המחברים מודים M. Fiche של בית החולים של האוניברסיטה של ​​לוזאן למתן תמונת מאמופלסטית, מ &#39;וא&#39; וירט Ayyanan של שוויצרי מכון לחקר הסרטן ניסויי, המרכז הלאומי של יכולת המחקר המולקולרית אונקולוגיה, בית הספר למדעי חיים, אקול פוליטכניק הפדרלי דה לוזאן לקבלת סיוע טכני ור &#39;קלארק מאוניברסיטת מנצ&#39;סטר להערות ביקורתיות. המחקר שיוביל לתוצאות אלה קיבל תמיכה מSNF3100A0-112090, Oncosuisse 531,817, ותרופות היוזמה המשותפת ההתחייבות החדשנית תחת הסכם מענק לא. 115,188, משאבים אשר מורכבים מתרומה כספית מהתכנית של האיחוד האירופי מסגרת השביעית (FP7 / 2007-2013) ופדרציה האירופית של חברות תעשיות פרמצבטיות ועמותות &#39;בתרומה נדיבה. כתובת האינטרנט של תרופות חדשניות יוזמה היא <a href="http://www.imi.europa.eu/" target="_blank">http://www.imi.europa.eu/.</a> &lt;/ P&gt;

שיקולים כלליים: לפני הזמן, להגדיר פרוטוקול אתיקה, להכין שאלונים לחולים, ותראו להכשרת כוח האדם הקליני. לפני השימוש בחומר מניתוח מאמופלסטית הפחתה, להשיג אישורים, ולהבטיח את הסכמת מטופל. רקמה עשויה להיות מדבקת וצריכה להיות מטופל בהתאם. פרוטוקול זה אושר על ידי ועדת האתיקה של ISREC - שוויצרי מכון לחקר הסרטן ניסויי. 1. רקמות שחזור, עיבוד וביו-בנקאי על מנת להבטיח איכות מדגם אופטימלית ליו-בנקאי, מספר הצעדים מתבצעים בבית החולים לפני הובלה למעבדה. בבית החולים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג רקמות שד אנושיות בתנאים סטריליים מדגימות ניתוח מאמופלסטית ההפחתה ודם, במידת צורך. רקמה צריכה להיבדק על ידי פתולוג שידגום להוציא נוכחות של נגעים ממאירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את t השדלהוציא מתחת למכסת המנוע על לוח סטרילי ולהכין מספריים, סכין מנתחים כירורגים ומלקחיים שכבר מעוקרים עם מעקר קיטור. הפוך חתך עמוק באתרים של רקמת החלב שונים באמצעות אזמל כדי לפתוח אותו. ברקמת שד אנושית לחפש גדילים לבנים המורכב מצינורות ואוניות, שמוטמעים ברקמת שומן צהובה. הערה: היחס של parenchymal הלבן לרקמת השומן הצהובה שונה בקרב נשים; בדרך כלל יש לי נשים צעירות רקמת האפיתל יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חתיכות של חומר לבן ולהחזיק אותם עם מלקחיים, ולאחר מכן להפריד ביניהם בעדינות מרקמת השומן במספריים. להימנע מנטילת כלי דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתיכות שטיפה של רקמות שבנאגרו מלוח פוספט pH (PBS) 7.2 להסיר דם. העברת הרקמה לבקבוקי פלסטיק המכילים 250 מיליליטר בינוני F12 (F12 בינוני של הנשר השתנה Dulbecco) ללא פנול אדום עם 2% פניצילין / סטרפטומיצין (כולל יחידה 5000 / פניצילין מיליליטר ו5,000 g / ml סטרפטומיצין) ו% 1tibiotic / amphotericin B (כולל 10,000 יחידות / מיליליטר פניצילין, 10,000 מיקרוגרם / מיליליטר של סטרפטומיצין, ו -25 מיקרוגרם / מיליליטר של amphotericin B). רקמות חנות במדיום להובלה למעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חתיכות של 3 - קוטר 5 מ&quot;מ להפקת RNA וחלבון ופלאש להקפיא אותם בcryovials עם איזופנטאן הקר (קרח יבש). העבר אותם לתיבת קרח יבשה לתחבורה למעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים חתיכות של 3 - 5 מ&quot;מ לתוך תבנית ולכסות אותו בשכבה של טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) ולאחר מכן למקם את התבנית בתחתית שטוחה קופסא מלאה באיזופנטאן הקר של. לאחר הקפאה מוחלטת להעביר את התבנית לתיבת הקרח היבשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן 5 חתיכות של 3 - 5 מ&quot;מ קוטר בparaformaldehyde (PFA) 4% ו -5 חתיכות אחרת בפורמלדהיד (FA) 4% ב- ​​PBS בניתוח היסטולוגית RT מאוחר יותר. שני fixatives שונה מומלץ כחלק מהנוגדנים לעבוד טוב יותר עם אחד או האחר של שתיים. </li></ol> במעבדה: <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האםcument את כל המידע על מאמופלסטית ההפחתה, מועד הניתוח והאם הדגימות נגזרים משמאל לעומת שד ימני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימות קפואות ב -80 ° C ולהעביר את הרקמות קבועות לקלטות היסטולוגיה לאחר שעה 2 של קיבעון. ואז לשים אותם גם בPBS או אתנול 70%, לO / אחסון N ב 4 מעלות צלזיוס. ביום שלמחרת, להעביר את קלטות היסטולוגיה למתקני היסטולוגיה להטבעת פרפין. </li></ol> 2. רקמות עיכול והורמוני גירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הבקבוקים המכילים דגימות רקמה לזרימה למינרית בחדר תרבית תאי P2. מניחים חתיכות רקמה על לוח סטרילי הקיצוץ (29 x 19 סנטימטרים). החזק את החומר עם מלקחיים ולגרד את השומן וכלי נותר מparenchyma השד (חלק לבן) עם אזמל. הנח את החומר הלבן בPBS בצלחת תרבות 10 סנטימטרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת החומר השומני מכל החלקים והשלכתם על פי הכלל הבטיחותים של המעבדה, למקם את החלקים הלבנים המכילים את רקמות אפיתל חזרה על קרש החיתוך. באמצעות אזמלים מנוגדים לחתוך את הרקמה וקוצץ אותו לחתיכות בקוטר של עד 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את החומר הטחון לתוך צינורות בגודל מתאים: עד 1, 2.5 ו -10 מיליליטר ל5, 15 או 50 מיליליטר צינורות, בהתאמה. בדרך כלל תשואות צינור 5 מיליליטר מספיק חומר לגירויי embedment פרפין והורמון, ותשואות 15 מיליליטר צינור מספיק חומר לסלולרי קרינה המופעל מיון (FACS). צינורות גדולים יותר משמשים להקפאת aliquots. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת עיכול אדון בהיקף של מדיום (DMEM / F12 ללא פנול אדום) עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין / amphotericin B וCollagenase (Clostridiopeptidase מhistolyticum Clostridium). מנת collagenase לפי זמני עיכול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך 12, 24, ו -36 שעות של דגירה, להשתמש בריכוז סופי של collagenase של 1.5 מ&quot;ג / מיליליטר, 1.0 מ&quot;ג / מיליליטר ומ&quot;ג 0.5 / בהתאמה מ&quot;ל. להוסיף תערובת אמן עיכול עד 4 פעמים בנפח של החומר מתעכל כדי להבטיח אוורור נאות ותסיסה. הערה: בהתאם לתכנון ניסוי ואת משך הזמן של גירוי הורמונלי, להוסיף הורמונים או במהלך או לאחר התאוששות צעד העיכול ומייקרו האנזימטית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף הורמון (ים) בריכוז רצוי כדי לבדוק את הדגימות והרכב לשליטה. לגירוי עם 17-β-אסטרדיול, וpromegestone (R5020) להשתמש ריכוז סופי של 20 ננומטר. הערה: R5020 הוא אגוניסט קולטן פרוגסטרון סינטטי, שהוא יציב יותר מפרוגסטרון הטבעי במדיום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום צינורות על מיקסר רולר בתוך חממה ב 37 מעלות צלזיוס ו -40 O סל&quot;ד / N. לפני הצבת הדגימות במיקסר, resuspend אותם היטב כדי להבטיח שכל החומר מפיץ לאורך צינורות צנטריפוגה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעיכול לוקח לפחות 12 שעות (O / N), לפעמי גירוי הורמון של שעות פחות מ -12, להוסיף את ההורמונים לאחר ההתאוששות של microstructures (deזנב תחת שלב 3). הוסף את ההורמונים כמו שאתה resuspend microstructures ולמקם את ההשעיה על צלחות מצורפים נמוכות במיוחד. יכולה להיות כל הזמן microstructures רקמות על צלחות נמוכות במיוחד מצורפים לתקופה של עד 7 ימים במדיום גידול-ללא גורם שימור כדאיות כ -70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לRNA וניתוח חלבון, לאסוף microstructures רקמה על ידי צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות והקפאת הבזק בצינורות צנטריפוגה. </li></ol> 3. שחזור של Microstructures רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות הצינור (ים) ב 400 XG במשך 5 דקות. לשאוב השומן מהחלק העליון של צינור צנטריפוגות ולהעביר את supernatant של supernatant המימי שנותר, שהוא מועשר בfibroblasts, לצינור צנטריפוגות חדש וצנטריפוגות ב 1250 XG במשך 5 דקות. הערה: ככל שmicrostructures רקמת השד היא מאוד דביקה, את כל הצעדים הבאים resuspend גלולה בעדינות על ידי התססה הצינור. Pipetting אינו מומלץ בשל הסיכון של אובדן חומר. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורים מועשרים בmicrostructures ובfibroblasts נגזר מsupernatant המימי בPBS, 2% עגל סרום עוברי (FCS). בהמשך לכך ספין שני הצינורות ב1,250 XG במשך 5 דקות ולאחר מכן למחוק את supernatants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורים ב 3 - 5 מיליליטר מאגר תמוגה תאי דם אדום ולהעביר אותם לניקוי צינורות. דגירתם במשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח 2x של PBS, 2% FCS ו צנטריפוגות ב1,250 XG במשך 5 דקות. לשטוף את כדורים עם PBS, 2% FCS ו צנטריפוגות ב 1250 XG במשך 5 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים. </li></ol> 4. דוגמאות לcytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1-2 מיליליטר טריפסין 0.25% לגלולה ולערבב אותו על ידי pipetting מעלה ומטה בעדינות במשך 2 דקות עם pipetman 1,000 μl לנתק תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכב פעילות טריפסין ידי הוספת 9 מיליליטר PBS, 2% FCS. צנטריפוגה ב 450 XG במשך 5 דקות ו resuspend גלולה ב 10 מיליליטר PBS, 2% FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה התא על מסננת תא 40 מיקרומטר מונחת על top של צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר להכין תאים בודדים. אם כמה מיקרוליטר של השעיה תא להישאר בחלק העליון של המסנן, לעזור להם לעבור את הסינון על ידי aspirating מהצד השני של מסננת האחר עם pipet ולהוסיף אותם לmicrostructures המסוננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדני תאי חיסון נפרדים, fibroblasts ותאי האנדותל מmicrostructures עם קוקטייל של אנטי-CD45, אנטי-FAP ואנטי-CD31 ולאחר מכן למיין אותם עם FACS, המבוססים על EpCAM פאן-אפיתל סמן CD10 ולהפריד תאי luminal ובסיס בהתאמה 10 . </li></ol> 5. דוגמאות להיסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפת החומר מתעכל באופן מכאני ואנזימים כפי שתואר לעיל, לתקן כדורים מחומר ראשוני 1.5 מיליליטר ב 1 מיליליטר של 4% PFA PBS ב RT למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב1,250 XG במשך 5 דקות ולשטוף עם 1-2 מיליליטר PBS פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 16,000 במשך 10 דקות. במהלך תקופה זו, להכין 1% רב תכליתי agarose בטריס-אצטט-EDTA (טה) חיץ ולחמם את הפתרון במיקרוגל עד הפתרון מגיע לרתיחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון מתנור המיקרוגל ולערבל את הבקבוק בעדינות לתערובת הפתרון וresuspend כל חלקיקי agarose שנותרו. פתרון agarose מגניב עד 50 ° C ויוצקים 1 מיליליטר בעובש בסיס פרפין בגודל 31 × 23 × 13.5 מ&quot;מ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ומניח את כדורים על גבי השכבה המוצקה (1 - 3 מ&quot;מ) של agarose בעזרת מרית עם קצה שטוח. לכסות את כולם עם שכבה נוספת של agarose (40 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose המבצרת, בדרך כלל תוך 5 דקות, לשים בלוקים agarose לקלטות היסטולוגיה לembedment פרפין. יחד עם דגימות agarose למקם נייר משרדי לבן בקלטת עם כל המידע על מספר מאמופלסטית ההפחתה, תנאי ניסוי, ותאריך כתוב באותיות קטנות בעיפרון; כתיבת שורות אלה עומדים בכל צעדי הטיפול עוקבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הקלטות בPBS O / N, או ב -70% אתנול לאחסון בסוף השבוע, בשעה 4 מעלות צלזיוס. לא שם לב כל הבדל בין שני פתרונות האחסון. לאחר מכן להעביר את קלטות היסטולוגיה למתקני היסטולוגיה להטבעת פרפין. </li></ol> 6. Microstructures הקפאה (עתיד Culturing) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microstructures רקמות הגלולה בהקפאה בינונית בהיקף של FCS עם sulfoxide דימתיל 10% (DMSO) ולהקפיא 1 מיליליטר aliquots בcryovials. מספר cryovials השיג תלוי בכמות של חומר ראשוני המתקבל מהפחתת מאמופלסטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את cryovials המכיל microstructures רקמות באמצעות מקפיא קצב מבוקר עם התכנית הבאה: 5 דקות מגורים על 4 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה יורד ל-7 ° C עם שיעור של 6 מעלות צלזיוס / min, ומקטין את הטמפרטורה ל -12 מעלות צלזיוס עם שיעור של 6 מעלות צלזיוס / min, 10 דקות מגורים, ומקטין את הטמפרטורה ל -40 מעלות צלזיוס עם שיעור של 6 מעלות צלזיוס / min, ירידה בטמפרטורה ל -80 מעלות צלזיוס עםשיעור C / min 6 מעלות. לאחר מכן להעביר את cryovials למקפיא -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להעביר את cryovials מ-80 ° C למכל חנקן נוזלי לאחסון ארוך. </li></ol>

<ol>
	<li>Beral, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+and+hormone-replacement+therapy+in+the+Million+Women+Study.">Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study.</a> Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).</li><li>MacMahon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+at+first+birth+and+breast+cancer+risk.">Age at first birth and breast cancer risk.</a> Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).</li><li>Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Hormonal'+risk+factors,+'breast+tissue+age'+and+the+age-incidence+of+breast+cancer.">'Hormonal' risk factors, 'breast tissue age' and the age-incidence of breast cancer.</a> Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).</li><li>Brisken, C., O'Malley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+action+in+the+mammary+gland.">Hormone action in the mammary gland.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).</li><li>Levenson, A. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF-7:+the+first+hormone-responsive+breast+cancer+cell+line.">MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line.</a> Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).</li><li>Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+and+PR+signaling+nodes+during+mammary+gland+development.">ER and PR signaling nodes during mammary gland development.</a> Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).</li><li>Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-dependent+tissue-specific+gene+expression+in+mammary+epithelial+cells+requires+both+physical+and+biochemical+signal+transduction.">Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).</li><li>Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell:+influence+of+extracellular+matrix+composition+and+organization+during+development+and+tumorigenesis.">Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis.</a> Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).</li><li>Graham, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+licensing+and+progenitor+numbers+are+increased+by+progesterone+in+normal+human+breast.">DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast.</a> Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comment+on+&#34;Progesterone/RANKL+is+a+major+regulatory+axis+in+the+human+breast&#34;.">Comment on &#34;Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast&#34;.</a> Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).</li><li>Brisken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+signalling+in+breast+cancer:+a+neglected+hormone+coming+into+the+limelight.">Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight.</a> Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).</li><li>Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+architecture+and+function:+dynamic+reciprocity+via+extra-+and+intra-cellular+matrices.">Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices.</a> Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).</li><li>Tanos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone/RANKL+is+a+major+regulatory+axis+in+the+human+breast.">Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast.</a> Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).</li><li>Yalcin-Ozuysal, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+roles+of+Notch+and+p63+in+controlling+mammary+epithelial+cell+fate.">Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate.</a> Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).</li><li>Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+out+the+FACS:+a+devil+in+the+details.">Sorting out the FACS: a devil in the details.</a> Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

תרבות vivo לשעבר המתוארת כאן מספקת microstructures רקמת שד המכילה צינורות שלמים ואוניות, יחד עם סוגי תאים אחרים בדרך כלל נמצאים בחזה הנשי האנושי. בעיבוד של רקמת השד האנושית בדרך כלל מתקבלת מmammoplasties ההפחתה, הסרת רקמת שומן, עיכול מכאני והאנזימטית של מטריצת סטרומה, ותמוגה של ...

A correction was made to <a href="/video/52436">An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast</a>. There was an error with the author, Marie Shamsheddin&#39;s, name. The author&#39;s name has been corrected to:
Marie Shamseddin
instead of:
Marie Shamsheddin

A correction to the author list has been made for the article <a href="/video/52436">An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast</a>.

Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

מידע על נוף מוטאציות בסרטן השד גדל בקצב מהיר. פחות תשומת לב הוקדשה לגורמים מערכתיים המשפיעים על התפתחות סרטן השד. חשיפה להורמוני רבייה יש השפעה משמעותית על התקדמות מחלה 1-3. עם זאת, המנגנונים שבאמצעותם הורמוני רבייה לפגוע בשד האנושי הם הבינו היטב. עבודה עם מודלים של עכברים מהונדסים גנטי גילתה כי הם כרוכים איתות פנימית ואוטוקריני תא באמצעות מספר effectors במורד הזרם 4. הידע המוגבל על פעולת הורמונים בשד האנושי הוא במידה רבה מיוחס לחוסר מודלים נאותים. רוב העבודה על המנגנונים של קולטן אסטרוגן (ER) וקולטני פרוגסטרון איתות (PR) שבוצעה עם קווי קולט הורמון חיוביים סרטן שד תא, כגון MCF-7 וT47D. אלה נגזרים מיפליטו פלאורלי מחולים עם סרטן השד מתקדם שהיה לי already קיבל טיפולים מרובים 5. רלוונטי הביולוגית של ממצאים במבחנת מודלים פשוטים כל כך של השד האנושי הוא גנים מפוקפקים ויעד שזוהו במודלים אלה במבחנה הם שונים מגני היעד שמזוהים במודלים של בעלי חיים 6. כאשר תאי אפיתל שד אנושי ראשוני בתרבית במבחנה הם נוטים לאבד את ביטוי קולט הורמון ולכן תגובת הורמון 7,8. בעיה זו ניתן circumventd על ידי גישות 3D מתוחכמות באמצעות matrigel. בדרך זו, סי קלארק ועמיתים הצליחו להקים תאי האפיתל שד שנשמרו ביטוי קולט הורמון והראה תגובת שגשוג לפרוגסטרון גירוי 9. ובכל זאת, שתי חשובים בגנים המטרה קולטני פרוגסטרון vivo, Wnt-4 וRANKL, לא נגרם על גירוי פרוגסטרון במערכת זו 9. גישה זו צולמה לאחרונה על עוד עם במבחנה </em&gt; טיפול מקדים הורמון ואינדוקצית RANKL הושג 10. אזהרה היא שיש matrigel פעילויות שהן אצווה תלויות, היא יקר, ודורשת תכנון ניסוי כי הוא מתאים למספרים סלולריים קטנים בלבד. בהתבסס על הממצא שבER vivo ואיתות יחסי הציבור מתווכים במידה רבה על ידי אינטראקציות אוטוקריני 11, אנחנו טענו שאינטראקציות בין תאית צריכה להישמר. גורם חשוב נוסף שהולך לאיבוד כרקמות הם ניתקו לתאים בודדים לתרבות במבחנה הן האינטראקציות של תאי האפיתל במטריצה ​​תאית; אך אלה הם קריטיים לבידול אפיתל ושיבושם חשוב ביצירת גידולים 12. עם זה בחשבון, הקמנו שיטה לבודד microstructures רקמת שד מחומר שנזרק כירורגית טרי 13. Parenchyma השד, בהיקף של אפיתל שני שכבות עם luminal הפנימי וחיצוני myoepitheliתאי אל, הוא גזורים מרקמת שומן ונתונים לניתוק מכאני והאנזימטית. לאחר הכביסה וצנטריפוגה, שברי צינורות החלב מתקבלים ששומרים אינטראקציות קרובות עם הרבה תאי סטרומה. microstructures רקמות אלה יישאר הורמון תגובה. המודל היה תוקף בדגימות קליניות 13. ככזה, ההליך הנוכחי יכול לעזור ללמוד פעולת הורמון בשד בהקשר ביולוגי ורלוונטי מבחינה קלינית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:164px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:260px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:335px;">Microlitre Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Heraeus Biofuge Fresco</td>
			<td style="width:119px;">75005521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:164px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810 000.327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cryobox</td>
			<td style="width:164px;">Nalgene&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:335px;">Controlled Rate Freezer EF600 Grant</td>
			<td style="width:164px;">Asymptote&#160;</td>
			<td style="width:119px;">EF600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:164px;">Hera Cell Heraeus</td>
			<td style="width:119px;">51022391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Roller Mixer SRT9D</td>
			<td style="width:164px;">Sturt</td>
			<td style="width:119px;">SRT9D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Histology Cassettes</td>
			<td style="width:164px;">Medizintechnik</td>
			<td style="width:119px;">81-0021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cell Strainer</td>
			<td style="width:164px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Strile Surgical Blade&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td>BB536&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scalpel</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BB084R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BD047R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scissors</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BC374R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Paraffin base mold</td>
			<td style="width:164px;">SAKURA</td>
			<td style="width:119px;">4166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix</td>
			<td style="width:164px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:119px;">6769006</td>
			<td style="width:260px;">Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DMEM F/12</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td>Prewarm (37&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Collagenase</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11 088 793 001</td>
			<td>Prewarm (37&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Can be replaced with Fetal Calf Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cell Blood Lysis Buffer</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Agarose</td>
			<td style="width:164px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:164px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Isopentane</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ethanol</td>
			<td style="width:164px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1009831000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cryogenic vials (5.0ml)&#160;</td>
			<td style="width:164px;">VWR, International</td>
			<td style="width:119px;">479-0820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Ultra low attachment culture dish</td>
			<td style="width:164px;">Corning, NY 14831</td>
			<td style="width:119px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo model to study hormone action in the human breast

מחקר פעולה של הורמונים בשד האנושי כבר הקשו על ידי היעדר מערכות מודל הולמים. על התרבות במבחנה, תאי אפיתל החלב ראשוניים נוטים לאבד ביטוי קולט הורמון. נרחב שורות תאי סרטן השד חיובי קולט הורמון המשמשות הן רלוונטיות מוגבלות למצב in vivo. כאן אנו מתארים מודל vivo לשעבר ללמוד פעולת הורמון בשד האנושי. דגימות טריות אנושיות רקמת שד מחומר שנזרק כירורגית כגון mammoplasties הפחתה או mammectomies הם מכניים ואנזימים מתעכלים להשיג שברי רקמה המכילים צינוריות ואוניות וסוגים שונים של תאי סטרומה. microstructures הרקמות אלה המשיכו במדיום בסיסי ללא גורמי גדילה לשמר הקשר בין תאיתם, מבנה הרקמה, ולהישאר הורמון מגיב במשך כמה ימים. הם מעובדים בקלות לRNA ומיצוי חלבון, ניתוח היסטולוגית או מאוחסנים בהקפאה בינונית. הקרינהמיון תא פעיל (FACS) ניתן להשתמש כדי להעשיר לאוכלוסיות תאים ספציפיות. פרוטוקול זה מספק גישה פשוטה, סטנדרטית ללימודי translational עם דגימות מורכבות ביותר, מגוונות אנושיות.

כדי ללמוד את התפקיד של אסטרוגנים ופרוגסטרון ולהבין טוב יותר את התפקידים המולקולריים שלהם בשד האנושי, אנו אוספים דגימות רקמת שד אנושיות טריות מחולים שעברו mammoplasties הפחתה (איור 1) לאחר קבלת ההסכמה מהדעת שלהם. אנחנו גם לקבל היסטוריה של החולים רפואי ורבייה, כמו גם...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast at JoVE.com

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

פיתחנו מודל vivo לשעבר רומן ללמוד פעולת הורמון בשד האנושי. היא מבוססת על microstructures הרקמה מבודדת מדגימות רקמת שד ניתוחיות המשמרות מבנה רקמה, אינטראקציות בין תאית, ואיתות אוטוקריני.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

an-ex-vivo-model-to-study-hormone-action-in-the-human-breast

Research

JoVE Journal

Medicine

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

11.3K Views.  Ecole polytechnique fédérale de Lausanne.  פיתחנו מודל vivo לשעבר רומן ללמוד פעולת הורמון בשד האנושי. היא מבוססת על microstructures הרקמה מבודדת מדגימות רקמת שד ניתוחיות המשמרות מבנה רקמה, אינטראקציות בין תאית, ואיתות אוטוקריני. 

Video: An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

סמנים ביולוגיים במודל חיה לחשיפה קושרת עצבית, המטולוגית, והתנהגות של PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

האדם תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווים כמו מודל תלת ממדי לחקר הטיפול האנושי גידול נוירואנדוקריניים

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

אדם<em&gt; Ex Vivo</em&gt; טרשת רובד מודל ללמוד ביולוגיה נגע

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

אדם Dupuytren של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות לחקר myofibroblasts והתאי מטריקס האינטראקציות

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

שיטות לExplants רקמות Culturing עצם ירך האדם ללמוד התיישבות תאי סרטן השד גרורתי של הנישה

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo לשעבר vivo גישות לחקר סרטן השחלות גרורתי התיישבות של מבני ספוט החלב בהצפק שומני

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to establish human enteroid ex vivo culture systems are important to model intestinal pathophysiology and to study the particular cellular responses involved. In recent years, enteroids from mice and humans are being cultured, passaged, and banked away for future use in several laboratories across the world. This enteroid platform can be used to test the effects of various treatments and drugs and what effects are exerted on different cell types in the intestine. Here, a protocol for establishing primary stem cell-derived small intestinal enteroids derived from neonatal mice and premature human intestine is provided. Moreover, this enteroid culture system was utilized to test the effects of species-specific breast milk. Mouse breast milk can be obtained efficiently using a modified human breast pump and expressed mouse milk can then be used for further research experiments. We now demonstrate the effects of expressed mouse, human, and donor breast milk on the growth and proliferation of enteroids derived from neonatal mice or premature human small intestine.

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

This protocol describes how to establish an enteroid culture system from neonatal mouse or premature human intestine as well as an efficient method to collect milk from mice.

חלב מגבירה את הצמיחה של Enteroids: מודל לשעבר Vivo של התפשטות תאים

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...