CQS receives a fellowship from the LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research (IPF). The author would like to thank Ida J. van der Klei for the P. chrysogenum strains used in this work and Andreas S. Reichert for the gift of rapamycin.

1. הכנת P. chrysogenum לניסויי הרעב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם P. זן chrysogenum עניין נשמר על אורז (&quot;אורז ירוק&quot;), מקום 2-3 גרגרי אורז מכוסים המתנבג תפטיר לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge. מלא אותו בYGG 500 μl (10 גר &#39;/ ליטר KCl, 20 גר&#39; / גלוקוז l, 10 גר &#39;/ בסיס חנקן שמרי l, 5 גר&#39; / ליטר K 2 HPO תמצית שמרי 4, 20 גר &#39;/ ליטר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הצינור למשך 30 שניות כדי שנבגים יכולים להתנתק מהאורז ביעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצינור ליום 1 בטמפרטורת חדר (למשל, בין 20 ל 25 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול 1/50 של השעיה נבג זה במים ברז סטרילי, ומערבב היטב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם P. זן chrysogenum עניין נשמר על צלחת אגר (למשל, צלחת אגר YGG), להעביר חתיכות קטנות של התפטיר לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge המכיל 400 μl מים ברז סטרילי וכ GL 100 מ&quot;גחרוזים התחת באמצעות איסוף שן סטרילי או פיפטה קצה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הצינור למשך 2 דקות, כך שהתפטיר הופך מקוטעת. השתמש בתוכן של הצינור באופן מיידי. </li></ol></li></ol> 2. שלבי הכנה לטיפוח P. chrysogenum על רפידות רעב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על צלחת חימום ולהגדיר אותו כ 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר 2 גרם של agarose ב100 מ&quot;ל מי ברז על ידי בישול הפתרון במיקרוגל. תשמור על עצמך כי פתרון זה הוא ברור לחלוטין לאחר חימום. אם זה לא, לבשל אותו שוב עד agarose הוא נמס לגמרי. תן פתרון agarose להתקרר כ 60 ° C לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge (2-4, תלוי במספר דגימות) במים ברז 400 μl סטרילי כל אחת (לא תרכובות נוספות הוסיפו) או 400 x μl (תוספת של x μl של פתרון מתחם בשלב 2.5) ולמקם אותם לצלחת חימום דקות לפחות 1, כך שהוואטאה בתוך מתחמם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות מיקרוסקופ המכילות חלל מרכזי לצלחת חימום דקות לפחות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 400 μl 2% agarose לפתרון בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge ובקצרה מערבולת. לאחר שלב זה אם תרצה בכך, להוסיף תרכובות נוספות (כלומר, rapamycin 1 מיקרומטר). אם זה נעשה, מערבולת בקצרה לאחר כל חומר נוסף הוא pipetted לצינור. שים את הצינורות בחזרה על שולחן החימום כדי למנוע התמצקות מוקדמת. הערה: הנפח הכולל של צינור microcentrifuge צריך להיות 800 μl. </li></ol> 3. הכנת שקופיות מיקרוסקופ המכילה רפידות רעב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 140 μl פיפטה של ​​פתרון agarose לתוך החלל של שקופיות מיקרוסקופ (שעדיין נמצא על צלחת החימום). נסה להימנע מבועות במידת האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד במקום להחליק כיסוי על פתרון agarose. הערה: זה יגרום משטח שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים מיקרושקופית היקף על ספסל המעבדה לכ -4 דקות, כדי לאפשר את כרית agarose כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את coverslip מפנקס agarose ידי הזזה אותו בעזרת אצבע אגודל או מדד (ללבוש כפפות, כדי למנוע זיהום!). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקופית מיקרוסקופ עם הכרית לחדר רטוב כדי למנוע התייבשות. המלצה: השתמש בתיבת קצה ריקה שעדיין יש להכניס להחזקת הטיפים פיפטה. מוסיף מים סטריליים לתיבה, כך שהחלק התחתון מכוסה. מניחים את שקופיות מיקרוסקופ על ההוספה ולסגור את התיבה. </li></ol> 4. ייחס רפידות הרעב עם פ chrysogenum ודגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 μl פיפטה של ​​דילול 1/50 הנבג (אם התרבויות גדלו על אורז) או 5 μl של הפתרון חי מכיל שברי תפטיר (אם התרבויות גדלו על צלחת אגר) על מרכז כרית הרעב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את התא הרטוב ולעטוף אותו בשקית ניילון (זה משמש כהגנה נוספת מפני התייבשות של רפידות הרעב). היזהר שלא להזיז את הקופסה יותר מדי כי אחר טיפות החיסון יהיו מוטרדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את התיבה העטופה בRT לפחות 20 שעות לפני ניתוח הדגימות. </li></ol> 5. ניתוח מיקרוסקופי של הדגימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 20 שעות של דגירה הדגימות מוכנות לניתוח מיקרוסקופי; לשים שקופית מיקרוסקופ על נייר טישו יבש (התחתון נוטה להיות רטוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה נפח קטן של מים (בערך 50 μl) על כרית הרעב. שים coverslip על הכרית ולסחוט את מים עודפים. הסר את עודפי מים עם נייר טישו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את שקופיות מיקרוסקופ על שולחן ההתבוננות במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לקבל סקירה כללית של צמיחת תפטיר, להשתמש אובייקטיבי 20X. מטרות השימוש 63X או 100X ללימוד הלוקליזציה של ה- GFP בעובש. על מנת למנוע התייבשות הדרגתית של המדגם לא לנתח דגימות ליותר מ -15 דקות לפני שמכניס אותם בחזרה לתוך החדר הרטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 5.3 במרווחי זמן קבועים (לדוגמא, לאחר 40 שעות ו -60 שעות של צמיחה). הערה: המדגם ניתן להחזיר לתא הרטוב. אין צורך להסיר את coverslip כפי שהוא אינו משפיע על צמיחת תפטיר. </li></ol>

<ol>
	<li>Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control:+an+integrated+network+of+pathways.">Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).</li><li>Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+filamentous+fungi.">Autophagy in filamentous fungi.</a> Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).</li><li>Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podospora+anserina:+a+model+organism+to+study+mechanisms+of+healthy+ageing.">Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing.</a> Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).</li><li>Pinan-Lucarr&#233;, B., Iraqui, I., Clav&#233;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podospora+anserina+target+of+rapamycin.">Podospora anserina target of rapamycin.</a> Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).</li><li>Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+ATG8+homologue+Aoatg8+and+role+of+autophagy+in+differentiation+and+germination+in+Aspergillus+oryzae.">Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae.</a> Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).</li><li>Pinan-Lucarr&#233;, B., Balguerie, A., Clav&#233;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+cell+death+in+Podospora+autophagy+mutants.">Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants.</a> Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).</li><li>Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+fungal+cell+death+is+necessary+for+infection+by+the+rice+blast+fungus.">Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus.</a> Science. 312 (5773), 580-583 (2006).</li><li>Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+deficiency+promotes+beta-lactam+production+in+Penicillium+chrysogenum.">Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).</li><li>Meijer, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomes+are+required+for+efficient+penicillin+biosynthesis+in+Penicillium+chrysogenum.">Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).</li><li>Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding,+improving+and+using+green+fluorescent+proteins.">Understanding, improving and using green fluorescent proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).</li><li>Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+regulation+of+autophagy.">mTOR regulation of autophagy.</a> FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).</li><li>Hickey, P. C., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+living+cells+of+Aspergillus+in+vitro.">Imaging living cells of Aspergillus in vitro.</a> Med. Mycol. 47, S110-S119 (2009).</li></ol>

The author has nothing to disclose.

השיטה המוצגת כאן מאפשרת מחקר והנוח לשחזור של autophagy בפ chrysogenum. לדוגמא, ניתן להשתמש בו לסינון היעילות של תרכובות שונות אם הם מסוגלים ויסות תגובת autophagy של פטרייה זו או לא. התוצאות עם rapamycin להוכיח כי עיכוב של איתות TOR מוביל לאינדוקציה בולטת של autophagy בפ chrysogenum שגם הו?...

פטריות פילמנטיות הן מערכות מודל מצוינות לחקר תהליכים התפתחותיים. הם מציעים מספר יתרונות ניסיוניים כמו טיפוח זול, מספרים גבוהים של צאצאים ונגישות גנטית. הנקודה האחרונה היא רלוונטית במיוחד לבניית transformants המאפשרים לחקור את החשיבות של גנים, עד כה, uncharacterized למנגנונים תאיים שונים. פטריות פילמנטיות כבר סייעו להבהרה של מספר גורמים ומנגנונים של מסלולי בקרת איכות סלולריות כמו פעילות פרוטאז לפירוק של חלבונים חריגים, דינמיקה של המיטוכונדריה לשמירה על השלמות וautophagy המיטוכונדריה להסרת עודפים ו / או רכיבי תא מתפקדים ולשמירה כדאיות תא בזמנים של 1,2,3 רעב. ישנן מספר שיטות ניסיוניות זמינות ללימוד autophagy בפילמנטיות פטריות 2: חקירה (i) של vacuoles if הם מכילים גופי autophagic צפופים כאשר פרוטאזות מעוכבת על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים 4, (ii) להדמיה של autophagosomes על ידי ניטור מוקדי GFP-Atg8 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 5,6 וכן (iii) זיהוי של מבני autophagosomal acidified באמצעות קדברין monodansyl צבע פלואורסצנטי 7. כאן, שיטה חדשה של גובר chrysogenum Penicillium ללימודי autophagy מוצגת. האלמנט העיקרי הוא &#39;פנקס הרעב&#39;, שפשוט מורכב של 1% מומסים agarose במים ברז מעוקר. תרכובות נוספות (למשל, לחצים, אוכלי נבלות, מאפנני autophagy) ניתן להוסיף לפנקס כל עוד הם לא להציג אוטומטי הקרינה. הכרית ממוקמת בשקופיות מיקרוסקופ המכילות חלל מרכזי רדוד. פנקס זה במחוסן או עם השעיה נבג או עם שברי תפטיר קטנים. האחרון הוא מומלץ אם המתח של עניין אינו sporulatדואר יעילות (למשל, זני atg1 Δ 8). השקופיות ממוקמות בתאים רטובים (ניתן לבנות האלה בקלות על ידי שימוש בתיבות קצה פיפטה ריקות) כדי למנוע התייבשות של המדגם וטופחו בטמפרטורת חדר. P. chrysogenum הוא מסוגל לגדול לכמה ימים בתנאים אלה. Autophagy ניתן לצפות מיקרוסקופי על ידי הגדלת vacuolar אשר מהווה סמן חיובי לפטריית autophagy. בתרומה זו, P. זן chrysogenum (Wisconsin 54-1255) משמש המהווה חלבון פלואורסצנטי ירוק כי הוא ממוקד לperoxisomes על ידי הרצף &#39;SKL&#39; C-המסוף שלה 9. לכן ניתן לעקוב אחר השפלה של peroxisomes. זה אפשרי לתייג גם תאים אחרים של התא (לדוגמא, מיטוכונדריה) באמצעות אותות לוקליזציה מתאימים ולנתח שפלתם. למרות נתונים מפ chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) מוצג כאן, זה בהחלט אפשרילהשתמש בשיטת &#39;פנקס רעב &quot;גם לפטריות פילמנטיות אחרות (למשל, crassa Neurospora, macrospora Sordaria, מיני Aspergillus, וכו&#39;).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Microscope slides with central cavity</td>
			<td style="width:71px;">Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:119px;">H884.1</td>
			<td>These can be used multiple times after cleaning.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Glass beads</td>
			<td style="width:71px;">Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:119px;">A553.1</td>
			<td>Diameter: 0.25 - 0.50 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of autophagy in penicillium chrysogenum by using starvation pads in combination with fluorescence microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

כדי להדגים את התועלת של הפרוטוקול המפורט לעיל השפלה peroxisome בפ זן chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) נותח. בזן זה GFP-SKL בדרך כלל מיובא לperoxisomes 9. התוצאה היא ההופעה של צורות כדוריות מרובות כאשר המדגם מנותח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אם autophagy מתרחש, vacuoles להגדיל. GFP-SKL הופך ?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

ניתוח של Autophagy ב<em&gt; Chrysogenum Penicillium</em&gt; על ידי שימוש ברפידות רעב בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

analysis-autophagy-penicillium-chrysogenum-using-starvation-pads

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

8.5K Views.  Senckenberg Research Institute. A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Video: Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Electrofusion Cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

הפעלת Autophagy ידי פעילות גופנית אירובית בעכברים

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...