Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

1. Klonogentest <ol><li> Bereiten Sie eine Einzelzellsuspensionen von Östrogen-abhängigen Brustkrebs-Zelllinien MCF-7 und T47D-Zellen unter Verwendung der unten angegebenen Schritte, <ol><li> Saugen Sie das Kulturmedium (DMEM / 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum / Glutamin und Pen / Strep) von einer 10 cm Gewebekulturschale, die nicht mehr als 50% konfluent mit MCF-7 oder T-47D-Zellen ist. Spülen mit PBS. Inkubieren mit Trypsin 0,25% / 2,21 mM EDTA in DMEM mit hohem Glucose gelöst bei 37 ° C für 1-4 min. </li><li> Prüfzellen in 1-Minuten-Intervallen unter einem Phasenkontrastmikroskop, um eine einzelne Zellverteilung zu gewährleisten. Resuspendieren der Zellen mit einer 2 ml-Pipette durch Auf- und Abpipettieren mehrmals, um Zell-Zell-Kontakt unterbrechen, um eine fast unveränderlich, einzelne Zelle Status zu erreichen. </li><li> Weiterhin Zellen bei 37 ° C für 4 min inkubieren in Trypsin, wenn Sie Zellklumpen nach nur 2 min Inkubation zu beobachten. Verwenden Sie diese Zellen für die klonogenen Studien, wenn sie haft e bleibenach andere nach 4 min von Trypsinierung, weil Fehler in der Kolonie Nummer Ertrag eingebracht werden. HINWEIS: Wenn Zellen verklumpten, wird die Anzahl der gebildeten Kolonien des Produkts von weniger Zellen als die Anzahl inkubiert reflektieren. Wenn Zellen übermßig trypsiniert, kann ihr klonogenen Potential vermindert. </li><li> Vorbereitung einer Einzelzellsuspension von 1.500 Zellen / ml Kulturmedium für 24-Well-Platten oder weniger (+ 500 Zellen / ml, abhängig von dem Zelltyp oder einen Durchgang-Zahl), durch serielle Verdünnungen in einem Master Rohr das gesamte Volumen von Nöten alle Variablen in dem Experiment. ANMERKUNG: Das Ziel ist eine endgültige Zelldichte von 800 Zellen / cm 2 (im Bereich von ca. 500 bis 1.100 Zellen / cm 2). Das Ziel ist, auf etwa 100 + 50 Kolonien zu erhalten, die relativ einfach Zählung ermöglicht, verhindert Verdrängung und ermöglicht ausreichend Kolonien in statistisch signifikanten Differenzen im Kolonien werden erhöht oder verringert experimentellen perturbagen. </li></ol></li><li> Inkubieren Zellen bei Klonogene Density Mit skizzierten Schritte <ol><li> Zellen in vierfachen Vertiefungen auf 24-Well-Fibronektin-beschichtete Platten bei einem klonogenen Dichte von 1500 Zellen / Well von einer Master-Einzelzellsuspension Rohr von 1.500 Zellen / ml. Man reibt das Medium, das Zellen mit einer 5 ml Pipette durch Aufziehen 3 ml und Abgabe 1 ml Medium in jeder der 2 Brunnen. HINWEIS: Fibronectin-beschichteten Platten sollten gekauft vorbeschichtet werden von einem kommerziellen Anbieter. Lackplatten außerhalb eines Qualitäts gesteuert automatisierten Prozess führt zu einer unebenen Oberfläche ungeeignet für diesen Test. </li><li> Mischen Sie die Suspension durch Auf- und Abpipettieren mit einer 5 ml Pipette erarbeiten 3 ml Zellsuspension und füllen 2 Brunnen mit je 1 ml. Füllen Sie nur 2 Brunnen zu einem beliebigen Zeitpunkt von einer Pipette. Schicken Sie das Restvolumen in der Pipette zu der Zellsuspension in der Master-Rohr, Die Zellen wiederum durch Auf- und Abpipettieren und stellt weitere 3 ml, um eine andere 2 wel füllenls mit je 1 ml. HINWEIS: Das kontinuierliche Mischen des Masterrohr ist erforderlich, da Zellen kontinuierlich zu sedimentieren. Die Zusammenstellung einer ausreichenden Menge, um nur 2 Brunnen zu füllen ist notwendig, um ähnliche Zellzahlen in jede Vertiefung hinzufügen, weil Zellen sedimentieren in der Pipette als auch. </li><li> Arbeiten schnell, um die großen Mengen an Zellen zu verteilen, da ermöglicht den Zellen in Suspension bei Raumtemperatur und der CO 2 -Konzentration sitzen ihre klonogenen Potential (unveröffentlichte Beobachtungen) modulieren. </li><li> Optimieren Sie die räumliche Verteilung der Zellen während der Akt der Pipettieren sie in Brunnen für Kolonie-Assays. Dies geschieht durch langsam Pipettieren der Suspension, die die endgültige Zellkonzentration in der Mitte der Vertiefung. Die Platte, um die Bewegung weiterer Gegenstand nicht vor Zellen am Boden absetzen. Die Platte wirbeln Sie nicht, weil Kreismisch effektiv die Zellen, um den Umfang der auch die Schaffung hohe Zelldichten und unzählige konfluente Kolonien Zentrifuge bei 6 Tage. HINWEIS: wenn es nicht notwendig mischen, da dies überhaupt nach der Einführung die Lautstärke mit den Zellen in Suspension weniger wünschenswert als keine Vermischung. Wenn es notwendig ist, um Zellen zu mischen, dies durch Bewegen der Platte vor und zurück in senkrechten Richtungen, während es auf einer flachen Oberfläche aufliegt. </li><li> Zellen bei 37 ° C 5% CO 2 inkubieren ohne Medienwechsel für 6 Tage. Die geringe Zahl von Zellen in einem Bohrloch nach 6 Tagen nicht signifikant beeinflussen den Nährstoff oder Zytokin Zusammensetzung noch den pH-Wert des Originalmediums. </li><li> Entwerfen der zeitliche Verlauf des Assays wie folgt: Zellen, die auf Fibronectin beschichteten Substrate am Tag 1. Inkubieren Ersetzen bestehender Medium mit 1 ml frischem Medium oder frischer Medium enthaltend FGF-2 10 ng / ml am Tag 0 Stain-Zellen am Tag 6 nach unten in 1.4). Durchzuführen keine experimentellen Störungen an Tag 3, wie unten in 1.3). </li></ol></li><li> Einrichten Experimental Störungen der molekularen Signal oder Adhäsionsmoleküle <ol><li> An Tag 3 werden 10056; l einer Lösung, die 10-fach von dem geplanten Konzentration der störenden Mittels zu dem 1 ml Medium in den Vertiefungen. Nicht zu verwechseln. Weiterhin die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für weitere 3 Tage inkubiert. HINWEIS: Stören Mittel können eine Vielzahl von Inhibitoren und Blockierungsmittel Adhäsionsmoleküle, Rezeptoren oder andere Oberflächenproteine, Inhibitoren der intrazellulären Signalwegen, Moleküle, Faktoren, Co-Faktoren oder strukturellen Proteinen, die Rollen bei der Unterstützung des Ruhezustand spielen können, umfassen. </li><li> Flecken Kolonien am Tag 6, wie folgt. </li></ol></li><li> Stain Colonies <ol><li> Flecken Zellen nach 6 Tagen in Kultur mit einer frisch hergestellten 0,1% Kristallviolett in 2% Ethanol / 10 mM Natriumborat (pH 9,0) Lösung. Saugen Sie Medien und fügen Sie eine ml Kristallviolett-Lösung in jede Vertiefung für 20 Minuten. </li><li> Waschplatten, indem sie mit den Öffnungen nach unten und in einem spitzen Winkel in einem Eiskübel überfüllt mit kontinuierlich fließendem LeitungseintauchenWasser in der Spüle. Kippen Sie die Platte an einem horizontalen Winkel einmal unter Wasser, auch die Öffnung nach unten und dann nach hinten neigen, um einen spitzen Winkel beim Entfernen in einem sanften fließenden Bewegung. </li><li> Wiederholen der Eint 2 oder 3 mal, bis das Wasser auf dem Boden der Vertiefungen ist nicht mehr blau. Kräftiges Waschen kann Zellen oder Kolonien, die aufgrund der experimentellen Eingriff weniger haft sind, was eine um wesentlich zu dem Fehler in Zählung und der Daten. </li><li> Dry Platten über Nacht, indem sie den Kopf auf Handtücher auf der Tischplatte angrenzend an die entsprechenden markierten Abdeckungen. </li></ol></li><li> Graf Colonies <ol><li> Zählen die Anzahl der wachsenden und ruhenden Kolonien in jeder Vertiefung nach 6 Tagen Inkubation Färbung und Trocknen. Graf Kolonien optimal bei 40-facher Vergrößerung in einem umgekehrten Phasenkontrastmikroskop. Zählen Kolonien von&gt; 30 Zellen wachsen und Kolonien von 12 Zellen oder weniger, mit dem morphologischen Erscheinungsbild sehr groß im Vergleich zum Züchten von Zellen, große expaNDED Cytoplasma mit großen Cytoplasma in Verhältnissen, die in 1 gezeigten Kern 7,15. HINWEIS: Cluster von 13 bis 29 Zellen werden in der Regel nicht gezählt, da sie nicht sehr häufig in einfachen Ruhe Assays. Sie können angerechnet werden, wenn Störungen verschieben das Wachstumspotenzial der entweder wachsen oder ruhenden Zellen. Diese Ergebnisse müssen dann mit biologischer Bedeutung korreliert werden. </li></ol></li></ol> 2. Klonogene Inkubation für Immunfluoreszenz-Studien <ol><li> Einzustellen Zellzahlen ungefähr 7,500-8,000 Zellen / Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen zu entsprechen Nummern / Oberfläche analog 24 Vertiefungen Experimente Zelle. </li><li> Platzieren Sie einen runden, sterile, Fibronektin-beschichtete Deckglas in jede Vertiefung Basis des 6-Well-Platten für die bildgebenden Untersuchungen vor der Zelle hinaus. Pipette Zellen in 3 ml Volumina in jede Vertiefung 2 Vertiefungen in einer Zeit in Konzentrationen ausgeführt, wie bei den obigen Experimenten klonogenen in 1.2 beschrieben). </li><li> Inkubieren Zellenfür 6 Tage, wie oben in 1.2.4 und 1.2.5. Hinzuzufügen Störfaktoren am Tag 3 bei 10-facher Konzentration in 300 ul-Volumina, wie sie in den Kolonie-Assay-Verfahren in 1.3 beschrieben). </li><li> Stain-Zellen am Tag 6 mit Antikörpern gegen Adhäsionsmoleküle wie Integrine α4, α5, α6, β1, β3 zB focal adhesion komplexe Moleküle FAK, paxillin und Vinculin Zelle, zum Beispiel, Proteine ​​der Motilität beteiligt, wie α-Tubulin B. Signalweg Elemente, wie Phospho-Akt, Phospho-ERK, Phospho-p38, Phospho-JNK, zum Beispiel, oder jedes andere Protein, das das Ziel der Untersuchung für seine Rolle in der Ruhe ist, unter Verwendung von Standard-Techniken zur direkten oder indirekten Immunfluoreszenzfärbung. <ol><li> Folien mit einer Pinzette entfernen Tag 6. Fix in Aceton / Methanol 1: 1 bei -20 ° C für 20 min und der Luft trocknen. Eine alternative Fixiermittel wie Paraformaldehyd, verwendet werden, falls erforderlich. Permeabilisieren Zellen mit 0,1% Triton X-100, 0,1% Natriumcitrat 2 min foder den Nachweis von intrazellulären Antigenen. Zellen mit PBS waschen. </li><li> Für indirekte immunofluorecence Färbung Blockobjektträger 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 5% BSA oder mit 10% Serum vor der Immunisierung von der Spezies, in welcher der sekundäre Antikörper erzeugt wurde. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 4 ° C mit primären Antikörpern gegen Adhäsionsmoleküle Brenn komplexe Moleküle Zelle Signalweg Elemente oder andere Protein, das das Ziel der Untersuchung für seine Rolle in der Ruhe auf spezifische Verdünnungen vom Hersteller empfohlenen Verdünnung in PBS 0,1% Triton X -100. </li><li> Mit PBS waschen 3 Mal. Deckgläser mit Fluorophor-konjugierten Antikörpern Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Als ein Beispiel kann Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus-IgG-Antikörper verwendet, um Maus monoklonalen primären Antikörper nachzuweisen. Berg Deckgläser Zellseite nach unten auf Glasobjektträger unter Verwendung eines Antifade Mittel mit DAPI. Verschließen Sie die Umfänge mit Nagellack. </li><li> Für direkte Immunfluoreszenz, die Durchführung der BSAwie oben in 2.4.2) Blockieren, Inkubation mit Fluorophor-konjugierte primäre Antikörper über Nacht bei 4 ° C. Mit PBS waschen 3 Mal. Inkubieren Sie die Objektträger mit einer Antifade Mittel und Dapi und Dichtung mit Nagellack. </li><li> Schutzglasschalen mit Aluminiumfolie und bei 4 ° C für die Bildgebung und Fotografie jederzeit bis zu mehreren Wochen später. Ansehen und Foto-Zellen unter Verwendung beliebiger fluoreszenzmikroskopischen Bildgebungssysteme mit einer Kamera ausgestattet an 1,000x Vergrößerung. </li><li> Für fibrilläres Aktinfärbung Block gleitet in 1% Rinderserumalbumin (BSA) für 30 Minuten und Inkubieren in BODIPY FL-Phallacidin (grün) oder Rhodamin-Phalloidin (rot) bei Raumtemperatur für 20 min. Fügen Sie einen Antifade Mittel und Dichtung wie oben. </li></ol></li></ol> 3. Klonogene Inkubation für Molekulare Studien <ol><li> Western Blots <ol><li> Inkubieren ER + Brustkrebszellen MCF-7 oder T47D auf klonogenen Dichten von 20.000 Zellen / 60 mm Platte und 50.000 Zellen / 100 mm Platte auf fibronecZinn-beschichteten Platten bei 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Inkubieren Zellen bei etwas höheren Dichte von 75.000 Zellen / 100 mm Platte für molekulare Studien erfordern mg Mengen für Protein aus Lysaten. Verwenden Sie bis zu zehn Platten pro Versuchspunkt, um ausreichend Protein für molekulare Studien unter Verwendung von Western-Blots oder für RNA-Isolierung für Northern Blots zu sammeln. </li><li> Zellzahl anhand Gelbeladung ist eine notwendige Ergänzung für den Vergleich der Proteinexpression in beträchtlichem Ausmaß unterschiedlich große wachsenden und ruhenden Zellen. Sammle die Zellen durch Trypsinisierung und zählen ein Aliquot in einem Hämozytometer in 0,2% Trypan Blau zur Herstellung von Lysaten für Westernblots statt Abschaben der Zellen mit einer einzigen Kante Klinge. </li><li> Centrifuge Zellen bei 10.000 × g für 2 Minuten, entfernen Medien durch Aspiration, fügen Sie 200 ul Lysepuffer, beschallen die Zellen in Lysepuffer und bestimmen die Proteinkonzentration. </li><li> Berechnen der Menge an Protein pro Zelle durch Teilen der Proteinausbeute durch die Anzahl der Zellendaß die Menge erzeugt. Laden des Lysates in jede Vertiefung einer separaten Polyacrylamidgelen, die sowohl a) äquivalente Mengen des Proteins, und b) Proteinmengen, die äquivalente Zellzahlen darstellt. Mindestens 25 ug Protein sollte in jede Vertiefung geladen. Hinweis: das Vergleichen zwischen wachsenden oder ruhenden Zellen, die in der Größe und der Proteingehalt (Figur 1) sind signifikant verschieden zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Durchflusszytometrie <ol><li> Sammeln Zellen von 100-mm-Platten durch Trypsinierung, wie in 3.1 und analysiert durch Standardfluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Protokolle, die primäre oder sekundäre Immunfluoreszenzfärbung für entweder intrazelluläre oder extrazelluläre Antigene, wie in Abschnitt 2.4 beschrieben. HINWEIS: Abnehmen Zellen aus Gewebekulturplatten durch Trypsinisierung beeinflußt nicht die Konzentration von Membranproteinen, wie durch Antikörpermarkierung bestimmt. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Braun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratin-positive+cells+in+the+bone+marrow+and+survival+of+patients+with+stage+I,+II,+or+III+breast+cancer.">Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer.</a> N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).</li><li>Benoy, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+microvessel+area+of+the+primary+tumour,+and+not+lymph+node+status,+predicts+the+presence+of+bone+marrow+micrometastases+detected+by+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+in+patients+with+clinically+non-metastatic+breast+cancer.">Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer.</a> Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).</li><li>Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inverse+relationship+between+microvessel+counts+and+tumor+volume+in+breast+cancer.">The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer.</a> Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).</li><li>Wyckoff, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+step+in+metastasis:+in+vivo+analysis+of+intravasation+at+the+primary+tumor.">A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor.</a> Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).</li><li>Phadke, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+metastatic+breast+cancer+cell+trafficking+in+bone.">Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone.</a> Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).</li><li>Braun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+an+effect+of+adjuvant+chemotherapy+on+the+elimination+of+single+dormant+tumor+cells+in+bone+marrow+of+high+risk+breast+cancer+patients.">Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients.</a> J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).</li><li>Korah, R., Boots, M., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;5&#946;1+promotes+survival+of+growth-arrested+breast+cancer+cells:+an+in+vitro+paradigm+for+breast+cancer+dormancy+in+bone+marrow.">Integrin &#945;5&#946;1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow.</a> Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).</li><li>Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavopiridol+blocks+integrin-mediated+survival+in+dormant+breast+cancer+cells.">Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells.</a> Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).</li><li>Braun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pooled+analysis+of+bone+marrow+micrometastasis+in+breast+cancer.">A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer.</a> N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).</li><li>Dent, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer:+clinical+features+and+patterns+of+recurrence.">Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence.</a> Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).</li><li>Kim, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dormancy+signatures+and+metastasis+in+estrogen+receptor+positive+and+negative+breast+cancer.">Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer.</a> PLoS One. 7 (4), e35569 (2012).</li><li>Hanin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+invisible:+how+mathematical+models+uncover+tumor+dormancy,+reconstruct+the+natural+history+of+cancer,+and+assess+the+effects+of+treatment.">Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment.</a> Adv in Exp Med &amp; Biol. 734, 261-282 (2013).</li><li>Wilkie, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+mathematical+models+of+cancer-immune+interactions+in+the+context+of+tumor+dormancy.">A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy.</a> Adv in Exp Med &amp; Biol. 734, 201-234 (2013).</li><li>Barkan, D., Green, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+to+study+tumor+dormancy+and+the+switch+to+metastatic+growth.">An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth.</a> J Vis Exp. (54), e2914 (2011).</li><li>Barrios, J., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+FGF-2+and+intergrin+&#945;5&#946;1+signaling+mediate+GRAF-induced+RhoA+inactivation+in+a+model+of+breast+cancer+dormancy.">Dual FGF-2 and intergrin &#945;5&#946;1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy.</a> Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).</li><li>Ganapathy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+breast+cancer+metastasis+is+dependent+on+estrogen+signaling.">Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling.</a> Clin &amp; Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).</li><li>Barkan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+metastatic+outgrowth+from+single+dormant+tumor+cells+by+targeting+the+cytoskeleton.">Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton.</a> Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).</li><li>Ghajar, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perivascular+niche+regulates+breast+tumour+dormancy.">The perivascular niche regulates breast tumour dormancy.</a> Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).</li><li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inhibition+of+the+lysophosphatidic+acid+receptor+1+on+metastasis+and+metastatic+dormancy+in+breast+cancer.">Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer.</a> J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).</li><li>Almog, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+regulatory+pathways+involved+in+persistence+of+dormant+micro-tumors.">Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors.</a> Adv in Exp Med &amp; Biol. 734, 3-17 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+FGF+causes+growth+arrest+in+MCF-7+human+breast+cancer+cells+while+inducing+both+mitogenic+and+inhibitory+G1+events.">Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events.</a> Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).</li><li>Fenig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transforming+growth+factor+beta+in+the+growth+inhibition+of+human+breast+cancer+cells+by+basic+fibroblast+growth+factor.">Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor.</a> Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).</li><li>Fenig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+confers+growth+inhibition+and+Mitogen-activated+Protein+Kinase+activation+in+human+breast+cancer+cells.">Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells.</a> Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).</li><li>Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+temporal+and+spatial+gene+expression+of+fibroblast+growth+factor+family+members+during+mouse+mammary+gland+development.">Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development.</a> Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).</li><li>Plath, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+localization+of+members+of+the+fibroblast+growth+factor+family+in+the+bovine+mammary+gland.">Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland.</a> J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).</li><li>Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+evidence+of+basic+fibroblast+growth+factor+action+in+mouse+mammary+gland+development.">In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development.</a> FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).</li><li>Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+localization+of+growth+factors+during+mammary+gland+development.">Expression and localization of growth factors during mammary gland development.</a> Adv in Exp Med &amp; Biol. 480, 19-27 (2000).</li><li>Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+FGF-2+promotes+differentiation+in+T47-D+breast+cancer+cells.">Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells.</a> Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).</li><li>Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-ordinate+loss+of+FGF-2+and+laminin+5+expression+during+neoplastic+progression+of+mammary+duct+epithelium.">Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium.</a> Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).</li><li>Wieder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+basic+fibroblast+growth+factor+in+MCF-7+human+breast+cancer+cells:+lack+of+correlation+between+inhibition+of+cell+growth+and+MAP+kinase+activation.">Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation.</a> J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).</li><li>Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+release+of+basic+fibroblast+growth+factor+from+human+bone+marrow+cultures+as+a+biologically+active+complex+with+a+phosphatidylinositol-anchored+heparan+sulfate+proteoglycan.">Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan.</a> J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).</li><li>Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+stimulates+myelopoiesis+in+long-term+human+bone+marrow+cultures.">Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures.</a> Blood. 77 (5), 954-960 (1991).</li><li>Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblast+heparan+sulfate+is+required+for+cytokine-mediated+ex+vivo+maintenance+of+human+long-term+culture-initiating+cells.">Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells.</a> Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).</li><li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farnesyl+transferase+inhibitor+treatment+of+breast+cancer+cells+leads+to+altered+RhoA+and+RhoC+GTPase+activity+and+induces+a+dormant+phenotype.">Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype.</a> Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).</li><li>Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+confers+a+more+differentiated+phenotype+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells.">Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells.</a> Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes &amp; Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li><li>Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+dormant+estrogen-dependent+breast+cancer+micrometastases+by+bone+marrow+stromal+injury+in+an+in+vitro+model+of+dormancy.">Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy.</a> Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , (2014).</li></ol>

Unterstützt durch das Department of Defense Grants DAMD17-01-C-0343 und DAMD17-03-1-0524, die New Jersey State Kommission für Cancer Research 02-1140-CCR-E0 und der Ruth Estrin Goldberg Memorial für Krebsforschung (RW)

Unser Modell besteht aus mehreren Schlüsselelemente der Vegetationsruhe im Knochenmark besteht. Es besteht aus Östrogen empfindlichen Zellen, die die Art wahrscheinlich ruhend im Mark längere Zeiträume 10 zu bleiben, sie besteht aus Fibronectin, einem wichtigen Strukturelement der Mark, FGF-2, ein Wachstumsfaktor reichlich durch die Knochenmarkstroma synthetisierten und stark in der extrazellulären Matrix von Knochenmark 31,32 und Inkubation der Zellen bei klonogenen Dichte wo ihre Wechselwirk...

Brustkrebszellen zu metastasieren in das Knochenmark vor der Erkrankung nachweisbar 1, sobald kleine Tumore entwickeln Blutgefße 2,3. Die metastasierendem Verfahren ist schnell, aber ineffizient. Zellen, geben Sie die neuen Blutgefäße schnell, zu Millionen pro Tag 4, aber nur wenige überleben die Reise zu entfernten Organen 5. Dennoch gibt es einige Mikrometastasen zu überleben in den Knochen und kann als einzelne Zellen oder kleine Zellklumpen in Knochenmarkaspirate von neu diagnostizierten Patienten 1 gefunden werden. Diese Zellen wider adjuvante Chemotherapie, die für den Zweck der Beseitigung von ihnen 6 verabreicht wird. Dieser Widerstand wird dotiert, im Wesentlichen durch das Überleben Signalisierung durch Wechselwirkungen mit dem Knochenmark-Mikroumgebung 7,8 eingeleitet. Mikrometastasen in etwa ein Drittel der Frauen mit lokalem Brustkrebs gefunden werden und stellen ein unabhängiges Indikator für das Überleben, wenn sie von univariaten Analyse 9 analysiert. Einige micrometastases sind Wachstum eingeleitet, aber Wiederholungsmuster sind abhängig von Zelltyp. Patienten mit triple negativem Brustkrebs neigen dazu, zwischen 1 bis 4 Jahre wiederkehren, was auf schlechte Kontrolle über die schlafenden Zustand. Andere Zelltypen, einschließlich ER / PR + Zellen können für bis zu 20 Jahre ruhend bleiben, mit einem stetigen, kontinuierlichen Rezidivrate 10. Während Unterschiede in der Keimruhe Genexpressionssignaturen zwischen ER + und ER- Brustzelllinien und Tumoren spiegeln unterschiedliche Ruhepotentiale 11, Interaktionen mit Knochenmarkstroma wahrscheinlich einen bedeutenden Beitrag zur Keimruhe. Das Studium der Keimruhe in vivo ist außerordentlich schwierig, weil Mikrometastasen sind selten und werden zahlenmäßig von blutbildenden Zellen um mehr als 10 6 -fach. Daher müssen entsprechende Modelle erzeugt werden, die in-vitro-Daten, die Mechanismen vorschlagen, und erzeugen überprüfbare Hypothesen in vivo unterbieten sind. Eine Reihe von Ruhe Modelle, darunter matheatika Modelle 12,13, in-vitro-Modellen 7,8,14,15, in vivo-Xenotransplantat-Modelle 16, Kombinationen von in vitro und Xenotransplantatmodellen 17,18 und spontaner Tumormetastasen und Modelle 19, haben einen Einblick in Krebszellruhe 20 ergab . Jedes dieser Modelle haben ihre eigenen Grenzen und sind von sich selbst in erster Linie sinnvoll zur Erzeugung von Hypothesen zur molekularen Signal und Interaktionen, die Ruhephase, um in mehr biologisch relevanten Modellen getestet werden regieren. Mit dem Gesamtziel definiert, die molekularen Mechanismen der Keimruhe, die Wechselwirkungen mit der Mikroumgebung, die in Zyklusarrest, Redifferenzierung und Therapieresistenz und Mechanismen führt, die in Rückfällen bei ER + Zellen führen, ein in vitro-Modell, das ausgewählt relevanten Elemente der bietet entwickelten wir Stroma-Mikroumgebung 7. Dieses Modell, während in seiner Kompo relativ spärlichenten, ist robust genug, um die Ermittler zu ermöglichen, spezifische molekulare Mechanismen, die signifikante Funktionen der Keimruhe beeinträchtigen abzuleiten. Diese Experimente erzeugen Hypothesen, die direkt in vivo getestet werden können. Das Modell stützt sich auf einige Schlüsselelemente, die wir gezeigt, in Keimruhe relevant. Sie umfassen die Verwendung von Östrogen-abhängigen Brustkrebs-Zellen, der Kultur von Zellen in einem klonogenen Dichte wo ihre Wechselwirkung ist hauptsächlich mit der Erde und die löslichen Bestandteile des Mediums, einer Fibronektin-Substrat und das Vorhandensein von basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF-2) im Medium. Wir gekennzeichnet Mechanismen, die das System in vitro regeln, einschließlich der Induktion von Zellzyklusarrest von FGF-2 21, durch TGFß 22 vermittelt wird, das Überleben Signalgebung durch PI3 Kinase ERK 7,8 und 8 und morphogenic Differenzierung zu einer epithelialen Phänotyp, die auf abhing RhoA Inaktivierung Integrin45; 5β1 Hochregulierung und die Ligation von Stromazellen Fibronektin Überleben 7,15 (Abbildung 1). Die in-vitro-Zellzykluseffekte von FGF-2 auf die MCF-7 Zellen beginnen bei Konzentrationen mindestens einer Protokoll unter 10 ng / ml 21,23. Die Begründung wurde auf die zeitliche Steuerung von FGF-2-Expression über Brust-duktales Morphogenese, zyklische Expansion und Rezession in einer Reihe von Säugetiersystemen 24-27 basiert. Wir haben gezeigt, dass FGF-2 induziert die Differenzierung, einschließlich duktalen Morphogenese in 3D-Kultur 28, und dass FGF-2-Expression in der Regel verlor mit malignen Transformation von menschlichen Tumoren 29. Die Expression von FGR1 blieb intakt in befragten 29 und MCF-7 Zellen Mammakarzinomen weiterhin alle 4 FGF-Rezeptoren 30 zum Ausdruck bringen. Im Kontext der Dormanz wird FGF-2 durch exportiert und stark auf Knochenmarkstroma 31,32, wo es bei der Konservierung von Blutstammzellen 33 fungiert abgeschieden. Wir DMonstrated, dass FGF-2 induziert einen Ruhezustand in ER + Brustkrebszellen zu Fibronektin Substraten, auch im Knochenmark, wo es morphogenic Differenzierung 7 induziert reichlich kultiviert. Im Modell Brustkrebszellen sind Wachstum gehemmt wird, inaktivieren Rho A durch die RhoGap GRAF, Redifferenzierung zu einer epithelialen Phänotyp und Re-express Integrine α5β1 lost mit malignen Progression. Sie binden Fibronektin durch Integrin α5β1 und aktiviere das Überleben signalisiert, dass sie resistent gegen zytotoxischen Therapie 7,8,15 (Abbildung 1) zu machen. Hemmung der Rho-GTPasen Klasse wurde bereits gezeigt, dass eine Ruhe Phänotyp 34 induzieren. Hier werden wir die spezifischen Verfahren, die Ermittler erlauben wird, um das Modell zu etablieren und zu studieren spezifischen molekularen und zellulären Mechanismen, die Ruhephase der ER + Brustkrebszellen zu skizzieren. In den Experimenten hier dargestellt, um die Verwendung des Modells veranschauGezielte wir den PI3K-Weg (1B) mit einem Akt-Inhibitor und einem PI3K-Inhibitor und alle Mitglieder der Rho-Familie (1B) mit einem pan-Rho-Inhibitor und einem Rho-Kinase (ROCK) Inhibitor.

<table><tbody><tr><td>MCF-7 cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>T47D cells&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-123</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate</td><td>Corning</td><td>354411</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes</td><td>Corning</td><td>354403</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes</td><td>Corning</td><td>354451</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin</td><td>Corning</td><td>354088</td><td></td></tr><tr><td>6 Well tissue culture plate</td><td>CellTreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder</td><td>Corning Life Sciences</td><td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum</td><td>Serum Source International</td><td>FB02-500HI</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100X</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine, 100x, Liquid</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF&amp;nbsp;basic</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>234-FSE-025</td><td></td></tr><tr><td>Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)</td><td>CalBiochem</td><td>124005</td><td></td></tr><tr><td>LY294002&amp;nbsp;</td><td>CalBiochem</td><td>19-142</td><td>Chenical PI3K inhibitor</td></tr><tr><td>C3 transferase&amp;nbsp;</td><td>Cytoskeleton</td><td>CTO3</td><td>Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>129830-28-2</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY FL-Phallacidin (green)&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>B607</td><td>Fluorochrome for fibrillar actin staining</td></tr><tr><td>BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>R415</td><td>Fluorochrome for fibrillar actin staining</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>R37114</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>P-36931</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro dormancy model of estrogen-sensitive breast cancer in the bone marrow: a tool for molecular mechanism studies and hypothesis generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

<html> Experimente wurden durchgeführt, um den Test zu wiederholen. Der Zeitverlauf des Experiments ist in 2A gezeigt. Die Zellen werden bei klonogenen Dichte am Tag -1 inkubiert wird FGF-2 in frischem Medium am Tag 0 gegeben und die Zellen werden bis zum Tag 6 kultiviert, wenn sie gefärbt sind, und die Kolonien gezählt. Jegliche Störungen in das System werden am Tag 3 in 100 ul-Volumina bei 10-facher Endkonzentration verabreicht gewünscht. 2B veranschaulicht das typische Erscheinun...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation at JoVE.co

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Winterruhe Model of Östrogen-sensitiven Brustkrebs im Knochenmark: Ein Werkzeug für Molecular Mechanism Studien und Hypothesengenerierung

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

an-vitro-dormancy-model-estrogen-sensitive-breast-cancer-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Medicine

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

8.2K Aufrufe.  Rutgers New Jersey Medical School. We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo. 

Serie: An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

Entwicklung eines menschlichen präklinischen Modell der Osteoclastogenesis aus peripherem Blut Monozyten Co mit Brustkrebszelllinien kultiviert

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Forschung

Krebsforschung

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Ein In Vitro System zur Tumor Vegetationsruhe und die Umstellung auf Metastasen Study

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Medizin

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

Dreidimensionale extrazelluläre Matrix Knochenmodell für Osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Models von Knochenmetastasen

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

Orthotope Transplantation von Brusttumoren als präklinische Modelle für Brustkrebs

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Brustepithel- und Endothelzell-Sphäroide als potenzielles funktionelles In-vitro-Modell für die Brustkrebsforschung

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

Verfahren zur Kultivierung humaner Femur Gewebeexplantaten an Brustkrebs Zellbesiedlung des metastasierten Niche Studieren

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Ein

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video