עבודה זו נתמכה על ידי למדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה. Microfabrication בוצע בתמיכה של מתקן מקגיל Nanotools Microfab באוניברסיטת מקגיל ובמחלקה לאלקטרוניקה באוניברסיטת קרלטון.

דם שנאסף מאנשים בריאים באישור ועדת האתיקה של אוניברסיטת אוטווה (H11-13-06). 1. ייצור microchannel Microchannels מיוצרות על בסיס שיטות photolithography הסטנדרטי 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב הגיאומטריה microchannel באמצעות עיצוב תוכנה בעזרת מחשב (CAD) ולהדפיס את התצורה בתמונה-מסכת שקיפות. מסכות אלה הן קריטיות שכן הם מכתיבים את נתיב האור במהלך תהליך הייצור. במקרה זה, את ממדי microchannel 120 מיקרומטר בעובי, 60 מיקרומטר בעומק 7 מ&quot;מ האורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר נקי, מעיל ספין אפוקסי שלילי מבוסס צילום להתנגד על פרוסות סיליקון ב2,000 סל&quot;ד במשך 30 שניות כדי לקבל את העומק הרצוי microchannel (60 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הרקיק והתמונה-מסכה תחת מנורת UV ב 650 mJ / 2 סנטימטר על 70 שניות. ודא לחשוף את האזורים השקופים רק שלצילום המסכה UV-האור. החשיפה של האזורים השקופים מאפשרת לפילמור של הרשתות וכתוצאה מהתקשות של התמונה-להתנגד. לטבול פיסת סיליקון למפתח כדי להסיר את העודפים של תמונה-להתנגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע העובש הוא מפוברק, לערבב אלסטומר מבוסס סיליקון וסוכן ריפוי ביחס של 10: 1 כדי ליצור פתרון של פולי-דימתיל-siloxane (PDMS). שים את פתרון PDMS בתא ואקום לדגה. לשפוך אותו לתוך התבנית ולחמם אותו על 60 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות כדי ליצור microchannels. אז אג&quot;ח הערוצים הבודדים לשקופיות זכוכית באמצעות מליטה פלזמה חמצן למשך 90 שניות. הערה: תהליך דגה PDMS מתבצע על מנת לחסל את בועות האוויר שנוצרו עקב תהליך הערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שמידות microchannel לאפשר לבדיקה מוצלחת. בפרוטוקול זה, יש לי microchannels חתך מלבני של 120 x 60 מיקרומטר. לשם השוואה, יש RBC ממוצע בקוטר של 8 מיקרומטר ועובי של 2 מיקרומטר.refore, רוחב microchannel מספיק להתבונן צבירה נכונה ולקבוע במדויק את פרופילי מהירות. </li></ol> 2. הכנת דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם מתורמים מתנדבים בריאים, לאחר אישור ועדת אתיקה. פנק את הדם עם חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) הנוכחי בצינורות האיסוף (7.2 EDTA מ&quot;ג ב 4 מיליליטר של דם). הערה: EDTA משמש כדי למנוע קרישת דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות הדם שלוש פעמים במשך 10 דקות ב 1400 XG (3,000 סל&quot;ד) על מנת להפריד את מרכיבי הדם. כתוצאה מצנטריפוגה, להתבונן שלוש שכבות נפרדות. הערה: שלוש השכבות הן שכבת RBC (ממוקמת בחלק התחתון של הצינור), המעיל באפי (בהיקף של תאי דם לבנים וטסיות דם הממוקמים בחלק העליון של שכבת RBC) ושכבת הפלזמה (הממוקם בחלקו העליון של כל האחר בוחרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה הראשונה, לאסוף פלזמה דם בעזרת פיפטה דם. הימנע מכל ג<html> ontact עם המעיל באפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ולהשליך את המעיל באפי במכל עם אקונומיקה מדוללת ב 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 3 מיליליטר של pH 7.4 PBS לכל אחד מהצינורות עם שכבת RBC שנותר ולהבטיח האיזון הראוי של צנטריפוגות. לערבב בעדינות את הצינורות וצנטריפוגות שוב ב1,400 XG (3,000 סל&quot;ד) במשך 10 דקות. הערה: ודא שפתרון PBS אינו מכיל מגנזיום או סידן שכן הם יכולים לשנות את הידבקות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך PBS בצינורות לאחר צנטריפוגה השנייה ולהסיר את המעיל באפי שנותר אם קיימים. חזור על שלבים 2.2.3 ו2.2.4 לצנטריפוגה השלישית להניב RBCs הנקי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הסכום הנדרש (0.05, 0.1 ו0.15 מיליליטר) של תאי הדם אדומים הנקי עם פלזמה (0.95, 0.9 ו0.85 מיליליטר) בצינור מיליליטר 1 על מנת לקבל RBC, השעיות עם (5% המתאימים, 10% ו -15% המטוקריט). בדוק hematocrits עם microcentrifuge. </li></ol> 3. נוזלי הכנה = &quot;Jove_content&quot; ילדה&gt; להציג שני נוזלים בY-microchannel הכפול: RBC, ההשעיות וPBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקיקים להוסיף 60 μl של פתרון החלקיקים נותב ניאון (1% מוצקים, ד = 0. 86 מיקרומטר, שרירי בטן λ = 542 ננומטר ופליטת λ = 612 ננומטר) לצינורות RBC-ההשעיה 1 מיליליטר. הערה: החלקיקים נותב הניאון (צבועים פנימי חלקיקי פוליסטירן) משמשות למדידת המהירות של הזרימה בתוך microchannel. חלקיקים אלה לזרוח כאשר הם נחשפים לגל המקביל של קרן הלייזר (ננומטר = λ 542). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון PBS pH 7.4 ולהוסיף 60 μl של אותו פתרון חלקיקים נותב הניאון ב 1 מיליליטר של פתרון PBS. </li></ol> 4. מדידות גודל מצרפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכניס את הנוזלים (RBC, השעיות וPBS) בmicrochannel, להשתמש בשני מזרקים זכוכית של 25 μl 100 μl. רצון זהכדי לעזור להפחית את התאימות של המערכת. חבר את microchannel למזרקים דרך צינורות והמחברים מתאימים חורי הכניסה. מלא את המזרקים הזכוכית באמצעות הבדל הלחץ הקיים בין מיכל הנוזל והמזרק. להבטיח בועות לא קיימים במערכת. כשיטת חלופית, להשתמש במערכת לחץ מבוקר לנהוג שני הנוזלים בmicrochannel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את microchannel על הבמה מיקרוסקופ הפוכה המחוברת למצלמה במהירות גבוהה ומערכת μPIV. תכנית משאבת המזרק לספיקות הרצויות (למשל, ש = 2 μl / שעה לדם מולידה flowrate של Q = μl 8 / שעה לPBS). הערה: רק אחד משאבת מזרק משמש. שימוש בשני מזרקים זכוכית שונים, עם שני קטרים ​​פנימיים שונים, אפשר להשתנות לflowrate נכנסת כל סניף של Y-microchannel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס שני הנוזלים בY-microchannel הכפול כל מסניף כניסה שונה ובflowrates שונה כפי שמוצג ב <stronז&gt; איור 1. על מנת לבחון שיעורי גזירה שונים, לשנות את flowrate המשאבה. זה שומר על אותו היחס המתאים (4 במקרה זה) בין שני הסניפים 19 (איורים 2 ו -3). חכה לזרימה להגיע למצב יציב לפני רכישת המדידות: חזותי לבדוק את תמונות מצלמה במהירות הגבוהה לזרימה חלקה. הערה: היחס הוא קריטי בהשגת פרופיל מהירות ליניארי בתוך שכבת הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין את RBCs שימוש במצלמה במהירות הגבוהה. חבר את המצלמה למחשב כדי לשלוט, להקליט ולשמור את התמונות של זרימת הנוזל. ברגע ששני זורם הנוזל להגיע למצב יציב, להתחיל בהקלטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש כמה תמונות לתוצאות עיבוד טובות יותר. לקבוע זמן חשיפת מצלמה אופטימלי לתמונה ברורה של המצרפים. הערה: חשיפת המצלמה הזמן למקרה זה היה 0.5 msec. הבחירה של מרווח זמן בין כל מסגרת מבוססת על קצב פריימי מצלמה ואת קצב הזרימה בtהוא microchannel. הזמן בין כל מסגרת מעובד בהליך זה היה 60 אלפיות שני. לכן מצלמה מסוגלת להקליט 18 מסגרות לשניות מספיקה. הערה: הימנע מיישוב דם בצינור והמזרק, מה שעלול להוביל למדידות שגויות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שימוש בטכניקות עיבוד תמונה (תכנית MATLAB במקרה זה) לשיפור איכות התמונה, לזהות את אגרגטים בכל אחת מהתמונות המבוססות על עוצמות פיקסל (באיור 4) כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שפר את התמונות בניגוד תוך שימוש בשיטת אקולייזר היסטוגרמה להשיג איכות תמונה טובה יותר לכל מסגרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת התמונות בגווני אפור לתמונות בינארי. לשם כך, נקבע ערך סף, החל 0-1, שמכתיב את ההמרה של כל פיקסל. כל פיקסל בתמונה מתחת לערך הסף יזוהה כפיקסל שחור, ואילו פיקסלים עם ערכים גדולים יותר מהסף יזוהו כפיקסלים לבנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאחורים (אם קיימים והכרחי) המתאימים לפערים בתוך כולל אחד לתוצאות טובות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי התאים על ידי קביעת פיקסלים לבנים שכנים בתמונה בינארי, כך שתאים סמוכים קשורים כאגרגטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית המצרפים השונים זוהו ולהמיר את התמונה בינארי לתמונה כחולה-ירוק-אדום (RGB) להדמיה טובה יותר. צעדים לשלב מסגרות המקוריות עם כל אחת מתמונות מעובד המקבילות כדי לוודא את היעילות של טכניקת עיבוד תמונה ולהבטיח כי כל התאים נלקחים בחשבון, כפי שמוצגים באיור 5. בצע 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 ו4.5.5 לכל המסגרות שנתפסו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את השטח של כל כולל זוהה במסגרת מבוססת על מספר הפיקסלים מזוהים. בהתבסס על הגדלת העדשה משמשת, לחשב את מקדם ההמרה, באמצעות ארנק כיול, ולהמיר את התוצאות למיקרומטר 2. ממוצע הגדלים הכולל זוהו בכלמסגרת ולאחר מכן בממוצע התוצאות עבור כל המסגרות להשיג את הגודל כולל הממוצע לכל הקלטה של ​​RBC, השעיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את השטח של אחד RBC לקבוע מספר משוער נציג RBCs בתוך כל כולל זוהה. שימוש בתוצאות הללו, לחשב את חלוקת אחוזי RBCs בתוך כל המצרפי כפונקציה של הגדלים הכולל (המיוצג על ידי המספר המשוער של תאים בכל כולל), כפי שמוצג באיור 6. הערה: כדי למדוד את אגרגטים RBC, תוכנת ImageJ יכולה לשמש (במקום MATLAB) כדי לבצע את אותן משימות בכל מסגרת. </li></ol></li></ol> 5. מדידות מהירות נוזל ושאר דרג לקבוע את מהירות נוזל ולכן שיעור הגזירה באמצעות מערכת μPIV. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהנתונים שנרכשו באמצעות המצלמה במהירות הגבוהה, לעבור למצלמה פעמו הכפולה המשמשת למערכת μPIV. השתמש בתוכנת הדמיה לAC תמונהquisition של הזרימה ועיבוד התמונה להגדרה שדה מהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את כל אמצעי הזהירות הנדרשת, בהתאם למעמד של הלייזר, לפני הפעלת הלייזר. לאחר מכן הפעל את המערכת, את המצלמה והליזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל את המצלמה מבוססת על הגדלת העדשה בשימוש. לשם כך, השתמש מיקרוסקופי של 10 מיקרומטר דיוק מתחת למיקרוסקופ ולהגדיר את הגודל של 1 פיקסל בתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל הלייזר ולדמיין את החלקיקים בשני הנוזלים. מצא את מטוס אמצע microchannel על ידי התמקדות בחלקיקים המהירים ביותר בזרימה (כלומר, החלקיקים המהירים ביותר צריכים להיות הבהירים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את DT (מרווח זמן בין שתי מסגרות רצופות) כדי להבטיח את העקירה הנכונה של החלקיקים. החלקיקים המהירים ביותר צריכים לעבור על 5 עד 10 פיקסלים בין שני התמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל להקליט את הזרימה. הגדר את התוכנה לרכוש של תמונות 100 זוגות, 5 גזרים msec. בצע את השלבים 5.4, 5.5 ו -5.6 לכל DIFferent RBC, השעיות ולשיעורי גזירה שונות. הערה: פרטים נוספים על מתודולוגיה ניתנים במחקר של פיטס וFenech 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את ההקלטות נרכשו בשיטה חוצה קשר עם תוכנת ההדמיה. הערה: זה מורכב מdiscretizing זוג תמונות לתוך חלונות קטנים בגודל שנקבע מראש (המבוסס על זרימת נוזל ואת מרווח הזמן שנבחר על ידי המשתמש) נקרא Windows מתאם ובעקבות התזוזה של החלקיקים בכל חלון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לקבוע אם התמונות שנרכשו דורשות עיבוד מראש (כולל רקע חיסור, &quot;בסיס-גזיר&quot; 21 או תמונה חופף 22,23) לעיבוד נתונים טוב יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן בחר את גודל חלון מתאם וצורה, כמו גם של אחוז של תמונות חופפות. מחקר מפורט בוצע על ידי פיטס et al. 24 על מנת לקבוע את הפרמטרים אופטימליים וטכניקות עיבוד מראש תמונה לדםלזרום בתצורות ערוץ אחרות. להביע את התוצאות כשדה מהירות ממוצעת מחושב מזוגות התמונה 100 ושגיאת כיכר Mean שורש (RMS) במהירות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ פרופיל מהירות ביציאת הערוץ, מהעיבודים כפי שמוצג באיור 7. לפרופיל טוב יותר, בממוצע שדה המהירות בחלל. הערה: הברים להלחין את פרופיל המהירות מתאים לגודל חלון המתאם נבחר יחסית לרוחב הערוץ. שגיאת RMS במהירות גם מוצגת באיור 7, המייצגת את השגיאה בהערכת המהירות הניסיונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את הלייזר פעם אחת את כל המדידות והעיבוד מבוצעים ,. כבה את כל הרכיבים של המערכת: תוכנה, מצלמות, שלב מרגש, מחשבים והלייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את שיעור הגזירה, הראשון לזהות ולהעריך את עובי הדם בmicrochannel מבוסס על הקלטת המצלמה במהירות הגבוהה. למטרה זו, בממוצע כלהמסגרות בהקלטה הספציפית כדי להשיג תמונת רקע של הווידאו. תוחם את שכבת הדם (כפי שמוצג באיור 8 לRBC, ההשעיות זורמות בμl 10 / hr כאשר הושעו ב 5%, 10% ו -15% ההמטוקריט). לקבל את ערך המהירות לעובי שכבת הדם המתאים ולחשב את שיעור הגזירה על ידי חלוקת שווי מהירות על ידי עובי שכבת דם. </li></ol>

<ol>
	<li>Perkkio, J., Keskinen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematocrit+reduction+in+bifurcations+due+to+plasma+skimming.">Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming.</a> Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).</li><li>Chien, S., Jan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+basis+of+the+mechanism+of+rouleaux+formation.">Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation.</a> Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).</li><li>Neu, B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion-mediated+red+blood+cell+aggregation+in+polymer+solutions.">Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions.</a> Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).</li><li>Schmid-Sch&#246;nbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+shear+rate+dependence+of+red+cell+aggregation+in+vitro.">On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro.</a> J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).</li><li>Pries, A. R., Secomb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+the+microcirculation.">Rheology of the microcirculation.</a> Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).</li><li>Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Red Blood Cell Aggregation. , (2011).</li><li>Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemorheological+disorders+in+diabetes+mellitus.">Hemorheological disorders in diabetes mellitus.</a> J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).</li><li>Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. , (2007).</li><li>Lindqvist, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viscosity+of+the+blood+in+narrow+capillary+tubes.">The viscosity of the blood in narrow capillary tubes.</a> Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).</li><li>Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#229;hraeus:+Evolution+of+his+concepts+in+cardiovascular+physiology.">F&#229;hraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology.</a> Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).</li><li>F&#229;hraeus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suspension+stability+of+the+blood.">The suspension stability of the blood.</a> Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).</li><li>Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+specific+red+blood+cell+aggregation+indices+via+an+automated+system.">Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system.</a> Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).</li><li>Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laser-assisted+optical+rotational+cell+analyzer+(lorca)+as+red+blood+cell+aggregometer.">The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer.</a> Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).</li><li>Rampling, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+cell+aggregation+and+yield+stress.">Red cell aggregation and yield stress.</a> Clinical Blood Rheology. , (1988).</li><li>Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+human+erythrocyte+velocity+field+and+aggregation+measurements+at+physiological+haematocrit+levels.">Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels.</a> J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).</li><li>Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+variation+of+blood+viscosity:+modelling+using+shear+fields+measured+by+a+&#181;PIV+based+technique.">Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a &#181;PIV based technique.</a> Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).</li><li>Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+variation+of+blood+viscosity+and+velocity+distributions+of+aggregating+and+non-aggregating+blood+in+a+bifurcating+microchannel.">Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel.</a> Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).</li><li>Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+red+blood+cell+aggregability+in+a+flow+chamber+by+computerized+image+analysis.">Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis.</a> Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).</li><li>Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+microfluidic+system+for+red+blood+cell+aggregation+investigation.">Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation.</a> J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).</li><li>Pitts, K. L., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-particle+image+velocimetry+for+velocity+profile+measurements+of+micro+blood+flows.">Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows.</a> J. Vis. Exp. (74), e50314 (2013).</li><li>Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+particle-image+velocimetry+of+bead+suspensions+and+blood+flows.">Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows.</a> Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).</li><li>Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+algorithms+for+microscale+particle+image+velocimetry.">Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry.</a> AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).</li><li>Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+measurement+accuracy+in+micro+PIV+by+image+overlapping.">Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping.</a> Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).</li><li>Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-particle+image+velocimetry+measurement+of+blood+flow:+validation+and+analysis+of+data+pre-processing+and+processing+methods.">Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods.</a> Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).</li><li>Bhamare, M. G., Patil, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+blood+cell+analysis+by+using+digital+image+processing:+a+preliminary+study.">Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study.</a> Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).</li><li>Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+counting+of+red+blood+cells+in+blood+cell+images+using+hough+transform.">Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform.</a> Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).</li><li>Jambhekar, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cells+classification+using+image+processing.">Red blood cells classification using image processing.</a> Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">A threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

שימוש במתודולוגיה הנוכחית, ניתן לנתח איכותי וכמותית RBC אגרגטים בתנאי זרימה שונות וhematocrits. לבדיקה מוצלחת וזיהוי כולל, חשוב לקבוע את יחס מהירות הראוי בין שני הנוזלים בכניסת microchannel. יחס זה הוא חשוב מאוד כדי להשיג עובי שכבת דם אופטימלי שבו פרופיל המהירות הוא מעין-ליניארי ...

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

תאי דם אדומים (RBCs) לשחק תפקיד מכריע בקביעת התנהגות rheological של דם. הם כמעט להפליא אחראים לתכונות מסוימות של דם במבחנת in vivo. בתנאים פיסיולוגיים, RBCs לכבוש 40% ל -45% מנפח הדם. בזרימת דם, תאי הדם אדום לכבוש רק עד 20% מנפח הדם בשל קטרי כלי קטנים והפלזמה ברפרוף השפעת 1. תופעה זו של ירידה בזרימת דם פלזמה ידועה כאפקט Fåhræus. בשיעורי גזירה נמוכים, RBCs מסוגל לגשר יחד וליצור מבנים ממדיים חד ממדי או שלושה בשם &quot;rouleaux&quot; או אגרגטים, ומכאן תורם להתנהגות שאינה הניוטונית של דם. עם זאת, המנגנון של צבירת RBC אינו מובן לחלוטין. שתי תאוריות קיימות מודל הצבירה של RBCs: הגישור של תיאורית התאים עקב המקשר בין-של מקרומולקולות 2 וattrac הכוחתיאורית tion נגרמת על ידי דלדול של המולקולות בשל השיפוע האוסמוטי 3. בדרך כלל, לדם אדם, אגרגטים יוצרים בשיעורי גזירה נמוכים מאוד 4 החל 1-10 שניות -1. מעל לטווח זה, RBCs נוטה להיות משורש ולזרום בנפרד בתוך הכלי. הבנת התנאים של היווצרות אגרגטים היא של חשיבות רבה לשדה hemorheology במונחים של הגדרת התנהגות rheological של הדם. אגרגטים אלה נראים לעתים קרובות ברמת macrocirculation (&gt; 300 מיקרומטר הקוטר) 5. בקנה המידה הזה, דם נחשב כנוזל הניוטונית ותערובת הומוגנית. עם זאת, אגרגטים אלה נתפסים לעתים רחוקות ברמת הנימים (4-10 מיקרומטר קוטר) והם בדרך כלל אינדיקציה למצבים פתולוגיים כגון סוכרת והשמנה 6. מצבים פתולוגיים אחרים שיכולים לשנות צבירת RBC כוללת מצבים דלקתיים או מדבקים,מחלות לב וכלי דם כמו יתר לחץ דם או טרשת עורקים, הפרעות גנטיות ומחלות כרוניות 7. לכן, הבנת מנגנון צבירת RBC וניתוח גורמים אלה (על ידי הגדרת קשר בין הגודל של אגרגטים אלה ותנאי הזרימה) יכולה להוביל להבנה של התנהגות microrheological של דם ולכן מתייחס זה ליישומים קליניים. ניתן לשנות אגרגטים RBC על ידי מספר גורמים כגון המטוקריט (נפח של תאי דם אדומים בדם), שיעור הגזירה, קוטר הכלי, קרום נוקשות RBC והרכב הבינוני השעיית 8-10. לכן, תנאים מבוקרים נדרשים על מנת לנתח ביעילות מצרפי RBC. כמה שיטות יכולות לנתח היווצרות המצרפי על ידי מתן מדידות צבירת סטטי (מדד צבירה) שמציע מידע רלוונטי על דם התנהגות. שיטות אלה כוללות, בין היתר, שקיעת הדם11 שיטה, שיטת העברת אור 12, שיטת השתקפות אור 13 ושיטת צמיגות הגזירה הנמוכה 14. מחקרים מעטים ניסה ללמוד צבירת RBC ולקבוע את מידת הצבירה בזרימת תנאים מבוקרים 15-17. עם זאת, מחקרים אלה בעקיפין לחקור RBC גדלים המצרפי על ידי קביעת היחס של השטח הכבוש במערכת גז שנמדדה על בסיס תמונות דם מיקרוסקופיים מתן מידע על התואר של צבירה כמו גם הצמיגות המקומית. לפיכך, אנו מציגים נוהל חדש לכמת ישירות RBC צובר בזרימת דם, באופן דינמי, תחת שיעורי גזירה מבוקרים וקבועים. RBC, השעיותיהם לרכבת, בY-microchannel כפול (כפי שמודגם באיור 1), עם פתרון בופר פוספט (PBS) ומכאן יצירת זרימת גזירה בשכבת הדם. בתוך הדם הזה שכבת שיאה קבועהניתן להשיג שיעור r. RBC, ההשעיות נבדקות בהמטוקריט שונה (H) רמות (5%, 10% ו -15%) ותחת שיעורים שונים גזירה (2-11 שניות -1). מהירות הדם וקצב גזירה נקבעות באמצעות מערכת velocimetry תמונת החלקיקים מיקרו (μPIV) ואילו הזרימה דמיין באמצעות מצלמה במהירות גבוהה. התוצאות שהתקבלו לאחר מכן מעובד עם קוד MATLAB מבוסס על עוצמות תמונה כדי לזהות את תאי הדם האדומים ולקבוע גדלים כולל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SU8-50 epoxy based negative Photo-resist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-50 developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-50 series Plasma system&#160;</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td>PE-50 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>B367861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poshpate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracer fluorescent particles solution (15 mL)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>R800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggregometer</td>
			<td>RheoMeditech</td>
			<td>Rheo Scan AnD300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringes (50 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing (Tygon)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>AAA00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed camera (Basler)</td>
			<td>Graftek Imaging Inc.</td>
			<td>basler acA2000-340km</td>
			<td>A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double pulsed camera&#160;</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Imager Intense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope MITAS</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>MITAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nd:YAG laser</td>
			<td>New Wave Research</td>
			<td>Solo-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)</td>
			<td>Chemyx Inc. and Harvard Apparatus</td>
			<td>Nexus3000 and PicoPlus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DaVis software</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Davis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation

דם, כBiofluid אינו הניוטונית, מייצג את המוקד של מחקרים רבים בתחום hemorheology. מרכיבי דם כוללים תאי דם אדומים, תאי דם לבנים וטסיות דם שמושעים בפלזמת דם. בשל הריבוי של תאי הדם האדומים (40% עד 45% מנפח הדם), ההתנהגות שלהם מכתיבה את התנהגות rheological דם במיוחד בזרימת הדם. בשיעורי גזירה נמוכים מאוד, RBCs נראה להרכיב וגופי טופס הנקראים אגרגטים, שגורם להתנהגות לא-הניוטונית של דם. חשוב להבין את התנאים של היווצרות אגרגטים להבין rheology הדם בזרימת דם. הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את הליך הניסוי כדי לקבוע כמותית מצרפי RBC בזרימת דם בשיעור גזירה מתמדת, המבוסס על עיבוד תמונה. למטרה זו, RBC, השעיות נבדקות ונותחו ב120 x 60 מיקרומטר פולי-דימתיל-siloxane (PDMS) microchannels. RBC, ההשעיות הן אף אוזן גרוןירד גשם באמצעות נוזל שני על מנת לקבל פרופיל מהירות ליניארי בתוך שכבת הדם ובכך להשיג מגוון רחב של שיעורי גזירה קבועים. שיעור הגזירה נקבע באמצעות שימוש במערכת velocimetry תמונת החלקיקים מיקרו (μPIV), בעוד אגרגטים RBC הם דמיינו באמצעות מצלמה במהירות גבוהה. קטעי הווידאו שנתפס של אגרגטים RBC מנותחים באמצעות טכניקות עיבוד תמונה על מנת לקבוע את הגודל הכולל המבוסס על עוצמות תמונות.

<html> דוגמא של הזרימה דו-הנוזל בY-microchannel הכפול מוצגת באיור 2 לRBCs אדם המושעה ב 5%, 10% ו -15% ההמטוקריט וזורם בμl 10 / hr. איור 3 מציג את ההבדל בגדלים מצטברים כאשר הזרימה בערוץ מצטמצמת מ -10 μl / שעה 5 μl / שעה להמטוקריט של 10%. זה נותן רעיון איכותי של הגדלים של המצרפים כא?...

Watch this Scientific Journal Video about Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation at JoVE.com

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

הפרוטוקול מתואר פרטי הליך ניסיוני לכמת אגרגטים של תאי דם אדומים (RBC) תחת שיעור גזירה מבוקרת וקבוע, המבוסס על טכניקות עיבוד תמונה. המטרה של פרוטוקול זה היא להתייחס גדלים כולל RBC לשיעור הגזירה המקביל בסביבת microfluidic מבוקרת.

סביבת Microfluidic מבוקרת לדינמית חקירה של צבירת תאי דם האדום

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

controlled-microfluidic-environment-for-dynamic-investigation-red

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K Views.  University of Ottawa.  הפרוטוקול מתואר פרטי הליך ניסיוני לכמת אגרגטים של תאי דם אדומים (RBC) תחת שיעור גזירה מבוקרת וקבוע, המבוסס על טכניקות עיבוד תמונה. המטרה של פרוטוקול זה היא להתייחס גדלים כולל RBC לשיעור הגזירה המקביל בסביבת microfluidic מבוקרת. 

Video: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

פלטפורמות microfabricated לתרבות Cell דינמי מכאני

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

האוטומטי לחלוטין צנטריפוגלי Microfluidic מכשיר לגילוי חלבון רגיש מן הדם מלא

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

פוטו-ליתוגרפיה גובה רב שלבי משתנה עבור Valved רב שכבתי מכשירים microfluidic

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...