c-myc (OSKM). PIPSC muestra un fenotipo notablemente distinta en comparación con fibroblastos (Figura 2A) y expresó los 4 factores de reprogramación en el mRNA (Figura 2B) y los niveles de proteína (Figura 2C) 10. La eficacia de un injerto vascular a base de PIPSC es altamente dependiente de la capacidad de la PIPSC de diferenciarse en ambos linajes endoteliales y de músculo liso. Por tanto, es crítico para confirmar estas propiedades de PIPSC in vitro mediante la diferenciación de las células en medios definidos antes de utilizar para generar injertos de vasos. La Figura 3 muestra la capacidad de PIPSC para diferenciarse en células endoteliales funcionales tanto en gen (Figura 3A) y la proteína ( Figura 3B-D) levels, basado en marcadores endoteliales específica 10. Del mismo modo, PIPSC también son capaces de diferenciarse en el linaje del músculo liso en respuesta a los medios de comunicación específico (Figura 3E-H) 11. Descelularización aorta completa se logra mediante el tratamiento con SDS, un detergente aniónico que lisa las células y solubiliza componentes citoplasmáticos. Después de 2 h de tratamiento, la aorta descelularizado apareció como un andamio acelular translúcida en comparación con una aorta recién cosechado (Figura 4A-B) 22. La evaluación histológica en la Figura 4C-F ilustra la ausencia de núcleos o tinción citoplásmica en los vasos descelularizados, pero no en la aorta de ratón normal. Después de la siembra de doble endotelial derivado de PIPSC y células de músculo liso dentro de aortas descelularizados, los injertos vasculares de ingeniería muestran propiedades de células endoteliales y de músculo liso, respectivamente. Hematoxilina y eosina (HE) tinción de la doble-sinjertos ecesarios revelaron una arquitectura similar a la de los vasos nativos (Figura 4G) con múltiples capas de células musculares lisas y una monocapa de células endoteliales según lo confirmado por tinción positiva para músculo liso-22α (SM22), actina músculo liso-α (SMA) , CD31 y CD144 marcadores respectivamente (Figura 4H-M) 11. Para confirmar la permeabilidad de los vasos de tejido de ingeniería in vivo, los cabezas de serie buques de doble derivados de PIPSC fueron injertados en ratones - tanto de ratón normal y las arterias descelularizados se utilizaron como controles. El análisis posterior mostró que mientras que los ratones injertados con vasos descelularizados presentados con las tasas de mortalidad notablemente superiores ya en el día 1, injertos de vasos PIPSC confieren una tasa de supervivencia del 60% 3 semanas después del trasplante (Figura 5) 11. Adicionalmente, 3 semanas de edad injertos derivados de PIPSC estaban completamente caracterizan por la presencia de endotelial derivado de PIPSC humana y<html> células musculares lisas y la infiltración de macrófagos host (Figura 5B y Tabla 1) 11. Tomados en conjunto, los resultados indican que PIPSC tienen la capacidad de diferenciarse en ambos linajes vascular y son potentes para la generación de vasos de ingeniería tisular funcionales que puedan sustituir los vasos nativos in vivo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52565/52565fig1.jpg" /> Figura 1. Representación esquemática del circuito de flujo de biorreactor de injerto descelularizado. El injerto de vaso descelularizado se monta en la cámara de incubación. Una bomba peristáltica está en la aguas arriba de la cámara de incubación para proporcionar un flujo de perfusión del medio estable. El depósito de medio está en la corriente abajo de la cámara de incubación. La cámara de cumplimiento es mejorar el régimen de flujo. La dirección del flujo se indica mediante flechas.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52565/52565fig2.jpg" /> Figura 2. Generación de PIPSC a partir de fibroblastos humanos. Fibroblastos humanos fueron nucleofected ya sea con cuatro genes de reprogramación (Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc) o un vector vacío (control). (A) Fase de contraste imágenes muestran la morfología de pips después de 4 días. PIPSC expresó los cuatro factores de transcripción, tanto en los niveles de proteína (C) mRNA (B) y. La barra de escala para las imágenes que se muestran son de 50 micras y los datos son medias ± SEM (n = 3); * P &lt;0,05, *** p &lt;0,001. Esta cifra ha sido modificado desde Margariti, A. et al. 10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52565/52565fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. &lt;</a>/ A&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52565/52565fig3.jpg" /> Figura 3. PIPSC puede diferenciarse en ambas células endoteliales y de músculo liso. PIPSC células o de control se diferenciaron en células endoteliales. (A) En comparación con las células control, PIPSC deriva-células endoteliales expresó marcadores endoteliales específicos tales como CD31, CD144, receptor de dominio de inserción de quinasa (KDR), la sintasa de óxido nítrico endotelial (eNOS) y el factor de von Willebrand (vWF) en el ARNm nivel. (B) Esto fue confirmado a nivel de proteínas mediante Western blot. (C) La tinción de inmunofluorescencia indica la tinción positiva de CD144 (VE-cadherina) en PIPSC-endotelial, pero no las células control. (D) Análisis de citometría de flujo confirmó la expresión de células PIPSC-endotelial de CD31 y CD144. El colágeno IV de semilla PIPSC (o de control de las células) también se diferenciaron encélulas musculares lisas. (E, F) A diferencia de las células de control, las células musculares lisas derivadas de PIPSC expresan marcadores específicos de músculo liso a nivel de genes, incluyendo SMA, calponin, SM22, músculo liso miosina de cadena pesada II (SMMHC), el factor de respuesta a suero (SRF) , myocardin, smoothelin, la elastina y el colágeno 1A1. (G) Los niveles de expresión de SMA, calponin y SM22 en las células derivadas de PIPSC se confirmaron mediante análisis de transferencia Western. (H) La tinción de inmunofluorescencia usando microscopía confocal mostró una tinción marcador de músculo liso típico para calponin y SM22. Los datos representan la media ± SEM (n = 3); * P &lt;0,05, ** P &lt;0,01, *** p &lt;0,001. La barra de escala para las imágenes que se muestran son de 25 micras o 50 micras. Estas cifras se han modificado desde Margariti, A. et al. 10 y Karamariti, E. et al. 11 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52565/52565fig3large.jpg" target="_blank">Por favor,</a>haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52565/52565fig4.jpg" /> Figura 4. Generación de doble cabeza de serie de tejidos derivados de PIPSC ingeniería injertos vasculares. (A, B) descelularización de ratón aorta torácica conserva su estructura y todavía se parecía a la de un vaso normal, aumento original 2X. Tinción (CF) HE de aorta descelularizado confirmó descelularización éxito y retirar todas las células en comparación con los controles, aumento original: 50X o 200X. Tinción (G) de HE endotelial derivado de PIPSC y las células musculares lisas buques de doble cabeza de serie reveló una arquitectura que era similar a un vaso nativo. (J, M) de ingeniería tisular buques de doble cabeza de serie PIPSC teñidas positivo para endotelial (CD31 y CD144) y células de músculo liso (SMA) y SM22 marcadores a diferencia de deceinjertos de vasos llularized. (H, K) La expresión concomitante de marcadores vasculares, así como la morfología característica y localización de endotelial derivado de PIPSC y células de músculo liso dentro de las áreas medial y la íntima era comparable a los vasos nativos. La barra de escala para las imágenes que se muestran son de 50 micras. Estas cifras se han modificado de Tsai, T. et al., 22 y Karamariti, E. et al. 11 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52565/52565fig4large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52565/52565fig5.jpg" /> Figura 5. ingeniería tisular doble semillas injertos vasculares derivados de PIPSC son patentes para la sustitución de los vasos nativos in vivo. Vasos derivados de PIPSC se injertaron en la arteria carótida de inmunodeficiencia combinada severa (SCID), mou ​​normalesSE y arterias descelularizados se utilizaron como controles. (A) Análisis de los ratones injertados con vasos derivados de PIPSC mostró que el 60% de supervivencia 3 semanas después de la cirugía, mientras que los ratones injertados con vasos descelularizados presentados con marcadamente mayores tasas de mortalidad y menor supervivencia (20%). Los datos representan las medias (n = 10). (B) Los vasos de ingeniería tisular también se cosecharon 3 semanas después del injerto y se sometió a HE (paneles izquierdos) o la tinción de inmunofluorescencia (paneles derechos) para la presencia de CD144 humano y calponin o el ratón CD11b / CD18 (Mac-1); cuantificación de la tinción se resume en la Tabla 1. Aumento original para las imágenes que se muestran son 400X menos que se indique. Esta cifra ha sido modificado desde Karamariti, E. et al. 11 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52565/52565fig5large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody&gt; <tr><td> Las células positivas Field (40X) </td><td> -Recipiente de ingeniería antes del injerto </td><td> Injerto recipiente de ingeniería (3 semanas) </td></tr><tr><td> calponin </td><td> 72 ± 9 </td><td> 22 ± 11 * </td></tr><tr><td> CD144 </td><td> 20 ± 8 </td><td> 5 ± 6 * </td></tr><tr><td> Mac-1 </td><td> 0 </td><td> 71 ± 11 * </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Caracterización de los vasos de la ingeniería tisular 3 semanas después del injerto. El número de endoteliales derivadas de PIPSC y células musculares lisas y macrófagos de acogida se cuantificó después de la tinción de inmunofluorescencia con calponin humana, CD144 humano y el ratón Mac-1, respectivamente. Los datos representan la media ± SEM (n = 6); * P &lt;0,05, una diferencia significativa de los vasos de la ingeniería tisular antes del injerto. Esta tabla ha sido modificado desde Karamariti, E. et al. 11

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model at JoVE.com

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

A continuación, presentamos un protocolo para generar ingeniería tisular injertos de vasos que son funcionales para el injerto en ratones por doble siembra de células madre pluripotentes inducidas parcialmente (PIPSC) - deriva células musculares lisas y PIPSC - células endoteliales derivadas de un biorreactor andamio buque descelularizado.

Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

generation-and-grafting-of-tissue-engineered-vessels-in-a-mouse-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.0K vistas.  King's College London BHF Centre.  A continuación, presentamos un protocolo para generar ingeniería tisular injertos de vasos que son funcionales para el injerto en ratones por doble siembra de células madre pluripotentes inducidas parcialmente (PIPSC) - deriva células musculares lisas y PIPSC - células endoteliales derivadas de un biorreactor andamio buque descelularizado. 

Video: Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

La ingeniería biológica basada en los injertos vasculares El uso de un biorreactor pulsátil

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Investigación

Bioingeniería

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

El trasplante ortotópico aórtica en los ratones para el Estudio de la Enfermedad Vascular

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Medicina

Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

Graft arteriosclerois (GA), also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over months to years in transplanted organs characterized by diffuse, circumferential stenosis of the entire graft vascular tree. The most critical component of GA pathogenesis is the proliferation of smooth muscle-like cells within the intima. When a human coronary artery segment is interposed into the infra-renal aortae of immunodeficient mice, the intimas could be expand in response to adoptively transferred human T cells allogeneic to the artery donor or exogenous human IFN-&gamma; in the absence of human T cells. Interposition of a mouse aorta from one strain into another mouse strain recipient is limited as a model for chronic rejection in humans because the acute cell-mediated rejection response in this mouse model completely eliminates all donor-derived vascular cells from the graft within two-three weeks. We have recently developed two new mouse models to circumvent these problems. The first model involves interposition of a vessel segment from a male mouse into a female recipient of the same inbred strain (C57BL/6J). Graft rejection in this case is directed only against minor histocompatibility antigens encoded by the Y chromosome (present in the male but not the female) and the rejection response that ensues is sufficiently indolent to preserve donor-derived smooth muscle cells for several weeks. The second model involves interposing an artery segment from a wild type C57BL/6J mouse donor into a host mouse of the same strain and gender that lacks the receptor for IFN-&gamma; followed by administration of mouse IFN-&gamma; (delivered via infection of the mouse liver with an adenoviral vector. There is no rejection in this case as both donor and recipient mice are of the same strain and gender but donor smooth muscle cells proliferate in response to the cytokine while host-derived cells, lacking receptor for this cytokine, are unresponsive. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, both models can be used to assess the effect of specific genes on GA progression. Here, we describe detailed protocols for our mouse GA models.

We describe protocols for our mouse graft arteriosclerois (GA) models which involve interposition of a mouse vessel segment into a recipient of the same inbred strain. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, the model can assess the effect of specific genes on GA.

Modelos de ratón para Arteriosclerosis Graft

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Técnica quirúrgica para la implantación de la ingeniería tisular injertos vasculares y posterior<em&gt; En Vivo</em&gt; Monitoreo

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

Diseñado vascularizado colgajo de músculo

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

Implantación de la vena cava inferior interposición del injerto en modelo de ratón

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

El escalado de Engineered injertos vasculares Usando 3D Impreso guías y el método de anillo de apilamiento

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

Un microquirúrgica Modelo Novela de heterotópico, en bloque, pared torácica, el timo y el trasplante cardiaco en ratones

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional tissue. Tissue engineering holds great promise as a potential solution with its ability to integrate cells and signaling molecules into a 3-dimensional scaffold. Recent work with tissue engineered tracheal grafts (TETGs) has seen some success but their translation has been limited by graft stenosis, graft collapse, and delayed epithelialization. In order to investigate the mechanisms driving these issues, we have developed a mouse model for tissue engineered tracheal graft implantation. TETGs were constructed using electrospun polymers polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU) in a mixture of PET and PU (20:80 percent weight). Scaffolds were then seeded using bone marrow mononuclear cells isolated from 6-8 week-old C57BL/6 mice by gradient centrifugation. Ten million cells per graft were seeded onto the lumen of the scaffold and allowed to incubate overnight before implantation between the third and seventh tracheal rings. These grafts were able to recapitulate the findings of stenosis and delayed epithelialization as demonstrated by histological analysis and lack of Keratin 5 and Keratin 14 basal epithelial cells on immunofluorescence. This model will serve as a tool for investigating cellular and molecular mechanisms involved in host remodeling.

Graft stenosis poses a critical obstacle in tissue engineered airway replacement. To investigate cellular mechanisms underlying stenosis, we utilize a murine model of tissue engineered tracheal replacement with seeded bone marrow mononuclear cells (BM-MNC). Here, we detail our protocol, including scaffold manufacturing, BM-MNC isolation, graft seeding, and implantation.

Siembra e implantación de un injerto traqueal tejido-dirigida biosintético en un modelo murino

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Implantation of Tissue-Engineered Vascular Graft in Mouse Carotid Artery via Cuff Technique

The development of small-diameter vascular grafts has been a global endeavor, with numerous research groups contributing to this field. Animal experimentation plays a pivotal role in assessing the efficacy and safety of vascular grafts, particularly in the absence of clinical applications. Compared to alternative animal models, the mouse implantation model offers several advantages, including a well-defined genetic background, a mature method for disease model construction, and a straightforward surgical procedure. Based on these advantages, the present study devised a simple cuff technique for the implantation of tissue-engineered vascular grafts in the mouse carotid artery. This technique began with the fabrication of polycaprolactone (PCL) small-diameter vascular grafts via electrostatic spinning, followed by the seeding of macrophages onto the grafts through perfusion adsorption. Subsequently,&#160;the cellularized tissue-engineered vascular grafts were transplanted into the mouse carotid artery using the cuff technique to evaluate patency and regenerative capability. After 30 days of in vivo implantation, vascular patency was found to be satisfactory, with evidence of neo-tissue regeneration and the formation of an endothelial layer within the lumen of the grafts. All data were analyzed using statistical and graphing software. This study successfully established a mouse carotid artery implantation model that can be used to explore the cellular sources of vascular regeneration and the mechanisms of action of active substances. Furthermore, it provides theoretical support for the development of novel small-diameter vascular grafts.

Here, a protocol is presented for the implantation of a tissue-engineered vascular graft into the mouse carotid artery using the cuff technique, providing a suitable animal model for investigating vascular tissue regeneration mechanisms.

Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón

Resumen

Explorar más videos