CQS receives a fellowship from the LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research (IPF). The author would like to thank Ida J. van der Klei for the P. chrysogenum strains used in this work and Andreas S. Reichert for the gift of rapamycin.

1. Preparación de P. chrysogenum para los experimentos de hambre <ol><li> Si el P. chrysogenum cepa de interés se mantiene en el arroz (&#39;arroz verde&#39;), coloque 2-3 granos de arroz cubiertas con esporulación micelio en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Rellenar con 500 l YGG (10 g / l KCl, 20 g / l de glucosa, 10 g / l de base nitrogenada de levadura, 5 g / l K 2 HPO 4, 20 g / l de extracto de levadura). <ol><li> Vortex el tubo durante 30 segundos de modo que las esporas pueden desprenderse del arroz de manera eficiente. </li><li> Incubar el tubo durante 1 día a temperatura ambiente (por ejemplo, entre 20 y 25 ° C). </li><li> Preparar una dilución 1/50 de esta suspensión de esporas en el agua del grifo estéril, mezclar bien. </li></ol></li><li> Si el P. chrysogenum cepa de interés se mantiene en una placa de agar (por ejemplo, la placa de agar YGG), transferir pequeños trozos de micelio en un tubo de 1.5 ml contiene 400 l de agua corriente estéril y aproximadamente 100 mg glperlas culo utilizando un palillo estéril o punta de la pipeta. <ol><li> Vortex el tubo durante 2 min para que el micelio se fragmenta. Utilice el contenido del tubo inmediatamente. </li></ol></li></ol> 2. Pasos preparatorios para el cultivo de P. chrysogenum en Pads de hambre <ol><li> Encienda una placa calefactora y ponerlo a aproximadamente 60 ° C. </li><li> Disolver 2 g de agarosa en 100 ml de agua del grifo por la cocción de la solución en un horno de microondas. Tenga cuidado de que esta solución es del todo claro después del calentamiento. Si no lo es, cocinar de nuevo hasta que la agarosa se disuelve completamente. Deje que la solución de agarosa se enfríe a aproximadamente 60 ° C antes de su uso. </li><li> Llenar 1,5 ml tubos de microcentrífuga (2-4, dependiendo del número de muestras) con 400 l de agua corriente estéril cada uno (no hay compuestos adicionales añadidos) o 400-x l (adición de x l de solución de compuesto en el paso 2.5) y colocarlos sobre la placa de calentamiento durante al menos 1 min de manera que el water el interior se calienta. </li><li> Colocar los portaobjetos de microscopio que contienen una cavidad central en la placa de calentamiento durante al menos 1 min. </li><li> Añadir 400 l 2% de agarosa a la solución en los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y vortex brevemente. Después de este paso, si se desea, añadir compuestos adicionales (es decir, de rapamicina 1 mM). Si esto se hace, vórtice brevemente después de cada sustancia adicional se pipetea al tubo. Ponga los tubos de nuevo sobre la mesa la calefacción para evitar la solidificación prematura. NOTA: El volumen total en el tubo de microcentrífuga debe ser de 800 l. </li></ol> 3. Preparación de preparaciones microscópicas contiene electrodos de inanición <ol><li> Pipeta 140 l de la solución de agarosa en la cavidad del portaobjetos de microscopio (que aún se encuentran en la placa de calentamiento). Trate de evitar hacer burbujas si es posible. </li><li> Inmediatamente coloque una hoja de cubierta en la solución de agarosa. NOTA: Esto resultará en una superficie plana. </li><li> Ponga el microdiapositiva alcance sobre la mesa de laboratorio durante unos 4 minutos para permitir que la almohadilla de agarosa se solidifique. </li><li> Retire con cuidado el cubreobjetos de la almohadilla de agarosa deslizándolo con la ayuda de un pulgar o el dedo índice (usar guantes para evitar la contaminación!). </li><li> Colocar el portaobjetos con la almohadilla en una cámara húmeda para evitar la desecación. Recomendación: Utilice una caja de propina vacío que todavía tiene el inserto para la celebración de las puntas de pipeta. Añadir agua estéril a la caja de modo que el fondo está cubierto. Colocar los portaobjetos de microscopio en el inserto y cerrar el cuadro. </li></ol> 4. Inocular los Pads de hambre con P. chrysogenum e Incubación <ol><li> Pipeta 5 l de la dilución 1/50 de esporas (si los cultivos se hicieron crecer en el arroz) o 5 l de la solución no diluida que contiene fragmentos de micelio (si los cultivos se cultivaron en una placa de agar) en el centro de la almohadilla inanición. </li><li> Cerrar la cámara húmeda y envolverlo en una bolsa de plástico (esto sirve comoprotección adicional contra la desecación de las pastillas de hambre). Tenga cuidado de no mover el cuadro demasiado, porque de lo contrario se verá afectado las gotas de inoculación. </li><li> Almacenar la caja envuelta a temperatura ambiente durante al menos 20 h antes de analizar las muestras. </li></ol> 5. Análisis microscópico de las muestras <ol><li> Después de 20 h de incubación, las muestras están listas para el análisis microscópico; puso el portaobjetos en un pañuelo de papel seco (el fondo tiende a convertirse en húmedo). </li><li> Pipetear un pequeño volumen de agua (aproximadamente 50 l) en la almohadilla de inanición. Ponga un cubreobjetos sobre la almohadilla y exprima el exceso de agua. Eliminar el agua sobrante con un pañuelo de papel. </li><li> Coloque el portaobjetos de microscopio sobre la mesa de observación del microscopio de fluorescencia. Para tener una visión general de crecimiento del micelio, utilice un objetivo 20X. Uso 63X o 100X objetivos para el estudio de la localización de las buenas prácticas agrarias en las hifas. Con el fin de evitar la desecación gradual de la muestra no analizar las muestras demás de 15 minutos antes de volver a ponerlos en la cámara húmeda. </li><li> Repita 5,3 a intervalos regulares (por ejemplo, después de 40 horas y 60 horas de crecimiento). NOTA: La muestra se puede poner de nuevo en la cámara húmeda. No es necesario retirar el cubreobjetos, ya que no afecta el crecimiento del micelio. </li></ol>

<ol>
	<li>Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control:+an+integrated+network+of+pathways.">Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).</li><li>Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+filamentous+fungi.">Autophagy in filamentous fungi.</a> Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).</li><li>Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podospora+anserina:+a+model+organism+to+study+mechanisms+of+healthy+ageing.">Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing.</a> Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).</li><li>Pinan-Lucarr&#233;, B., Iraqui, I., Clav&#233;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podospora+anserina+target+of+rapamycin.">Podospora anserina target of rapamycin.</a> Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).</li><li>Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+ATG8+homologue+Aoatg8+and+role+of+autophagy+in+differentiation+and+germination+in+Aspergillus+oryzae.">Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae.</a> Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).</li><li>Pinan-Lucarr&#233;, B., Balguerie, A., Clav&#233;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+cell+death+in+Podospora+autophagy+mutants.">Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants.</a> Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).</li><li>Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+fungal+cell+death+is+necessary+for+infection+by+the+rice+blast+fungus.">Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus.</a> Science. 312 (5773), 580-583 (2006).</li><li>Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+deficiency+promotes+beta-lactam+production+in+Penicillium+chrysogenum.">Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).</li><li>Meijer, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomes+are+required+for+efficient+penicillin+biosynthesis+in+Penicillium+chrysogenum.">Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).</li><li>Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding,+improving+and+using+green+fluorescent+proteins.">Understanding, improving and using green fluorescent proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).</li><li>Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+regulation+of+autophagy.">mTOR regulation of autophagy.</a> FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).</li><li>Hickey, P. C., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+living+cells+of+Aspergillus+in+vitro.">Imaging living cells of Aspergillus in vitro.</a> Med. Mycol. 47, S110-S119 (2009).</li></ol>

The author has nothing to disclose.

El método aquí presentado permite el estudio conveniente y reproducible de la autofagia en P. chrysogenum. Por ejemplo, puede ser utilizado para el cribado de la eficacia de diversos compuestos si son capaces de modular la respuesta autofagia de este hongo o no. Los resultados con rapamicina demuestran que la inhibición de la señalización de TOR conduce a una inducción pronunciada de la autofagia en P. chrysogenum que también ha sido demostrado para otros organismos 11. Es posible usar micelios cultivados en almohadillas de hambre para el análisis en los microscopios más sofisticados (por ejemplo, microscopios de barrido confocal láser). No importa si se pone la muestra por debajo del objetivo de encima del objetivo (microscopio invertido). Diversas proteínas fluorescentes dirigidos a determinados compartimentos se pueden utilizar para controlar el destino de diferentes orgánulos durante la autofagia (por ejemplo, las mitocondrias -&gt; mitofagia; r endoplásmicoeticulum -&gt; ER-Fagia, etc).. En resumen, la técnica descrita aquí se extiende el espectro de métodos para estudiar microscópicamente hongos 12. El protocolo es generalmente sencillo y fácil de usar. Sin embargo, es muy importante que las almohadillas de hambre nunca se secan ya que esto dará lugar a artefactos y la muerte celular. Por lo tanto se sugiere fuertemente que (i) los portaobjetos de microscopio que contienen la solución de agarosa todavía líquido se retiran inmediatamente de la placa de calentamiento (paso 3.3), (ii) que la hoja de la cubierta para la fabricación de una superficie plana se elimina de la almohadilla de hambre después de una máximo de 5 min (pasos 3.3 y 3.4), (iii) que el portaobjetos de microscopio se mantiene siempre en la cámara húmeda cuando no analizado (pasos 3.5 y 5.4) y (iv) que el análisis microscópico no toma más de 15 min (paso 5.3). Otro aspecto importante es que el importe de partida de esporas o fragmentos de micelio pipeta sobre la almohadilla de hambre no debería ser demasiado alta odemasiado baja. Esto puede ser fácilmente controlado por dilución de la población mediante el uso de agua del grifo estéril. La dilución 1/50 se describe en 1.1.3 funciona bien para P. chrysogenum suspensiones de esporas. Es la dilución recomendada para el uso con nuestros hongos pero podría requerir algunos ajustes. Una limitación de este método es que no es recomendable para los experimentos de imagen de lapso de tiempo de más de 15 min. Esto es debido a la desecación gradual de la almohadilla de la inanición una vez que se retira de la cámara húmeda. Si se necesitan tiempos de observación más largos, es posible añadir pequeñas cantidades de agua del grifo estéril a la periferia de la almohadilla de hambre aunque esto no impide que algunos desecación en las regiones centrales de la almohadilla. Otra limitación es que el método no es estrictamente cuantitativo. En los organismos unicelulares es posible marcar eventos por célula (por ejemplo, cantidad de células que contienen GFP en la vacuola). En contraste, P. chrysogenum como un hongo filamentoso es caractetorizado por una arquitectura multicelular. Las células se dividen por septos que contienen un poro central que permite el paso de citoplasma y orgánulos. Por lo tanto, las muestras pueden ser analizadas sólo &#39;semi cuantitativa &quot;(por ejemplo, número de hifas que contiene GFP localizada a vacuolas). Para alcanzar la significación es muy importante que el número de hifas analizado es lo suficientemente alta (por lo menos 80 por punto y condición probada pero más tiempo está definitivamente preferible). La utilización de almohadillas de hambre para el estudio de la autofagia se puede adaptar fácilmente para su uso en otros hongos filamentosos. Por lo tanto el protocolo presentado aquí no se limita sólo a P. chrysogenum. También debe ser posible adaptar para con los hongos unicelulares, es decir, levaduras. Transferencia del protocolo para los organismos superiores (por ejemplo, nematodos) probablemente requiere adaptaciones más especializados. Será interesante ver si el método descrito en este trabajo también encuentrasu uso en otros campos.

Los hongos filamentosos son excelentes sistemas modelo para el estudio de los procesos de desarrollo. Ofrecen varias ventajas experimentales como el cultivo barato, un alto número de progenie y accesibilidad genética. El último punto es de particular relevancia para la construcción de los transformantes que permiten investigar la importancia de los genes tan lejos no caracterizados por diversos mecanismos celulares. Los hongos filamentosos han sido instrumentales para el esclarecimiento de varios elementos y mecanismos de control de calidad de las vías celulares como actividad de la proteasa de la degradación de proteínas aberrantes, dinámica mitocondrial para mantener la integridad mitocondrial y la autofagia para la eliminación de los excedentes y / o componentes de células disfuncionales y para mantener la viabilidad celular en tiempos de 1,2,3 inanición. Hay varias técnicas experimentales disponibles para el estudio de la autofagia en hongos filamentosos 2: (i) la investigación de vacuolas if que contienen cuerpos densos autofágicos cuando proteasas son inhibidas por microscopía electrónica de transmisión 4, (ii) la visualización de autofagosomas de seguimiento de focos-GFP Atg8 a través de microscopía de fluorescencia de 5,6 y (iii) la detección de estructuras autophagosomal acidificados mediante el uso de la monodansyl cadaverina colorante fluorescente 7. Aquí, se presenta un nuevo método de cultivo de Penicillium chrysogenum para los estudios de la autofagia. El elemento principal es el &quot;cojín de hambre&quot;, que consiste simplemente en agarosa al 1% disuelto en el agua del grifo esterilizada. Los compuestos adicionales (por ejemplo, factores de estrés, carroñeros, moduladores de la autofagia) se pueden añadir a la almohadilla, siempre y cuando no se muestran auto-fluorescencia. La almohadilla se encuentra en portaobjetos de microscopio que contienen una cavidad central de poca profundidad. Esta almohadilla en inoculadas con una suspensión de esporas o con pequeños fragmentos de micelio. Este último es aconsejable si la cepa de interés no sporulate eficiente (por ejemplo, cepas ATG1 Δ 8). Los portaobjetos se colocan en cámaras húmedas (estos pueden ser fácilmente construidos mediante el uso de cajas de puntas de pipeta vacías) para evitar la desecación de la muestra y se incubaron a temperatura ambiente. P. chrysogenum es capaz de crecer durante unos días en estas condiciones. La autofagia puede observar microscópicamente por la ampliación vacuolar que es un marcador positivo para la autofagia hongos. En esta contribución, una P. chrysogenum cepa (Wisconsin 54-1255) se utiliza que forma la proteína verde fluorescente que se dirige a los peroxisomas por su secuencia C-terminal &#39;SKL&#39; 9. Por lo tanto, es posible monitorizar la degradación de los peroxisomas. Es factible etiqueta también otros compartimentos de la célula (por ejemplo, mitocondrias) mediante el uso de señales de localización apropiadas y analizar su degradación. Aunque los datos de P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) se presenta aquí, sin duda es posibleutilizar el método de &#39;almohadilla de hambre &quot;también para otros hongos filamentosos (por ejemplo, Neurospora crassa, macrospora Sordaria, especies de Aspergillus, etc.).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Microscope slides with central cavity</td>
			<td style="width:71px;">Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:119px;">H884.1</td>
			<td>These can be used multiple times after cleaning.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Glass beads</td>
			<td style="width:71px;">Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:119px;">A553.1</td>
			<td>Diameter: 0.25 - 0.50 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of autophagy in penicillium chrysogenum by using starvation pads in combination with fluorescence microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Para demostrar la utilidad del protocolo detallado anteriormente degradación de peroxisomas en el P. Se analizó chrysogenum cepa Ws54-1255 (GFP-SKL). En esta cepa GFP-SKL generalmente se importa en los peroxisomas 9. Esto da lugar a la aparición de múltiples formas esféricas cuando se analiza la muestra a través de microscopía de fluorescencia. Si se produce la autofagia, las vacuolas se agrandan. GFP-SKL se incorpora en vacuolas por autofagia (pexophagy). Debido al hecho de que la GFP es resistente a la degradación por proteasas de vacuolas que etiqueta estos orgánulos 10. Por lo tanto los dos parámetros para la observación de la autofagia (pexophagy) en esta cepa, la ampliación vacuola y localización de GFP-SKL a vacuolas, se controlan convenientemente por microscopía de fluorescencia. En 20 horas de incubación, GFP nunca se observa en las vacuolas (Figura 1). Además, la ampliación vacuola no está teniendo lugar. Sin embargo, a 40 horas de crecimiento vacuolas GFP-etiquetadoshacerse visibles en algunas de las hifas, lo que indica la autofagia (pexophagy) para convertirse en activa (Figura 1). A 60 horas de crecimiento de la cantidad de vacuolas GFP-etiquetados ha aumentado aún más. Como control negativo un atg1 mutante Δ de P. chrysogenum se utilizó (atg1 Δ (GFP-SKL)) (Figura 2). Ni vacuolas agrandados ni GFP-etiquetados se pueden observar en esta cepa. Como control positivo, el fármaco rapamicina autofagia estimulante se utiliza (Figura 3). Después de 40 h de crecimiento vacuolas GFP-etiquetados se hacen visibles. En 60 horas, las hifas están completamente llenos de enormes vacuolas que contienen GFP (Figura 3). Este hallazgo indica que, como se esperaba, la autofagia masiva tiene lugar aquí. En conjunto, estos resultados demuestran la validez de la configuración experimental. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52577/52577fig1highres.jpg" /> <strong&gt; Figura 1:. La localización de GFP-SKL en Ws54-1255 (GFP-SKL) durante el cultivo en las almohadillas de hambre en los tiempos indicados, las culturas crecido en los cojines de hambre se analizaron mediante microscopía de fluorescencia. Se muestran imágenes representativas para cada punto de tiempo. Correspondientes áreas de campo claro se muestran cada imagen canal de fluorescencia a continuación. Blanca &quot;v&quot;: GFP-SKL localiza en vacuolas que indican la degradación de peroxisomas. Las barras de escala: 10 m. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52577/52577fig2highres.jpg" /> Figura 2:. La localización de GFP-SKL en Δ atg1 (GFP-SKL) durante el cultivo en las almohadillas de hambre en los tiempos indicados, las culturas crecido en los cojines de hambre se analizaron mediante microscopía de fluorescencia. Se muestran imágenes representativas para cada punto de tiempo. Correspondiente zonas de campo claro se muestran debajo de cada fluorescenciaimagen del canal. Las barras de escala: 10 m. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52577/52577fig3highres.jpg" /> Figura 3:. La localización de GFP-SKL en Ws54-1255 (GFP-SKL) tratados con rapamicina para la inducción de la autofagia En las culturas tiempos indicados cultivadas en almohadillas de hambre suplementado con 1 mM rapamicina se analizaron mediante microscopía de fluorescencia. Se muestran imágenes representativas para cada punto de tiempo. Correspondientes áreas de campo claro se muestran cada imagen canal de fluorescencia a continuación. Blanca &quot;v&quot;: GFP-SKL localiza en vacuolas que indican la degradación de peroxisomas. Las barras de escala: 10 m.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Análisis de la autofagia en<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Por la inanición Pads en combinación con microscopía de fluorescencia

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

analysis-autophagy-penicillium-chrysogenum-using-starvation-pads

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

8.5K vistas.  Senckenberg Research Institute. A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Video: Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Investigación

Biología

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Electrofusión de células visualiza con microscopía de fluorescencia

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Análisis rápido y exploración de microscopía de fluorescencia de Imágenes

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Análisis de glucocorticoides fecales: Monitoreo suprarrenal no invasiva en los équidos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

La visualización de frecuencia Stromule con microscopía de fluorescencia

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

La activación de la autofagia mediante ejercicio aeróbico en ratones

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...