The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility &#8221;Two-Photon Imaging&#8221;, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.

הערה: הניסויים בוצעו בהתאם לחקיקה המסדירה הגרמנית מחקרים בבעלי החיים הבאים &quot;המדריך לטיפול ושימוש בחי מעבדה&quot; (NIH פרסום, מהדורת 8, 2011) וההוראה 2010/63 / האיחוד האירופי על ההגנה על בעלי החיים משמש למטרות מדעיות (כתב עת הרשמית של האיחוד האירופי, 2010). אישור רשמי ניתנה ממשרד הטיפול בבעלי החיים ושימוש הממשלתי (LANUV Nordrhein-Westfalen, רקלינגהאוזן, גרמניה). הערה: צעדים שניתן להשמיט הדמיה לטווח קצר (למשל יריות הצמד, ערימות 3-D או גם מיקרוסקופיה זמן לשגות זמן קצר) מסומנות בכוכבית (*) כדי לקצר את זמן הכנה ולפשט את הפרוטוקול כירורגית. הדמיה יכולה גם להתבצע ללא בקרת ניטור ומחזור נרחבת במידת צורך, עם זאת, זמן הישרדות יופחת במידה ניכרת. 1. הגדרת מיקרוסקופ וטרום ניתוח הכנה (5-10 ק&quot;מn) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת מתג (מיקרוסקופ, מעבדה כוח, לייזר, כרית חימום, תא האקלים, מצלמת אינטרנט, מכשיר משאבת מזרק, הנשמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר O 2 אספקה ​​לIsoflurane החמקן ורמת Isoflurane מוגדרת 1.5% כרך (V / V), להתחבר למכונת הנשמה חיה קטנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה לטווח קצרה, לשמור על ההרדמה באמצעות isoflurane רק לאחר האינדוקציה ההרדמה ip הראשונית (ראה שלב 2.2). לאחר מכן, השתמש 2% כרך (V / V) Isoflurane, ולשמור על זמן ההדמיה מתחת ל -2 שעות כדי להבטיח זרימת דם בכבד יציבה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר נשימה ל120-140 מחזורי נשימה / min בהיקף של 150-200 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את שלב agarose העכבר. הכן של 3% (w / v) agarose 100 מיליליטר, לשפוך אותו לתוך צלחת (כ 10 סנטימטרים x 15 סנטימטרים בסיס) בזווית של 40 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את אזור ניתוח עבודת איסוף המכשור הנדרש. כדי למנוע זיהום חיידקים, חיטוי מכשירים באמצעות פתרון 1% מSekusept Forte S (9.9% w / v), Glutaral 9.8% w / v, פורמלדהיד ל5 דקות לפני הניסוי (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג רכיבים שנותרו: חיטוי עור (לדוגמא, תמיסת יוד povidone 10%), שלב כבד (ערימות וגשר), פתרון agarose (3% (w / v) בPBS), משאבת מזרק עם 5% (w v /) פתרון גלוקוז (G-5), משאבת מזרק עם חומר הרדמה ש( מ&quot;ג קטמין 0.1 / מיליליטר, מ&quot;ג Xylazine 0.5 / מיליליטר, 5 מיקרוגרם / מיליליטר פנטניל), צמר גפן, n-בוטיל-2-Cyanoacrylat, ו1x PBS. שים צלחת שלב agarose לתוך תא דגירה לחימום מוקדם. </li></ol> 2. קנה (10-15 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש C57BL / 6 עכברים ברביית בית במשקל 25-28 גרם. בית העכברים בתנאי הפתוגן ללא ספציפיים בהתאם להנחיות FELASA, לטמפרטורת סביבה ולחות מבוקרת עם hr אור 12 / מחזור כהה 12 שעות. לאפשר גישה חופשית לבעלי חיים תזונה סטנדרטית עכברים (דיאט מכרסם רגיל לרחרח) וכרצונך מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי initintraperitoneal ial הזרקה (IP) של 250 μl של ההרדמה II (קטמין 0.1 מ&quot;ג / מיליליטר, מ&quot;ג Xylazine 1 / מיליליטר, עצירות 10 מיקרוגרם / מיליליטר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * לתחזוקה במהלך ההדמיה intravital, ברציפות לנהל הרדמה אני בזריקת ip רציפה (מ&quot;ג קטמין 0.1 / מיליליטר, מ&quot;ג Xylazine 0.5 / מיליליטר, פנטניל 5 מיקרוגרם / מיליליטר) באמצעות מכשיר משאבת מזרק עם קצב זרימה של 0.2 מיליליטר / שעה ב שילוב עם% כרך inhalative isoflurane 0.5 (V / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הרפלקסים לאחר 5 דקות (לדוגמא כרית כף רגל קמצוץ עם מלקחיים), לחטא את העור לtracheotomy, להתחיל הכנה אם עכבר נמצא במצב הרדמה כירורגית סובלני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל קרם עיני מגן (לדוגמא, Dexpanthenol 50 מ&quot;ג / g) כדי למנוע קרנית מפני התייבשות (איור 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבע עכבר על שולחן הכנה חושף צד הגחוני באמצעות נייר דבק לגפיים; בעדינות להתמתח יתר על מידת צוואר, לקבע בתנוחה זו, למשל., על ידי שימוש בגומיית מכור to החותכות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את עור ופרווה באמצעות תמיסת יוד povidone, על ידי יישום חומר חיטוי עם מקלון צמר גפן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע חתך בעור ראשוני (סנטימטר אורך 0.5-1) ישירות מתחת לסנטר (איור 1 ג) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לנתח רקמות חיבור בין בלוטות רוק (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרוע זהירות קנה הנשימה צינור המקיף את שרירים פתוחים (איור 1E, F). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חוט כירורגי מתחת לקנה הנשימה לקיבוע צינור האוורור מאוחר יותר (איור 1G). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קנה נשימה פתוחה עם מיקרו מספריים בין טבעות סחוס ביצוע חתך בצורת T (איור 1H) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צינור אוורור לקנה נשימה דרך החתך (~ 0.5 סנטימטרים). לדחוף את הצינור קדימה, לתפוס סוף הזנב עם מלקחיים אנטומיים קטנים ובעדינות לקדם את הצינור לתוך קנה הנשימה (איור 1 ט) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבע צינור עם חוט כירורגית (לדוגמא </eמ &#39;&gt;, 5-0) עם חוט יוצב בשלב 2.5 קשירת קשר סביב צינור בתוך קנה הנשימה; לבצע קיבוע גולגולת שני של הצינור בעור, כדי למנוע depositioning המקרי (איור 1J, K). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חותם עם דבק רקמות (למשל, n-בוטיל-2-Cyanoacrylat) (איור 1 ליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבע צינור בראש באמצעות סרט דבק. </li></ol> 3. Laparatomy (15-20 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר על כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה. לגלח את הבטן, להסיר בזהירות את שיער מהעור. לחטא את עור ופרווה מגולחים באמצעות תמיסת יוד povidone. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע עור קטן לחתוך מתחת לעצם החזה באמצעות מספריים כירורגית (איור 2 א). להאריך את הקיצוץ רוחבי מתחת לצלעות לשני הצדדים, צריבה כל כלי הדם הגלויים כדי למנוע דימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בזהירות חתך קטן בalba linea מתחת לעצם החזה, פתיחת הצפק (איור 2). להאריך את החתך לשני הצדדים באמצעות cauterization כדי למנוע דימום (איור 2 ג, ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר לתוך צלחת שלב agarose (איור 2E). מניחים ערימות של גובה מתאים בשני הצדדים של העכבר (בדרך כלל 12-14 כיסוי התלושים) (איור 2F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח חיישן הדק נשימה מתחת גב עליון לסנכרן מיקרוסקופ עם הנשימה. הפעל יחידת הדק (איור 2G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חוט כירורגי (5-0) דרך עצם החזה לחזור צלעות (איור ט 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך בזהירות רצועת חיבור כבד וסרעפת (רצועת falciform), כמו גם בדרכי עיכול וכבדות באמצעות מספריים כירורגיות מעוקלים. חותך את רצועות falciform אל אב העורקים (איור י 2). </li></ol> 4. הגדרת דוגמא (10-15 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר בצד ימין עם זווית של 45 מעלות לגישה קלה לאונת כבד גדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף גשר בימוי מתחת לצלעות, המכסה את הבטןחלל. ייצור גשר באמצעות להחליק את מכסה סטנדרטי עם ציפוי נייר דבק כדי לכסות קצוות חדים (איור 2K). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח אונת כבד גדולה על במה. להחליק בזהירות בדיקה עט כדור הכפול או מרית מרופדת מתחת לכבד והחזק את החלק העליון של האיבר באמצעות מקלון צמר גפן רטוב או רקמה רטובה. הרם אונה לשקופית ולהחיל גרירה עדינה. אונה יכולה להיות כפופה או מקופלת. לספק טיפול נוסף כדי רק מניפולציה עדינה של הכבד (איור 2L). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים הימור צדדי תומך, למשל, ערימות של פתקים קטנים כיסוי (20 מ&quot;מ x 20 מ&quot;מ), בסך של כ באותו הגובה של אונת הכבד לצד זה כדי לתמוך בתלוש לכסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פתק גדול כיסוי (24 מ&quot;מ x 50 מ&quot;מ) באונת הכבד. ודא שכיסוי להחליק מכוון כאופקי ככל האפשר (איור 2M). הערה: להחליק את המכסה צריך להיות במגע עם הרקמה בלי לסחוט אותו. לבדוק סימנים נראים לעין של זרימת דם לקויה (רקמה לבנה). אם microcirculation מופר, להוסיף תמיכה בהימור נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * מקום שני צנתרים intraperitoneal עצמאיים (איור 2N) להרדמה לטווח ארוך ויישום G-5. התקן צנתרים רוחבי בבטן התחתונה בסמוך לגפיים האחורי. הערה: הצנתרים intraperitoneal יכולים להיות על ידי חיבור 27 מחטי G עם צינורות גמישים סיליקון (איור 3) מתוצרת עצמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * מחט לקבע עם לולאה של חוט 5-0 כירורגית לעור, כדי למנוע תזוזה מקרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * צרף משאבת מזרק עם פתרון הרדמה אני לקטטר 1, קצב זרימה מוגדר 0.2 מיליליטר / שעה; לצרף משאבת מזרק עם G-5 לקטטר 2, קצב זרימה מוגדר 0.1 מיליליטר / שעה. </li></ol> 5. ניטור עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * אלקטרודות א.ק.ג. מקום לחזית וגפיים אחוריות (איור 4 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * צרף צינורות תפוגה ל- CO 2 חיישן רמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף חיישן טמפרטורה חיצוני המחובר למשטח חום (איור 4C). </li></ol> 6. הטבעה וקיבוע רקמות (5-10 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן של 3% (w / v) agarose ב1X PBS 100 מיליליטר. להטביע כבד, כאשר הטמפרטורה היא 41 מעלות צלזיוס באמצעות מזרק 5 מיליליטר ומחט 18 G (איור 5 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים agarose שנותר על coverslip וסביב העכבר (איור 5 ב, ג). חכה עד agarose gelatinized באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר agarose העודף באמצעות מרית היידמן, הכנת viewfield גדולה מספיק כדי לסרוק את אונת הכבד מוכנה (איור 5D, E). </li></ol> 7. הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכבר לתא אקלים מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 50-100 מיליליטר של 1x PBS (שחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי צלחת מדגם כדי למנוע אידוי (איור 5F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * ירידת isoflurane inhalative 0.5 כרך% (v / v). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * התחל תוכנת ניטור, הקלטת א.ק.ג., קצב לב וCO 2 הנשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל הדמיה: לפתוח להתריסי ser, לזהות שדות ראייה של עניין, להגדיר גבול עליון ותחתון לZ-ערימות, ולהתחיל בהקלטת הזמן לשגות. להתקין מחדש Z-ערימות אם יש צורך לתקן את Z-הסחיפה (למשל. כתוצאה משינויים בלחץ דם או תנודות טמפרטורה, איור (5G). הערה: לאחר סיום תקופת ההדמיה או אם במחזור או ההרדמה של בעלי החיים הופך לבלתי יציב, להקריב את העכברים על ידי נקע בצוואר הרחם (בלי התעוררות מההרדמה). </li></ol>

<ol>
	<li>Dusseaux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+MAIT+cells+are+xenobiotic-resistant,+tissue-targeted,+CD161hi+IL-17-secreting+T+cells.">Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells.</a> Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).</li><li>Reese, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hypoxia+on+liver+secretion+studied+by+intravital+fluorescence+microscopy.">The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy.</a> Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).</li><li>Bhathal, P. S., Christie, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+fluorescence+microscopy+study+of+bile+ductule+proliferation+in+guinea+pigs.">Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs.</a> Gut. 10 (11), 955 (1969).</li><li>Stefenelli, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+vascular+system+and+microcirculation+of+the+rat+liver+in+intravital+microscopy.">Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy.</a> Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).</li><li>Hori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+sure+methodology+for+massive+hepatectomy+in+the+mouse.">Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse.</a> Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).</li><li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+dual-colored+visualization+of+colorectal+liver+metastasis+in+living+mice+using+two+photon+laser+scanning+microscopy.">Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy.</a> Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).</li><li>Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion+injury+is+dramatically+increased+by+gentle+liver+manipulation+during+harvest.">Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest.</a> Transpl Int. 13, S525-S527 (2000).</li><li>Schemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Kupffer+cells+cause+a+hypermetabolic+state+after+gentle+in+situ+manipulation+of+liver+in+rats.">Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).</li><li>Toiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+DSS-induced+cecal+mucosal+damage+in+GFP-transgenic+mice+using+two-photon+microscopy.">Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy.</a> J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).</li><li>Zimmon, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hepatic+vasculature+and+its+response+to+hepatic+injury:+a+working+hypothesis.">The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis.</a> Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).</li><li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature.">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).</li><li>Bonder, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+neutrophil+recruitment+to+the+liver+in+concanavalin+A-induced+hepatitis.">Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis.</a> J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).</li><li>Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence+excitation:+new+spectral+windows+for+biological+nonlinear+microscopy.">Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).</li><li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging.">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).</li><li>Amore, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+imaging+of+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer+disease+reveals+marked+thioflavine-S-associated+alterations+in+neurite+trajectories.">In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).</li><li>Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+inflammatory+leukocyte+recruitment+in+kidney,+lung+and+liver--challenges+to+the+multi-step+paradigm.">Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm.</a> Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).</li><li>McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+specifically+associated+with+thioflavine+S-positive+amyloid+plaques+by+multiphoton+microscopy.">In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy.</a> J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+Immune+Surveillance+by+CXCR6++NKT+Cells+Patrolling+Liver+Sinusoids.">Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids.</a> PLoS Biology. 3 (4), (2005).</li><li>Vel&#225;zquez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+activation+by+innate+cytokines+or+microbial+antigens+can+cause+arrest+of+natural+killer+T+cell+patrolling+of+liver+sinusoids.">Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids.</a> J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).</li><li>Wehr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CXCR6-dependent+hepatic+NK+T+Cell+accumulation+promotes+inflammation+and+liver+fibrosis.">Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis.</a> J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).</li><li>Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+cells+contribute+to+postischemic+liver+injury+in+mice+by+interacting+with+sinusoidal+endothelium+and+platelets.">CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets.</a> Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).</li><li>Egen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+and+T+cell+dynamics+during+the+development+and+disintegration+of+mycobacterial+granulomas.">Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas.</a> Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).</li><li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+donovani-induced+expression+of+signal+regulatory+protein+alpha+on+Kupffer+cells+enhances+hepatic+invariant+NKT-cell+activation.">Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation.</a> Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).</li><li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+experimental+Leishmania+donovani-induced+hepatic+granulomas+detects+Kupffer+cell-restricted+antigen+presentation+to+antigen-specific+CD8+T+cells.">Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathog. 6 (3), e1000805 (2010).</li><li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+danger+signals+guide+neutrophils+to+sites+of+sterile+inflammation.">Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation.</a> Science. 330 (6002), 362-366 (2010).</li><li>Vanheule, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intravital+microscopic+study+of+the+hepatic+microcirculation+in+cirrhotic+mice+models:+relationship+between+fibrosis+and+angiogenesis.">An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis.</a> Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).</li><li>Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+surveillance+by+the+liver.">Immune surveillance by the liver.</a> Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).</li><li>Zimmermann, H. W., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+chemokine+pathways+and+immune+cell+infiltration+as+a+novel+therapeutic+approach+in+liver+inflammation+and+fibrosis.">Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis.</a> Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).</li><li>Kim, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites.">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).</li><li>Karlmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+recruitment+of+the+inflammatory+Gr1++monocyte+subset+upon+liver+injury+promotes+hepatic+fibrosis.">Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).</li><li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+macrophage+migration+and+differentiation+critical+for+liver+fibrosis+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+C-C+motif+chemokine+receptor+8+in+mice.">Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice.</a> Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).</li><li>Ramachandran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Ly-6C+expression+identifies+the+recruited+macrophage+phenotype,+which+orchestrates+the+regression+of+murine+liver+fibrosis.">Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).</li><li>Moles, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TLR2/S100A9/CXCL-2+signaling+network+is+necessary+for+neutrophil+recruitment+in+acute+and+chronic+liver+injury+in+the+mouse.">A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse.</a> J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).</li><li>Hammerich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CCR6-dependent+accumulation+of+&#947;&#948;+T+cells+in+injured+liver+restricts+hepatic+inflammation+and+fibrosis.">Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of &#947;&#948; T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis.</a> Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).</li><li>Syn, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKT-associated+hedgehog+and+osteopontin+drive+fibrogenesis+in+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease.</a> Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).</li><li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+CD44+and+hyaluronan+is+the+dominant+mechanism+for+neutrophil+sequestration+in+inflamed+liver+sinusoids.">Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids.</a> J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).</li><li>Egen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+reveals+limited+antigen+presentation+and+T+cell+effector+function+in+mycobacterial+granulomas.">Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas.</a> Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).</li><li>Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+microcirculation+in+murine+sepsis:+role+of+lymphocytes.">Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes.</a> Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).</li><li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neutrophil+in+vascular+inflammation.">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).</li><li>Khandoga, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue.">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS One. 4 (3), e4693 (2009).</li></ol>

The authors disclose no con&#64258;ict of interests.

מטרת המחקר שלנו הייתה לפתח שיטה סטנדרטית מאוד, יציבה ושחזור ההדמיה TPLSM intravital של הכבד. ההדמיה Intravital בכלל נתנה תובנות רבות ערך להתנהגות סלולרית בתנאי חיים אמיתיים הבאים ביות ואינטראקציה של אוכלוסיות לויקוציטים שונות בפיתוח, הומאוסטזיס ומחלה. עם זאת, העמדה המאתגרת מעט ?...

ההדמיה של תאים ותפקודים תאיים בכל איברים או אפילו כל יצורים הייתה עניין רב במשך יותר מ -50 שנים, הכוללת כמעט את כל חלקי הגוף 2. לכן, חלק מהמחקרים המוקדמים כבר בהדמית intravital של הכבד 3,4. עם זאת, יש מספר מגבלות קיימות מעודכנים לגבי הדמיה ברזולוציה גבוהה יציבה לטווח הארוך של רקמת כבד. בשל המיקום האנטומי של הכבד בקשר הדוק עם הסרעפת ומערכת עיכול 5, הבעיה הנפוצה ביותר להדמיה מיקרוסקופית intravital היא תנועה בשל נשימה ו, ובמידה פחותה, נפיחה של המעי 6. בהשוואה לאיברים מוצקים אחרים, ניתוח בכבד הוא מאתגר במיוחד. בשל מבנה כלי הדם הצפוף, מניפולציה כירורגית יכולה להוביל לנגעים מדממים מסיביים, זרימת דם לקוי 7 וגם הפעלה של תושב iתאי mmune כגון תאי Kupffer 8. לכן, קיבעון מכאני של הרקמה כפי שפורסם במקום אחר 6,9 עלול להפריע להדמיה מיקרוסקופית intravital. בכבד בריא, 10-15% מכלל נפח הדם שוכנים בתוך כלי הדם בכבד, והאיבר מקבל כ -25% מתפוקת הלב הכוללת של 10, טיוח האיבר רגיש מאוד לשינויים במחזור הדם (למשל, תנודות בלחץ הדם ). לכן, שיבושים בזרימת דם בכבד עקב למשל, מאמץ גזירה, עקירה, פגיעה על ידי טיפול ברקמה מוגזם או מחזור מרכזי יובילו לשינויים מלאכותיים בהתנהגות נדידה לויקוציטים, חמצון כבד פגום ונזק כבד ולכן עוד יותר, המשפיעים על תגובה חיסונית בכבד, כמו גם כשימור איברים וזמן חיים כולל של בעלי החיים. מחקרים מיקרוסקופיים מוקדמים התבססו על מיל epifluorescence intravitalcroscopy, אבל כמה אילוצים טכניים כגון הלבנת תמונה ועומק חדירה נמוכה להגביל את השימוש בטכניקה זו להדמיה כבד לטווח ארוך 4,11,12. עם התפתחותה של מיקרוסקופיה multiphoton בשנת 1990, את המגבלות של הלבנת תמונה או עומק חדירה נפתרו בעיקר, כשיטת חדשה זו הייתה מבחינה טכנית מסוגלת לבצע בדיקות הדמיה כמעט בכל האיברים תחת מצבים בחיים אמיתיים 13-15. עם זאת, האתגרים העיקריים שנותרו פתוחים בנוגע להדמית כבד היו: תנועות נשימה, autofluorescence של רקמת כבד, הבטחת זרימת דם ללא שינוי בsinusoids הכבד, והדמיה יציבה במיוחד לתקופות ארוכות יותר של מספר שעות 16. למרות שמספר מחקרים התייחסו לפונקציה וההגירה של לויקוציטים השונים בכבד 17, למשל, NKT-תאים 18-20, תאי T 21,22, מקרופאגים כבד 23,24 או נויטרופילים 25, מ &#39;multiphoton לטווח ארוךההדמיה icroscopy עדיין לא נוצרה בהצלחה, משימה מאתגרת יותר אפילו בבעלי חיים עם מחלת כבד אקוטית או כרונית עקב הנזק הקיים ורגישות גבוהה יותר ולכן לפגיעה נוספת 26. עם זאת, ניטור התנהגות נדידה ותפקוד תאי של לויקוציטים בכבד בזמן אמת מאפשר תובנות רומן בתפקיד המסוים שלהם בהומאוסטזיס כבד ומחלות 27. CXCR6 קולט chemokine באה לידי ביטוי בכמה תת-רכיבי הלימפוציטים, כוללים רוצח טבעי (NK) תאים, תאי NKT וכמה אוכלוסיות תאי T 18,28. מחקרים קודמים בעכברים הראו כי CXCR6 וCXCL16 יגנד המקור שלה יכולים לשלוט הסיורים של תאי NKT על sinusoids הכבד במהלך הומאוסטזיס. כתוצאה מכך, השימוש בעכברי CXCR6.gfp (ביצוע נוק-בחלבון פלואורסצנטי ירוק [GFP] של במוקד CXCR6) תוארו לחקור את ההגירה של לימפוציטים באיברים שונים כגון מוח 29וגם כבד 18,20, מראה עליית חדירה של תאי CXCR6.gfp על דלקת. בשיטה שנקבעה במחקר זה ניתן היה לעקוב אחר תהליכים אלה על פני תקופה ארוכה של זמן בתנאים התייצבו. הליך multiphoton intravital מבוסס אפשר הדמיה שהייתה מאוד לשחזור עם ההפרעות מינימליות של בעלי החיים והאיברים; מותאם להישרדות של בעלי חיים לטווח ארוך על ידי ניטור נרחב אחריו שליטה הדוקה של נשימה ומחזור דם; וגמישים וקלים מאוד לאמץ גם לאיברי parenchymal אחרים כגון כליות או טחול.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1184">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Anesthetics</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:293px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:263px;">Essex Pharma</td>
			<td style="width:219px;">997.00.00</td>
			<td>Analgeticum, 0.1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Fentanyl</td>
			<td style="width:263px;">Rotex Medica</td>
			<td style="width:219px;">charge: 30819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Fluovac anesthesia system</td>
			<td style="width:263px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:219px;">34-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Glucose 5%</td>
			<td style="width:263px;">Braun</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser</td>
			<td style="width:263px;">Eickemeyer</td>
			<td style="width:219px;">4802885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:263px;">Forene Abbott</td>
			<td style="width:219px;">B 506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Isotonic (0.9%) NaCl solution</td>
			<td style="width:263px;">DeltaSelect GmbH</td>
			<td style="width:219px;">PZN 00765145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Ketamin 10%</td>
			<td style="width:263px;">ceva</td>
			<td style="width:219px;">Charge: 36217/09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;"></td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Xylazin 2%</td>
			<td style="width:263px;">medistar</td>
			<td style="width:219px;">Charge: 04-03-9338/23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;"></td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Consumable supplies</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">20ml Syringe</td>
			<td style="width:263px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250ml Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:263px;">Schott Duran</td>
			<td>21 226 36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">25mL Beaker 2x</td>
			<td style="width:263px;">Schott Duran</td>
			<td style="width:219px;">50-1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">2ml syringe</td>
			<td style="width:263px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl suture</td>
			<td style="width:263px;">Ethicon</td>
			<td style="width:219px;">V7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Agarose</td>
			<td style="width:263px;">commercially available</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Bepanthen Eye and Nose ointment</td>
			<td style="width:263px;">Bayer Vital GmbH</td>
			<td style="width:219px;">6029009.00.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">18010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Cotton Gauze swabs</td>
			<td style="width:263px;">Fuhrmann GmbH</td>
			<td style="width:219px;">32014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Cover Slip 24x50mm</td>
			<td style="width:263px;">ROTH</td>
			<td style="width:219px;">1871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Durapore silk tape</td>
			<td style="width:263px;">3M</td>
			<td style="width:219px;">1538-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Feather disposable scalpel</td>
			<td style="width:263px;">Feather</td>
			<td style="width:219px;">02.001.30.011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID</td>
			<td style="width:263px;">Smiths medical</td>
			<td style="width:219px;">800/100/200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Histoacryl</td>
			<td style="width:263px;">Braun</td>
			<td style="width:219px;">1050052</td>
			<td>5x 0,5ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Leukoplast</td>
			<td style="width:263px;">BSN Medical Inc.</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:263px;">ROTH</td>
			<td style="width:219px;">1879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Poly-Alcohol Haut&#8230;farblos Antisepticum</td>
			<td style="width:263px;">Antiseptica GmbH</td>
			<td style="width:219px;">72PAH200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Sterican needle 18 G x 1</td>
			<td style="width:263px;">B. Braun</td>
			<td style="width:219px;">304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Sterican needle 27 3/4 G x 1</td>
			<td style="width:263px;">B. Braun</td>
			<td style="width:219px;">4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Tissue paper</td>
			<td style="width:263px;">commercially available</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;"></td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Surgical Instruments</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amalgam burnisher 3PL</td>
			<td style="width:263px;">Gatz</td>
			<td style="width:219px;">0110?</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2</td>
			<td style="width:263px;">Storz&#38;Klein</td>
			<td style="width:219px;">S-01134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont No.7 forceps</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Graefe forceps curved x1</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Graefe forceps straight x2</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heidemann spatula HD2</td>
			<td style="width:263px;">Stoma</td>
			<td style="width:219px;">2030.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Needle holder Mathieu</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">12010-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Scissor</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">14074-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Semken forceps</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Small surgical scissors curved</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">14029-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Small surgical scissors straight</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Standard pattern forceps</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas spring scissors</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;"></td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">ECG Trigger Unit</td>
			<td style="width:263px;">Rapid Biomedical</td>
			<td style="width:219px;">3000003686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer</td>
			<td style="width:263px;">AD Instruments</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Minivent Typ 845</td>
			<td style="width:263px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>73-0043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Multiphoton microscope Trimscope I</td>
			<td style="width:263px;">LaVision</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Perfusor Compact</td>
			<td style="width:263px;">B. Braun</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">PowerLab 8/30 8 channel recorder</td>
			<td style="width:263px;">AD Instruments</td>
			<td style="width:219px;">PL3508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Temperature controlled heating pad</td>
			<td style="width:263px;">Sygonix</td>
			<td style="width:219px;">26857617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Temperature sensor</td>
			<td style="width:263px;">comercially available</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Temperature controlled System for Microscopes -Cube&#38;Box</td>
			<td style="width:263px;">Life Imaging Services</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using cxcr6.gfp reporter mice

<html> דלקת כבד כתגובה לפציעה היא תהליך דינמי מאוד מעורב החדירה של סוגים נבדלים של לויקוציטים כוללים מונוציטים, נויטרופילים, תת תא T, תאי B, רוצח טבעי (NK) ותאי NKT. מיקרוסקופיה Intravital של הכבד לניטור נדידת תאים חיסוני היא מאתגרת במיוחד בשל הדרישות גבוהות לגבי הכנת מדגם וקיבעון, רזולוציה אופטית והישרדות של בעלי חיים לטווח ארוך. עם זאת, הדינמיקה של תהליכים דלקתיים כמו גם מחקרי אינטראקציה סלולריים יכולה לספק מידע קריטי להבין ייזום, ההתקדמות ונסיגה של מחלת כבד דלקתית טוב יותר. לכן, שיטה רגישה והאמינה ביותר הוקמה כדי ללמוד הגירה ותא-תא-אינטראקציות של תאי חיסון שונים בכבד עכבר על פני תקופות ארוכות (כ -6 שעות) על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים intravital סריקת לייזר (TPLSM) בשילוב עם טיפול נמרץ ניטור. אף אוזן גרון &quot;&gt; השיטה סיפקה כוללת הכנה עדינה וקיבוע יציב של הכבד עם ההפרעות מינימליות של האיבר; הדמיה intravital ארוכת טווח באמצעות מיקרוסקופ multiphoton ססגוניות עם כמעט ללא photobleaching או תופעות phototoxic על פני תקופה של עד 6 שעות זמן, המאפשרת מעקב של תת ספציפיים לויקוציטים; ותנאי הדמיה יציבים בשל ניטור המקיף של פרמטרים חיוניים עכבר וייצוב של זרימה, טמפרטורה וחילוף גזים. לחקור הגירת הלימפוציטים על דלקת כבד CXCR6.gfp לדפוק בעכברים היו נתונים להדמית כבד intravital בתנאי מחקר ולאחר פגיעה בכבד אקוטית וכרונית הנגרמת על ידי הזרקת intraperitoneal (ים) של פחמן טטרא (4 CCL). CXCR6 הוא קולט chemokine הביע בלימפוציטים, בעיקר על הטבעי Killer T (NKT) -, רוצח טבעי (NK) - associ רירית ותת קבוצות של לימפוציטים מסוג T כגון תאי CD4 T, אלא גםשמורת ated תאים (MAIT) T 1. בעקבות הדפוס נודד ומיצוב של CXCR6.gfp + תאי חיסון אפשר תובנה מפורטת להתנהגותם המשתנית שלהם על פגיעה בכבד, ולכן מעורבות הפוטנציאל שלהם בהתקדמות מחלה.

כדי לאמת את גישת TPLSM intravital שלנו, אנו חשופים GFP / + עכברי CXCR6 להדמית TPLSM intravital. עכברים שלא טופלו או הושארו כפקדים בסיסיים או נתון להזרקת intraperitoneal אחת של פחמן טטרא (CCL 4) כדי לגרום לנזק בכבד חריף 20. רצפי וידאו נלקחו על פני ...

Watch this Scientific Journal Video about Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice at JoVE.com

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

long-term-intravital-multiphoton-microscopy-imaging-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.8K Views.  RWTH University-Hospital Aachen. Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Video: Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

מיקרוסקופית Intravital הדמיה של הכבד הבא<em&gt; שושנת יריחו</em&gt; זיהום: הערכה של פרמטרים המודינמיים בדיה

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

ניתוח של<em&gt; Enterocolitica Yersinia</em&gt; מפעיל טרנסלוקציה לתאי מארח שימוש בטא לקטמאז מפעיל Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&amp;#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים שימוש IL-1β מונחה יזם עכברים Reporter DsRed

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...