יש המחברים אין לחשוף.

1. Assay clonogenic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיות תא בודדות של שורות תאי סרטן השד תלוי באסטרוגן תאי MCF-7 וT47D באמצעות הצעדים המפורטים להלן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום התרבות (DMEM / 10% חום בסרום / גלוטמין מומת עגל עוברי ועט / סטרפטוקוקוס) מצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים שאינה מחוברים יותר מ- 50% עם MCF-7 או תאי T-47D. לשטוף עם PBS. דגירה עם טריפסין 0.25% / 2.21 mM EDTA מומס בגלוקוז הגבוהה DMEM על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו תאים במרווחי 1 דקות תחת מיקרוסקופ לעומת שלב כדי להבטיח הפצת תא בודדת. Resuspend תאים עם טפטפת 2 מיליליטר ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשבש קשר תאי תאים כדי להשיג מעמד תא כמעט בלתי משתנה, אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך לדגור תאים בטריפסין על 37 מעלות צלזיוס במשך עד 4 דק &#39;אם אתה רואה גושים של תאים רק לאחר 2 דקות של דגירה. אין להשתמש בתאים אלה ללימודי clonogenic אם הם יישארו חסיד לדוארבגלל שגיאה יושקו אח אחר לאחר 4 דקות של trypsinization בתשואת מספר המושבה. הערה: אם תאים בכבדות, מספר מושבות הוקמו ישקף את המוצר של פחות תאים מהמספר מודגרות. אם תאי trypsinized מוגזמים, פוטנציאל clonogenic עשוי להצטמצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה תא בודדת של 1,500 תאים / בינוני תרבות מיליליטר במשך 24 צלחות גם, או, פחות (+ 500 מיליליטר / תאים, בהתאם לסוג התא או מספר מעבר), על ידי דילולים סדרתי בצינור ראשי אחד המכילים את כל הנפח הדרוש ל כל המשתנים בניסוי. הערה: המטרה היא צפיפות תא סופית של 800 תאים / 2 סנטימטר (טווח של כ -500 עד 1,100 תאים / 2 סנטימטר). המטרה היא להניב כ 100 + 50 מושבות, המאפשרת ספירה קלה יחסית, מונעת צפיפות ומאפשרת מושבות מספיק כדי לגרום להבדלים סטטיסטיים משמעותיים כאשר מושבות עלו או ירד בperturba הניסיונימשא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי דגירה בצפיפות clonogenic שימוש צעדים המפורטים להלן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים בבארות ארבע פעמים ב -24 צלחות מצופים פיברונקטין גם בצפיפות clonogenic של 1500 תאים / גם מצינור השעיה תא בודד אדון של 1,500 תאים / מיליליטר. Triturate הבינוני המכילים תאים עם טפטפת 5 מיליליטר על ידי ציור עד 3 מיליליטר וניפוק בינוני 1 מיליליטר בכל אחד מ2 בארות. הערה: צלחות מצופה פיברונקטין יש לרכוש מראש מצופים מספק מסחרי. צלחות ציפוי חיצוניים של איכות מבוקרת, תוצאות תהליך אוטומטיות במשטח אחיד שלא התאימו לassay זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ההשעיה על ידי pipetting למעלה ולמטה עם טפטפת 5 מיליליטר, להכין 3 מיליליטר של השעיה תא ולמלא 2 בארות עם 1 מיליליטר כל אחד. מלא רק 2 בארות בכל זמן מפיפטה אחד. להחזיר את הנפח שנותר בפיפטה ההשעיה התא בצינור הראשי, תאים גלולים שוב על ידי pipetting למעלה ולמטה ולהכין עוד 3 מיליליטר כדי למלא עוד 2 welLS עם 1 מיליליטר כל אחד. הערה: ערבוב רציף של הצינור הראשי הוא הכרחית, כי תאים יהיו ברציפות משקעים. הכנת נפח מספיק כדי למלא רק 2 בארות יש צורך להוסיף מספרים סלולריים דומים זה לזה היטב, כי תאים משקעים, כמו גם בפיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבוד במהירות כדי להפיץ כמויות הגדולות של תאים כי תאים המאפשרים לשבת בהשעיה בטמפרטורת חדר וריכוז CO 2 יהיה לווסת (התצפיות לא פורסמו) פוטנציאל clonogenic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל את הפריסה המרחבית של תאים במהלך הפעולה של pipetting אותם לבארות למבחני מושבה. לעשות זאת על ידי pipetting ההשעיה המכילה ריכוז התא הסופי לאמצע גם לאט. אל תחשוף את הצלחת כדי לקדם את התנועה לפני תאים ליישב לתחתית. לא לערבל את הצלחת כי ערבוב החוזר ביעילות צנטריפוגה התאים להיקף של צפיפויות גבוהות תא גם יצירת ומושבות ומחוברות לאינספור בשעה 6 ימים. הערה: אין לערבב אלא אם יש צורך, מאחר שזו פחות רצויה מאשר ללא ערבוב בכל לאחר החדרת הנפח עם התאים בתרחיף. אם יש צורך לערבב תאים, עושה זאת על ידי העברת הצלחת קדימה ואחורה בכיוונים ניצבת בזמן שהוא נח על משטח שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ללא שינוי תקשורת במשך 6 ימים. המספר הקטן של תאים ובלאחר 6 ימים לא ישפיע באופן משמעותי את ההרכב התזונתי או ציטוקינים ולא את ה- pH של המדיום המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצב את הקורס של assay הזמן כדלקמן: דגירה תאים בsubstrata פיברונקטין מצופה ביום 1. החלפה הקיימת בינוני עם 1 מיליליטר בינוני טרי או בינוני טרי המכיל FGF-2 10 / מיליליטר ng ביום 0. תאי כתם ביום 6 להלן ב1.4). לנהל כל הפרעות ניסיוניות ביום 3, כלהלן 1.3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרעות ניסויי הגדרה מולקולרית איתות או הדבקה מולקולות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, להוסיף 10056; L של תמיסה המכילה 10x של הריכוז המיועד הסופי של הסוכן המדאיג למדיום מיליליטר 1 בבארות. אל תערבב. המשך דגירה התאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל3 ימים נוספים. הערה: מביך סוכנים יכול לכלול מגוון של מעכבים וסוכני חסימה של מולקולות דבקות, קולטנים או חלבוני משטח אחרים, מעכבים של מסלולי איתות תאיים, מולקולות, גורמים, קו-פקטורים או חלבונים מבניים, שעשויה לשחק תפקיד בתמיכה במצב הרדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות כתם על יום 6, כדלקמן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם לאחר 6 ימים בתרבות עם 0.1% סגולים קריסטל טרי ב 2% אתנול / 10 borate נתרן מ&quot;מ (pH 9.0) פתרון. תקשורת לשאוב ולהוסיף פתרון סגול גביש מיליליטר לכל אחד גם עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף צלחות ידי שיקוע שלהם עם הפתחים גם כלפי מטה בזווית חדה לדלי קרח עולה על גדותיו עם ברז פועל ברציפותמים בכיור. הטה את הצלחת לזווית אופקית פעם מתחת למים, גם פתיחה מטה, ולאחר מכן להטות חזרה לזווית חדה בעת הסרת בתנועה זורמת עדינה אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הטבילה 2 או 3 פעמים עד שהמים בחלק התחתון של הבארות הוא כבר לא כחולים. שוטף נמרץ עשוי להסיר תאים או מושבות כי הם פחות חסיד בשל התערבות ניסיונית, והוסיף באופן משמעותי לשגיאה בספירה ונתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות יבשים לילה על ידי הצבת אותם במהופך על מגבות על גבי הספסל הסמוך לכיסויי שהכותרת המתאימים שלהם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מושבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר המושבות גדלו ורדומות בכל הטוב אחרי 6 ימים של דגירה, צביעה וייבוש. ספירת מושבות בצורה אופטימלית ב40X ההגדלה במיקרוסקופ לעומת שלב הפוך. ספירת מושבות של&gt; 30 תאים כגדלו ומושבות של 12 או פחות תאים, עם המראה המורפולוגי של גודל גדול מאוד בהשוואה לexpa גדל תאים, גדולציטופלסמה nded עם ציטופלסמה הגדולה לגרעין יחסים, שמוצגים באיור 1 7,15. הערה: אשכולות של 13-29 תאים בדרך כלל לא נספרו כמו שהם לא מאוד תכופים במבחני תרדמת פשוטים. הם ניתן לספור אם הפרעות להעביר את פוטנציאל הצמיחה של שני תאי גידול או רדומים. אז תוצאות אלו צריכה להיות מתואמות עם משמעות ביולוגית. </li></ol></li></ol> 2. clonogenic דגירה לImmunofluorescence לימודים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם מספרים סלולריים לכ 7,500-8,000 תאים / גם ב 6 צלחות גם, למתאימים לתא מספרים / שטח דומה לניסויים גם 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עגול,, להחליק לכסות מצופה פיברונקטין סטרילי לכל בסיס גם של 6 צלחות גם למחקרי הדמיה לפני בנוסף תא. תאי Pipet ב 3 מיליליטר כרכים לתוך זה גם 2 בארות בכל פעם בריכוזים התוו, כפי שתואר עבור ניסויי clonogenic לעיל ב1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאיםבמשך 6 ימים, כאמור לעיל וב1.2.4 1.2.5. להוסיף גורמים מדאיגים ביום 3 ב10x ריכוזים בכרכי μl 300, כפי שמתואר בנהלי assay המושבה ב1.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם על יום 6 עם נוגדנים לתא מולקולות הדבקה כגון α4 integrins, α5, α6, β1, β3, למשל, מולקולות מורכבות הידבקות מוקד FAK, paxillin וvinculin, למשל, חלבונים מעורבים בתנועתיות כגון α-טובולין, לדוגמא, חברי מסלול איתות כגון phospho-AKT, phospho-ERK, phospho-p38, phospho-JNK, למשל, או כל חלבון אחר שהוא היעד של חקירה לתפקידה בתרדמת, תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית עבור ישיר או עקיף מכתים immunofluorescence. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שקופיות עם יום מלקחיים 6. תיקון באצטון / מתנול 1: 1 ב -20 ° C במשך 20 דקות ואוויר יבש. מקבע חלופי, כגון paraformaldehyde, ניתן להשתמש, במידת צורך. תאי Permeabilize עם 0.1% X-100, נתרן ציטרט 0.1% טריטון לו 2 דקותאו זיהוי של אנטיגנים תאיים. לשטוף את התאים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים immunofluorecence עקיף, שקופיות בלוק עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר עם BSA 5% או 10% בסרום preimmune מהמינים שבנוגדנים משני נוצרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הלילה ב 4 ° C עם נוגדנים ראשוניים לתא מולקולות הדבקה, מולקולות מורכבות מוקדי, איתות חברי מסלול או כל חלבון אחר שהוא היעד של חקירה לתפקידה בתרדמת בדילול לדילולים ספציפיים מומלצים על ידי היצרן בPBS 0.1% Triton X -100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים עם PBS. דגירה התלושים לכסות עם נוגדני fluorophor מצומדות- בטמפרטורת חדר למשך שעה 2. כדוגמא, אלקסה פלואוריד 488 אנטי עכבר IgG נוגדנים חמורים יכולים לשמש כדי לזהות נוגדנים חד שבטיים עיקריים עכברי. הר coverslips צד תא על שקופיות זכוכית באמצעות סוכן antifade עם DAPI. חותם את היקפה עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לimmunofluorescence הישיר, לבצע את BSAחסימה כאמור ב2.4.2), דגירה עם נוגדן ראשוני fluorophor מצומדות- הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף 3 פעמים עם PBS. דגירה השקופיות עם סוכן antifade וDAPI וחותם עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגשי שקופיות מכסים ברדיד האלומיניום ולאחסן ב 4 ° C להדמיה וצילום בכל עת עד כמה שבועות לאחר מכן. תאי צפייה וצילום באמצעות כל מערכות הדמיה מיקרוסקופיות הקרינה מצוידת במצלמה ב1,000x הגדלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים אקטין סיבי, שקופיות בלוק ב 1% אלבומין בסרום שור (BSA) למשך 30 דקות ודגירה בBODIPY FL-Phallacidin (ירוק) או phalloidin Rhodamine (אדום) בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. הוסף סוכן antifade ולאטום כאמור לעיל. </li></ol></li></ol> 3. clonogenic דגירה למחקרים מולקולריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתמים מערביים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ER + תאי סרטן שד MCF-7 או T47D בצפיפויות clonogenic של / 100 מ&quot;מ צלחת 20,000 תאים / 60 צלחת מ&quot;מ ו50,000 תאים בfibronecצלחות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 מצופי פח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים בצפיפויות גבוהות מעט יותר של 75,000 תאים / 100 מ&quot;מ צלחת למחקרים מולקולריים הדורשים כמויות מ&quot;ג לחלבון מlysates. השתמש עד עשר צלחות לכל נקודה ניסיונית כדי לאסוף מספיק חלבון ללימודים מולקולריים באמצעות כתמים מערביים או לבידוד RNA לכתמי צפון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת ג&#39;ל על בסיס מספר התא היא תוספת הכרחית להשוואת ביטוי חלבון בתאי גידול ורדום בגדלים שונים בהרבה. איסוף תאים על ידי trypsinizing ולספור aliquot בhemocytometer ב0.2% trypan הכחול להכנת lysates לכתמים מערביים במקום מגרד את התאים עם להב קצה אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב 10,000 XG למשך 2 דקות, להסיר את התקשורת על ידי שאיפה, להוסיף 200 חיץ תמוגה μl, sonicate התאים במאגר תמוגה ולקבוע את ריכוז החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את כמות חלבון לכל תא על ידי חלוקת תשואת החלבון במספר התאיםשנוצר סכום זה. טען את lysate לבאר כל ג&#39;ל polyacrylamide הנפרד שמייצג שני) כמויות שווה של חלבון וב) כמויות חלבון המייצגות מספרים סלולריים שווי ערך. לפחות 25 מיקרוגרם חלבון צריך להיות טעון לתוך כל אחד. הערה: זה יאפשר השוואות בין תאי גידול והרדומים, שהם שונים באופן משמעותי בגודל ותכולת חלבון (איור 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים מצלחות 100 מ&quot;מ על ידי trypsinization, כמו ב3.1 ולנתח על ידי תא הקרינה סטנדרטי הופעל מיון פרוטוקולים (FACS) באמצעות מכתים immunofluorescence ראשוני או המשני לשני אנטיגנים תאיים או תאיים, כפי שתואר ב2.4. הערה: ניתוק תאים מצלחות תרבית רקמה על ידי trypsinization אינו משפיע על הריכוז של חלבונים בממברנה, כפי שנקבע על ידי תיוג נוגדן. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Braun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratin-positive+cells+in+the+bone+marrow+and+survival+of+patients+with+stage+I,+II,+or+III+breast+cancer.">Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer.</a> N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).</li><li>Benoy, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+microvessel+area+of+the+primary+tumour,+and+not+lymph+node+status,+predicts+the+presence+of+bone+marrow+micrometastases+detected+by+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+in+patients+with+clinically+non-metastatic+breast+cancer.">Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer.</a> Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).</li><li>Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inverse+relationship+between+microvessel+counts+and+tumor+volume+in+breast+cancer.">The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer.</a> Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).</li><li>Wyckoff, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+step+in+metastasis:+in+vivo+analysis+of+intravasation+at+the+primary+tumor.">A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor.</a> Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).</li><li>Phadke, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+metastatic+breast+cancer+cell+trafficking+in+bone.">Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone.</a> Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).</li><li>Braun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+an+effect+of+adjuvant+chemotherapy+on+the+elimination+of+single+dormant+tumor+cells+in+bone+marrow+of+high+risk+breast+cancer+patients.">Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients.</a> J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).</li><li>Korah, R., Boots, M., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;5&#946;1+promotes+survival+of+growth-arrested+breast+cancer+cells:+an+in+vitro+paradigm+for+breast+cancer+dormancy+in+bone+marrow.">Integrin &#945;5&#946;1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow.</a> Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).</li><li>Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavopiridol+blocks+integrin-mediated+survival+in+dormant+breast+cancer+cells.">Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells.</a> Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).</li><li>Braun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pooled+analysis+of+bone+marrow+micrometastasis+in+breast+cancer.">A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer.</a> N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).</li><li>Dent, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer:+clinical+features+and+patterns+of+recurrence.">Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence.</a> Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).</li><li>Kim, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dormancy+signatures+and+metastasis+in+estrogen+receptor+positive+and+negative+breast+cancer.">Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer.</a> PLoS One. 7 (4), e35569 (2012).</li><li>Hanin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+invisible:+how+mathematical+models+uncover+tumor+dormancy,+reconstruct+the+natural+history+of+cancer,+and+assess+the+effects+of+treatment.">Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment.</a> Adv in Exp Med &amp; Biol. 734, 261-282 (2013).</li><li>Wilkie, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+mathematical+models+of+cancer-immune+interactions+in+the+context+of+tumor+dormancy.">A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy.</a> Adv in Exp Med &amp; Biol. 734, 201-234 (2013).</li><li>Barkan, D., Green, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+to+study+tumor+dormancy+and+the+switch+to+metastatic+growth.">An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth.</a> J Vis Exp. (54), e2914 (2011).</li><li>Barrios, J., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+FGF-2+and+intergrin+&#945;5&#946;1+signaling+mediate+GRAF-induced+RhoA+inactivation+in+a+model+of+breast+cancer+dormancy.">Dual FGF-2 and intergrin &#945;5&#946;1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy.</a> Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).</li><li>Ganapathy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+breast+cancer+metastasis+is+dependent+on+estrogen+signaling.">Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling.</a> Clin &amp; Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).</li><li>Barkan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+metastatic+outgrowth+from+single+dormant+tumor+cells+by+targeting+the+cytoskeleton.">Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton.</a> Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).</li><li>Ghajar, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perivascular+niche+regulates+breast+tumour+dormancy.">The perivascular niche regulates breast tumour dormancy.</a> Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).</li><li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inhibition+of+the+lysophosphatidic+acid+receptor+1+on+metastasis+and+metastatic+dormancy+in+breast+cancer.">Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer.</a> J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).</li><li>Almog, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+regulatory+pathways+involved+in+persistence+of+dormant+micro-tumors.">Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors.</a> Adv in Exp Med &amp; Biol. 734, 3-17 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+FGF+causes+growth+arrest+in+MCF-7+human+breast+cancer+cells+while+inducing+both+mitogenic+and+inhibitory+G1+events.">Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events.</a> Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).</li><li>Fenig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transforming+growth+factor+beta+in+the+growth+inhibition+of+human+breast+cancer+cells+by+basic+fibroblast+growth+factor.">Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor.</a> Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).</li><li>Fenig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+confers+growth+inhibition+and+Mitogen-activated+Protein+Kinase+activation+in+human+breast+cancer+cells.">Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells.</a> Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).</li><li>Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+temporal+and+spatial+gene+expression+of+fibroblast+growth+factor+family+members+during+mouse+mammary+gland+development.">Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development.</a> Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).</li><li>Plath, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+localization+of+members+of+the+fibroblast+growth+factor+family+in+the+bovine+mammary+gland.">Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland.</a> J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).</li><li>Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+evidence+of+basic+fibroblast+growth+factor+action+in+mouse+mammary+gland+development.">In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development.</a> FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).</li><li>Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+localization+of+growth+factors+during+mammary+gland+development.">Expression and localization of growth factors during mammary gland development.</a> Adv in Exp Med &amp; Biol. 480, 19-27 (2000).</li><li>Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+FGF-2+promotes+differentiation+in+T47-D+breast+cancer+cells.">Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells.</a> Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).</li><li>Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-ordinate+loss+of+FGF-2+and+laminin+5+expression+during+neoplastic+progression+of+mammary+duct+epithelium.">Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium.</a> Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).</li><li>Wieder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+basic+fibroblast+growth+factor+in+MCF-7+human+breast+cancer+cells:+lack+of+correlation+between+inhibition+of+cell+growth+and+MAP+kinase+activation.">Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation.</a> J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).</li><li>Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+release+of+basic+fibroblast+growth+factor+from+human+bone+marrow+cultures+as+a+biologically+active+complex+with+a+phosphatidylinositol-anchored+heparan+sulfate+proteoglycan.">Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan.</a> J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).</li><li>Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+stimulates+myelopoiesis+in+long-term+human+bone+marrow+cultures.">Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures.</a> Blood. 77 (5), 954-960 (1991).</li><li>Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblast+heparan+sulfate+is+required+for+cytokine-mediated+ex+vivo+maintenance+of+human+long-term+culture-initiating+cells.">Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells.</a> Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).</li><li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farnesyl+transferase+inhibitor+treatment+of+breast+cancer+cells+leads+to+altered+RhoA+and+RhoC+GTPase+activity+and+induces+a+dormant+phenotype.">Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype.</a> Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).</li><li>Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+confers+a+more+differentiated+phenotype+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells.">Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells.</a> Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes &amp; Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li><li>Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+dormant+estrogen-dependent+breast+cancer+micrometastases+by+bone+marrow+stromal+injury+in+an+in+vitro+model+of+dormancy.">Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy.</a> Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , (2014).</li></ol>

נתמך על ידי משרד הגנה מענקי DAMD17-01-C-0343 וDAMD17-03-1-0524, נציבות מדינת ניו ג&#39;רזי בחקר הסרטן 02-1140-CCR-E0 ורות Estrin גולדברג הזיכרון לחקר הסרטן (RW)

המודל שלנו מורכב ממספר אלמנטים המרכזיים של תרדמת במח העצם. זה מורכב של אסטרוגן תאים רגישים, שהם הסוג צפוי להישאר רדום במוח לפרקי זמן ממושך 10, זה מורכב של פיברונקטין, אלמנט מבני עיקרי של מוח, FGF-2, גורם גדילה מסונתז בשפע על ידי סטרומה מח העצם והופקד בכבדות במטריקס ש?...

תאי סרטן שד גרורות למוח העצם לפני שהמחלה היא 1 לזיהוי, ברגע שגידולים קטנים לפתח כלי דם 2,3. התהליך גרורתי הוא מהיר אבל לא יעיל. תאים להיכנס לכלי הדם החדשים במהירות, במיליון ליום 4 אבל כמה לשרוד את המסע לאיברים מרוחקים 5. עם זאת, כמה micrometastases לשרוד בעצמות ובניתן למצוא כתאים בודדים או גושי תא קטנים בaspirates מח עצם של חולים שאובחנו לאחרונה 1. תאים אלה להתנגד כימותרפיה אדג&#39;ובנט, המנוהלת למטרה מאוד של חיסולם 6. התנגדות זו היא ניחן, באופן משמעותי, על ידי הישרדות איתות ביוזמת אינטראקציות עם מייקרו-סביבת מח עצם 7,8. ניתן למצוא Micrometastases בכשליש מהנשים עם סרטן השד מקומי ומייצג מחוון עצמאי של הישרדות כאשר נותח על ידי ניתוח שונה 9. microme חלקtastases הוא צמיחה יזם, אבל דפוסי הישנות תלויים בסוג התא. חולים עם סרטן השד שלילי משולש נוטים לחזור על עצמה בין 1 עד 4 שנים, המצביעה על שליטה על עניי המצב הרדום. סוגי תאים אחרים, כוללים ER / PR + תאים, יכולים להישאר רדומים במשך עד 20 שנים, עם קצב קבוע, מתמשך של הישנות 10. בעוד הבדלים בחתימות ביטוי גני תרדמת בין ER + וקווי ER- שד תא וגידולים משקפים פוטנציאל תרדמת שונה 11, אינטראקציות עם סטרומה מח עצם עשויים לייצג תרומה משמעותית לתרדמת. המחקר של תרדמת in vivo הוא קשה במיוחד כי micrometastases הם נדירים ועלו במספרם על ידי תאי hematopoietic על ידי יותר מ 10 6 -fold. לפיכך, מודלים רלוונטיים חייבים להיות שנוצרו המספקים נתונים במבחנה שיכול להציע מנגנונים וליצור השערות הניתנות לבדיקת in vivo. מספר דגמי תרדמת, כולל מתמטי עבור מערךמודלים מתמטיים 12,13, במבחנה מודלים 7,8,14,15, המודלים xenograft in vivo 16, שילובים של במבחנה ומודלי xenograft 17,18 ומודלי גידול וגרורים ספונטניים 19, הניבו כמה תובנות תאים סרטניים תרדמת 20 . בכל אחד מהמודלים האלה המגבלות שלהם והם בעצמם בעיקר שימושיים ליצירת השערות בנוגע לאיתות ואינטראקציות ששולטות תרדמת להיבדק במודלים יותר מבחינה ביולוגית מולקולריות רלוונטיים. עם המטרה הכללית של הגדרת המנגנונים המולקולריים של תרדמת, אינטראקציות עם מייקרו-הסביבה שגורמת לעצירת מחזור, redifferentiation והתנגדות ומנגנונים טיפוליים שתגרומנה לחזרה בER + תאים, שפיתחנו מודל במבחנה שמספקת נבחר אלמנטים רלוונטיים של מייקרו-סביבת סטרומה 7. מודל זה, תוך דליל יחסית בcomponents, הוא מספיק חזק כדי לאפשר לחוקרים להפיק מנגנונים מולקולריים ספציפיים המשפיעים על פונקציות משמעותיות של תרדמת. ניסויים אלה ליצור השערות שניתן לבדוק ישירות in vivo. המודל מסתמך על כמה אלמנטים מרכזיים שהפגנו להיות רלוונטי בתרדמת. הם כוללים את השימוש בתאי סרטן השד תלוי באסטרוגן, התרבות של תאים בצפיפות clonogenic בו האינטראקציה שלהם היא בעיקר בתשתית ורכיבים מסיסים של המדיום, תשתית פיברונקטין ואת הנוכחות של גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (FGF-2) בטווח הבינוני. אנו מאופיינים מנגנונים ששולטים במערכת במבחנה, כולל האינדוקציה של עצירת מחזור התא על ידי FGF-2 21, בתיווך באמצעות 22 TGFβ, הישרדות איתות באמצעות PI3 קינאז 7,8 וERK 8 ובידול morphogenic לפנוטיפ אפיתל, שהיה תלוי ב איון RhoA, integrin45; 5β1 upregulation וקשירה של פיברונקטין סטרומה הישרדות 7,15 (איור 1). האפקטים במבחנה מחזור תא של FGF-2 על MCF-7 תאים מתחילים בריכוזים יומן אחד לפחות מתחת ל -10 ננוגרם / מיליליטר 21,23. הרציונל היה מבוסס על השליטה הזמנית של FGF-2 ביטוי שלטון המורפוגנזה החלב ductal, הרחבה מחזורית ומיתון במספר מערכות יונקים 24-27. אנחנו הוכחנו כי FGF-2 גורם בידול, כוללים המורפוגנזה ductal בתרבות 3D 28, ושFGF-2 ביטוי, בדרך כלל, איבד עם שינוי ממאיר של גידולים אנושיים 29. הביטוי של FGR1 נותר על כנן בקרצינומה של שד שהשתתף בסקר 29 וMCF-7 תאים ממשיכים לבטא את כל 4 קולטני FGF 30. בהקשר של תרדמת, FGF-2 מיוצאים על ידי ושהופקדו בכבדות על סטרומה מח עצם 31,32 שבו מתפקדת בשימור תאי גזע hematopoietic 33. אנו demonstrated שFGF-2 גורם למצב רדום בתאי ER + סרטן השד בתרבית על substrata פיברונקטין, גם בשפע במוח, שם הוא גורם לבידול morphogenic 7. במודל, תאי סרטן השד הם גידול עכבות, להשבית Rho באמצעות גרף RhoGap, redifferentiate לפנוטיפ אפיתל מחדש מפורש lost α5β1 integrins עם התקדמות ממארת. הם נקשרים פיברונקטין דרך α5β1 integrin ולהפעיל הישרדות איתות שהופך אותם עמידים לטיפול ציטוטוקסיות 7,8,15 (איור 1). עיכוב של GTPases כיתת Rho כבר הוכיח בעבר כדי לגרום פנוטיפ רדום 34. כאן אנו מתארים את הנהלים הספציפיים שיאפשר לחוקרים לקבוע את המודל ולחקור מנגנונים מולקולריים ותאיים ספציפיים המסדירים תרדמת של תאי ER + סרטן השד. בניסויים שהוצגו כאן כדי להמחיש את השימוש במודל, אנו ממוקדים מסלול PI3K (איור 1) עם מעכב Akt ומעכב PI3K וכל בני משפחת Rho (איור 1) עם מעכב פאן-רו וRho קינאז מעכב (סלע).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MCF-7 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T47D cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well tissue culture plate</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>50-013-PB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Serum Source International</td>
			<td>FB02-500HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 100x, Liquid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF&#160;basic</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>234-FSE-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>124005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY294002&#160;</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>19-142</td>
			<td>Chenical PI3K inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C3 transferase&#160;</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>CTO3</td>
			<td>Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>129830-28-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY FL-Phallacidin (green)&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>B607</td>
			<td>Fluorochrome for fibrillar actin staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>R415</td>
			<td>Fluorochrome for fibrillar actin staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>R37114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro dormancy model of estrogen-sensitive breast cancer in the bone marrow: a tool for molecular mechanism studies and hypothesis generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

<html> ניסויים שנערכו כדי לשחזר את assay. במהלך הניסוי הזמן מוצג באיור 2 א. תאים טופחו על צפיפות clonogenic ביום -1, FGF-2 במדיום חדש מתווסף ביום 0 ותאים בתרבית עד שהיום 6 כאשר הם מוכתמים ומושבות נספרות. כל הפרעות למערכת מנוהלות ביום 3 ב100 כרכי μl ב10x ריכוזים סופיים רצוי. אי?...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation at JoVE.co

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

<em&gt; במבחנה</em&gt; תרדמת דגם של סרטן השד רגיש לאסטרוגן במוח העצם: כלי ללימודי מנגנון מולקולרי והשערת דור

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

an-vitro-dormancy-model-estrogen-sensitive-breast-cancer-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Medicine

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

8.2K Views.  Rutgers New Jersey Medical School. We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo. 

Video: An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

במבחנה מערכת לחקר תרדמת גידול ואת החלף ל גידול גרורתי

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

רב מודלי הדמיה של אנגיוגנזה מודל עכברים עירום של גרורות סרטן השד עצם באמצעות דימות תהודה מגנטית, טומוגרפיה ממוחשבת נפחית ו אולטראסאונד

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

הקרנה למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

באמצעות PCR כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי Murine מח עצם השתלה

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo לשעבר vivo גישות לחקר סרטן השחלות גרורתי התיישבות של מבני ספוט החלב בהצפק שומני

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

ניצול של assay כינונה רך אגר מושבה לזיהוי מעכבי tumorigenicity בתאי סרטן השד

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...