We thank Yehui Qin and Mallory Myers for technical support. We also thank Dr. Sigismund Huck for providing us the anti-&#945;4-ECD antibody. This work is supported by National Institutes of Health grant NS22061 to L. W. R.

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם למכונים הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (NIH פרסומי מס &#39;80-23, מתוקן 2012) ולימודים אושרו על ידי מוסדי טיפול בבעלי חיים והשתמשו לועדות מחקר בסטוני אוניברסיטה ברוק (# -1618 ו# 1792). 1. vHipp-nAcc Synaptic שיתוף תרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי קורבן (יום לידה 0 - 3, מwild-type (WT) או nAChRs α7 קו עכבר מהונדס) עם CO 2. לערוף כל גור ולשמור את הזנב בצינור 1.5 מיליליטר צנטריפוגות לgenotyping בדיעבד. בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החלק העליון של הגולגולת עם מספריים ומלקחיים כדי לחשוף את המוח כולו. החל בצומת שבו הקורטקס המוחי חלק מcaudally אחר, להשיג סעיף עטרה המכיל את קליפת המוח האחורי כולל vHipp 5,21 תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח נ &#39;רצועות באוקטובר יהוה רקמה המכילות את אזור CA1-subiculum לפי אטלס מוח עכבר 22 (איור 1 א) פיתוח. העברה לצלחת תרבות 35 מ&quot;מ המכילה תקשורת הקרה תרבות (4 מעלות צלזיוס), לחתוך לפרוסות דקות קטנות (סביב 100 מיקרומטר × 100 מיקרומטר microslices). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום דגירה פולי-D ליזין / coverslips זכוכית מצופה laminin 12 מ&quot;מ בתוך 24 צלחות תרבית רקמה טובות עם תקשורת ותרבות (~ 500 μl) לפחות 30 דקות בחממה על 37 מעלות צלזיוס. הסר תקשורת לפני ציפוי microslices. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת עם פיפטה פסטר אש מלוטשת במרכז coverslip עם כמות מינימאלית של תקשורת (~ 50 μl, המכילה ~ 20 חתיכות של microslices) כדי להקל על התקשרות של explants. microslices vHipp צלחת שמקורם בבעלי חיים בודדים (או + / + או - / - גנוטיפ של קו α7 המהונדס) על כל coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר explants להתיישב על coverslip, בעדינות להוסיף מדיה נוספת (~ 100 μl) על ידי הקיר דואר, כך שרמת התקשורת גבוהה מספיק כדי לכסות את explants בפריפריה לחלוטין, אבל לא אלה שבמרכז coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה O / N 37 ° C, 5% CO 2 באינקובטור, לפזר נוירונים nAcc מימים עובריים 18 לעכברי WT יום 1 לאחר לידה ולהוסיף לexplants. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את רקמות nAcc לפי אטלס פיתוח מוח עכבר 20 (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך לחתיכות קטנות (כ -500 מיקרומטר × 500 מיקרומטר microslices) ולהעביר צינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק עם טריפסין 0.25% (2 מיליליטר) במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס. לשטוף נתחי רקמות שלוש פעמים עם תקשורת כביסה קרה (5 מיליליטר, 4 ° C) ואחריו לשטוף אחד בתקשורת והתרבות הקרה (5 מיליליטר, 4 ° C). לאפשר השעיה לנוח במשך 5 דקות בכל שלב לשטוף, ואז לשפוך את supernatant בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים על ידי טחינה דקה עדינה ב 2 מיליליטר של תקשורת בתרבות עם פיפטה פסטר קל אש מלוטשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transהשעיה תא FER לעוד צינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב -2,000 סל&quot;ד x למשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend התאים בתקשורת והתרבות ב1 מיליליטר לכל 6 גורים. לפזר תאים על ידי pipetting בעדינות בתקשורת כמה פעמים עם פיפטה פסטר אש מלוטשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.25 מיליליטר של תאי nAcc התפזרו לכל coverslip עם explants vHipp. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על התרבויות ב37 ° C humidified, 5% CO 2 באינקובטור. הנח צלחות תרבות על פדה גזת סטרילי לחה כדי לייצב מכאני ולשמור על לחות, להקל היווצרות סינפסה. </li></ol></li></ol> 2. Immunocytochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תרבויות (5 - 7 ימים במבחנה) ב -4% סוכרוז paraformaldehyde / 4% / PBS (~ 500 μl לכל coverslip, 20 דקות, RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות Permeabilize עם 0.25% Triton X-100 / PBS (~ 500 μl לכל coverslip, 5 דקות, RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות בלוק עם 10% חמורים בדם נורמלי בPBS (~ 500 μl לכל coverslip, 30 דקות, RT) לפני antibodצביעת y. דגירה עם נוגדנים עיקריים O / N ב 4 ° C. השתמש בנוגדנים העיקריים הבאים: nAChRs אנטי (α 4 -ECD 1: 500; אנטי-α 5 יחידות משנה, 1: 500), טרנספורטר גלוטמט אנטי-לפוחי 1 (1: 250), אנטי-GAD65 (1: 100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף נוגדנים ראשוניים עם PBS (3 פעמים / ~ 500 μl לכל coverslip, 5 דקות) ולאחר מכן דגירה תרבויות בנוגדנים משני מצומדת לAlexa 488 (~ 500 μl לכל coverslip, 1: 500) או Alexa 594 (~ 500 μl לכל coverslip , 1: 500) לשעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התרבויות בαBgTx מצומדת לAlexa 594 (~ 500 μl לכל coverslip, 1: 1,000 בתקשורת והתרבות) במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני הקיבוע לα7 משטח תיוג * nAChRs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips הר והחותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצוידים ביעדי התכנית-Apochromat (20X עם 0.8 NA או שמן 63X עם 1.4 NA) ומצלמת CCD. </li></ol> 3. FM1-43 מבוסס לפוחי Fusion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תרבויות (5 - 7 ימים במבחנה) בחדר הדמיה, הר קאמרי על ספינינג מיקרוסקופ confocal דיסק. ברציפות perfuse (1 מיליליטר / דקה) עם קוקטייל HBS ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק תרבויות זלוף ועומס עם 10 מיקרומטר FM1-43 ב -56 מ&quot;מ K + ACSF (~ μl 500) למשך 90 שניות (צביעה), לשטוף צבע חיצוני משם במשך 15 דקות עם Ca 2 + HBS החופשי המכיל ADVASEP-7 (0.1 מ&quot;מ) כדי לחפש FM1-43 קרום הנכנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר את התרבויות עם 56 מ&quot;מ K + ACSF (~ 500 μl) ללא FM1-43 עבור 120 שניות (destaining), טען תרבויות עם FM1-43 באמצעות אותם התנאים, ולשטוף שוב עם Ca 2 + HBS חופשי המכיל ADVASEP-7 ל 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש FM1-43 תמונות הקרינה עם מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב מצוידים במטרת התכנית-Apochromat (מים 60x עם 1.4 NA, ננומטר 488 העירור, פליטת 530 ננומטר) וללכוד תמונות עם מצלמת CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות הקרינה FM1-43 בסיס (כל 2 של דקות 1) כשליטה מראש ניקוטין; תחול ניקוטין (1 מיקרומטר) על ידי זלוף המהיר (2 מיליליטר / דקה) 1 דקות, ולאחר מכן לשטוף ניקוטין עם קוקטייל HBS. שמור את תמונות זמן לשגות לכידה לפני, במהלך, ואחרי יישום ניקוטין כל 2 שניות למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את עוצמת הקרינה לפני FM1-43 (צביעת F) ואחרי (destaining F) יישום ניקוטין בכל אוטון הסינפטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב סכום כולל של הקרינה FM1-43 releasable לאורך האקסונים vHipp ידי כימות ההבדל של עוצמת הקרינה FM1-43 לפני ואחרי יישום ניקוטין (ΔF = destaining -F צביעת F). לנתח כל חלק של ירידת עוצמת הקרינה לאחר ניקוטין עם המשוואה הבאה:% מכתים = ΔF / F F ירידה. </li></ol> הדמיה 4. סידן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף תרבויות (5 - 7 ימים במבחנה) במהירות עם HBS הנורמלי, לאחר מכן טען תרבויות עם 5 מחוון מיקרומטר Fluo-4 Ca 2 + (אסתר בבוקר) ושל 0.02% pluronic F-127 בHBS (2 מיליליטר) במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את פתרון Fluo-4 עם HBS (3 פעמים / 5 דקות). חזור תרבויות לחממה (37 CO / 5% מעלות צלזיוס 2) לפחות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תרבויות באותו תא ההדמיה ואותם תנאים כפי שתואר בסעיף FM1-43 היתוך לפוחי מבוסס (ראה שלב 3.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות Fluo-4 הקרינה של תחזיות axonal ממייקרו-פרוסות vHipp עם מטרת התכנית-Apochromat (מים 60x עם 1.4 NA, ננומטר 488 העירור, פליטה 530 ננומטר) ומצלמת CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות הקרינה Fluo-4 בסיס (כל 10 שניות למשך 2 דקות) כשליטה מראש ניקוטין, תחול ניקוטין (1 מיקרומטר) על ידי זלוף המהיר (2 מיליליטר / דקה) 1 דקות, ולאחר מכן לשטוף ניקוטין עם קוקטייל HBS. שמור את תמונות זמן לשגות לכידה לפני, במהלך, ואחרי יישום ניקוטין כל 10 שניות למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את כל המסגרות של התמונות גולמי fluo-4 הקרינה, יצוא כסדרה שלתמונות בפורמט TIFF לניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את עוצמת המשולבת של fluo-4 הקרינה לאורך האקסונים vHipp לפני ואחרי יישום ניקוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל עוצמת הקרינה משולבת עם המשוואה הבאה: ΔF / F 0 = (FF 0) / 0 F, כאשר F 0 הוא עוצמת הקרינה משולבת מראש ניקוטין מתוקן רקע וF הוא עוצמת הקרינה המשולבת לאורך האקסונים vHipp בכל נקודת זמן לאחר יישום ניקוטין. לנתח ולתכנן עוצמת הקרינה משולבת מנורמלת. </li></ol>

<ol>
	<li>Changeux, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+nicotinic+receptors:+structure+and+regulation,+role+in+learning+and+reinforcement.">Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement.</a> Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).</li><li>Levin, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+receptor+subtypes+and+cognitive+function.">Nicotinic receptor subtypes and cognitive function.</a> J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).</li><li>Dani, J. A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acetylcholine+receptors+and+nicotinic+cholinergic+mechanisms+of+the+central+nervous+system.">Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).</li><li>Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+receptors+and+depression:+revisiting+and+revising+the+cholinergic+hypothesis.">Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis.</a> Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).</li><li>Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+elicits+prolonged+calcium+signaling+along+ventral+hippocampal+axons.">Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons.</a> PloS one. 8 (12), e82719 (2013).</li><li>McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+enhancement+of+fast+excitatory+synaptic+transmission+in+CNS+by+presynaptic+receptors.">Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors.</a> Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).</li><li>Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+synaptic+transmission+enhanced+by+low+concentrations+of+nicotine.">Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine.</a> Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).</li><li>Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+alpha+7-+and+beta+2-containing+nicotinic+acetylcholine+receptors+modulate+excitatory+amino+acid+release+from+rat+prefrontal+cortex+nerve+terminals+via+distinct+cellular+mechanisms.">Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms.</a> Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).</li><li>Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+nicotinic+receptors+evoke+endogenous+glutamate+and+aspartate+release+from+hippocampal+synaptosomes+by+way+of+distinct+coupling+mechanisms.">Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms.</a> Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).</li><li>Zappettini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+nicotinic+alpha7+and+non-alpha7+receptors+stimulate+endogenous+GABA+release+from+rat+hippocampal+synaptosomes+through+two+mechanisms+of+action.">Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action.</a> PloS one. 6 (2), e16911 (2011).</li><li>Fabian-Fine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+distribution+of+the+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+in+rat+hippocampus.">Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus.</a> J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).</li><li>Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha+bungarotoxin-1.4+nm+gold:+a+novel+conjugate+for+visualising+the+precise+subcellular+distribution+of+alpha+7*+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).</li><li>Nashmi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+alpha4beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+assessed+with+functional+fluorescently+labeled+subunits:+effects+of+localization,+trafficking,+and+nicotine-induced+upregulation+in+clonal+mammalian+cells+and+in+cultured+midbrain+neurons.">Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons.</a> J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).</li><li>Drenan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+trafficking,+pentameric+assembly,+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+alpha6+and+beta3+subunits.">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits.</a> Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological,+pharmacological,+and+molecular+evidence+for+alpha7-nicotinic+acetylcholine+receptors+in+rat+midbrain+dopamine+neurons.">Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons.</a> J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).</li><li>Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+beta2+subunit-containing+and+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptors+differentially+control+glutamatergic+and+cholinergic+signaling.">Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling.</a> J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).</li><li>Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+changes+induced+by+different+presynaptic+nicotinic+receptors+in+separate+populations+of+individual+striatal+nerve+terminals.">Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals.</a> J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).</li><li>Richards, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+alpha4*+nicotinic+receptors+revealed+by+superecliptic+phluorin:+effects+of+a+beta4+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+mutation+and+chronic+exposure+to+nicotine.">Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).</li><li>Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+trafficking+and+up-regulation+of+nicotinic+ACh+receptors.">Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).</li><li>St John, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+trafficking+of+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors.</a> Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+type+III+neuregulin+1+is+required+for+sustained+enhancement+of+hippocampal+transmission+by+nicotine+and+for+axonal+targeting+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).</li><li>Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain. , (1998).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+fluorescent+staining+and+destaining+of+living+vertebrate+motor+nerve+terminals.">Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).</li><li>Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+fluorescent+styryl+dye+FM1-43+to+visualize+synaptic+vesicles+exocytosis+and+endocytosis+in+motor+nerve+terminals.">Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals.</a> Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).</li><li>Garduno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+alpha4beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+increase+glutamate+release+and+serotonin+neuron+excitability+in+the+dorsal+raphe+nucleus.">Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus.</a> J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).</li><li>Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+released+and+exogenous+ACh+activates+different+nicotinic+receptors+to+enhance+evoked+glutamatergic+transmission+in+the+lateral+geniculate+nucleus.">Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus.</a> J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).</li><li>Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+nicotine+on+spiking+activity+and+Ca2++dynamics+of+dendritic+spines+in+rat+CA1+pyramidal+neurons.">The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons.</a> Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הכנת שיתוף התרבות מתוארת מחדש נכנע מעגלים בהיפוקמפוס-נסמכים הגחון במבחנה. בחינת היתרי הכנה פשוטה יחסית ואמינה זה של פרופילי מרחב ובזמן שבו הפעלה של nAChRs מראש הסינפטי לעורר משופרת שידור glutamatergic 5, 21. שיתוף תרבויות מוגדרו?...

אפנון כולינרגית של רגישות מעגל תורם להיבטים בסיסיים של הכרה, ואפנון כולינרגית שינה הוא תכונה של הפרעות ניווניות ונוירו-פסיכיאטריים, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, סכיזופרניה והתמכרות 1-4. מנגנון שנקבע בהנחיית כולינרגית של שידור הסינפטי במערכת העצבים המרכזית הוא באמצעות הפעלה ישירה של nAChRs המקומי באתרים מראש הסינפטי. הפעלה של קולטנים מראש הסינפטי אלה מובילה לעליית 2 + (i [Ca 2 +]) במסופים מראש הסינפטי Ca תאיים - הן במישרין, בשל מוליכות סידן גבוהות יחסית של תת מסוימים nAChR, ובעקיפין, באמצעות מפלי איתות תאיות 5, ובכך משפרים את שחרור הנוירוטרנסמיטר. למעשה, ההפעלה של nAChRs מראש הסינפטי נקשרה עם שינויים בשחרור של מגוון רחב של נוירוטרנסמיטורים כוללים גלוטמט, GABA, ACH,דופמין ND 6-10. למרות שתהליך זה נחקר באופן עקיף באמצעות שיטות אלקטרו בהסינפסות שונות, כתבים אופטיים של [Ca 2 +] i ומחזור שלפוחית ​​סינפטית לאפשר מדידה ישירה ובזמן מדויק יותר של תופעות קדם-סינפטי. לוקליזציה טרום הסינפטי של nAChRs הודגמה באופן משכנע עם תיוג חיסוני זהב ישיר של nAChRs במיקרוסקופי אלקטרונים (EM) רמת 11,12. כמה טכניקות אחרות יש גם שימשו לטיפול בלוקליזציה nAChR בעקיפין, לרבות מיקומים של מפלצות חלבון פלואורסצנטי subunit- nAChRs גילוי בנוירונים בתרבית 13,14, הקלטת אלקטרו של זרמי nAChR במסופים הסינפטי 15,16, מעקב אחר שינויי ניקוטין מושרה ב[ Ca 2 +] i במסוף עצב הסינפטי על ידי הדמיה לחיות תא 17, וניטור עקיף של שחרור הנוירוטרנסמיטר במסוף הסינפטי על ידיטכניקות הדמיה תא חיות עם אינדיקטורים ניאון, כולל exocytosis של שלפוחית ​​סינפטית שנצפה על ידי צבעי styryl amphipathic FM (FM1-43 וFM4-64) ו / או synapto-pHluorin ועל ידי כתבים ספציפיים ניאון עצבי, כגון CNiFERs לאח וiGluSnFr לגלוטמט 18-20. בסך הכל, גישות הנוכחיות אלה לזיהוי לוקליזציה מראש הסינפטי של nAChRs הן מסובכות, ודורשות מערכות וטכניקות מיוחדות כדי לאפשר זיהוי אמין וניטור פיסיולוגי של פעילות טרום-סינפטי. כאן אנו מתארים פרוטוקולים וציוד למערכת שיתוף תרבות במבחנה של היפוקמפוס הגחון (vHipp) - גרעין נסמך (nAcc) מעגל המספק גישה ישירה לזהות ולנתח את שני מרכיבים של לפני ואחרי-סינפטי של העברת הסינפטית. אנחנו מראים דוגמאות של לוקליזציה מראש הסינפטי של nAChRs והדמית התא החי של nAChR תיווך Ca 2 + ALO איתות ושחרור הנוירוטרנסמיטרהאקסונים ng vHipp. המשך טבעי (וברור) של הפרוטוקול המובא כאן הוא ההכנה של אנשי קשר לפני ואחרי-סינפטי המורכב מתאי עצב מגנוטיפים שונים. באופן זה את התרומה של מוצר גן מסוים למראש ו / או פוסט-סינפטי מנגנונים של אפנון ניתן להעריך באופן ישיר.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Culture Media (50 ml)</td></tr><tr><td>Neurobasal&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10888022</td><td>48 ml</td></tr><tr><td>B-27 Supplements</td><td>GIBCO</td><td>0080085-SA</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>10908-010</td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td colspan="4">2. washing media (HBSS, 100 ml)</td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14175-095</td><td>99 ml</td></tr><tr><td>HEPES ( 1M)</td><td>GIBCO</td><td>15630-130</td><td>1 ml</td></tr><tr><td colspan="4">3. HEPES buffered saline&amp;nbsp; (HBS)&amp;nbsp;&amp;nbsp; pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&amp;nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&amp;nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266&amp;nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl2,</td><td>Sigma</td><td>C1016&amp;nbsp;</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&amp;nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G0350500&amp;nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td colspan="4">4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&amp;nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&amp;nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266&amp;nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl2,</td><td>Sigma</td><td>C1016&amp;nbsp;</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&amp;nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G0350500&amp;nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>tetrodotoxin&amp;nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td>2 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>bicuculline</td><td>Tocris</td><td>131</td><td>10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>D-AP-5</td><td>Tocris</td><td>105</td><td>50 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>1045</td><td>20 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>LY341495</td><td>Tocris</td><td>1209</td><td>10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td colspan="4">5. Calcium-free&amp;nbsp; HBS&amp;nbsp;&amp;nbsp; pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&amp;nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&amp;nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266&amp;nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&amp;nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G0350500&amp;nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td colspan="4">6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>119 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>56 mM</td></tr><tr><td>MgSO4.7H</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td>1.3 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>2.5 mM</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>26.2 mM</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G0350500&amp;nbsp;</td><td>10 mM</td></tr></tbody></table>

live imaging of nicotine induced calcium signaling and neurotransmitter release along ventral hippocampal axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

ההכנה המועסקות מורכבת משיתוף תרבויות גן chimeric של מעגלי vHipp-nAcc במבחנה. תחזיות נובעות מmicroslices vHipp, כקלט axonal מראש הסינפטי, יכולות ליצור קשרים סינפטיים עם מטרות פוסט-סינפטי, תאי העצב המפוזרים מnAcc. ניקוטין מושרה סיוע מתמשך (≥ 30 דקות) של שידור glutamatergic מהנוירונים nAcc מעוצבב...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons at JoVE.com

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

הדמיה חיה של איתות הניקוטין מושרה סידן והשחרור הנוירוטרנסמיטר לאורך האקסונים בהיפוקמפוס הגחון

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

live-imaging-nicotine-induced-calcium-signaling-neurotransmitter

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Adrenergic Agonists and Antagonists Agents

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K Views.  Stony Brook University. We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal – accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Video: Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences. For instance, addiction to nicotine via tobacco smoking is a leading cause of premature death worldwide (World Health Organization) and is likely caused by an alteration of ion channel distribution in the brain1. Chronic nicotine exposure in both rodents and humans results in increased numbers of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in brain tissue1-3. Similarly, alterations in the glutamatergic GluN1 or GluA1 channels have been implicated in triggering sensitization to other addictive drugs such as cocaine, amphetamines and opiates4-6.

Consequently, the ability to map and quantify distribution and expression patterns of specific ion channels is critically important to understanding the mechanisms of addiction. The study of brain region-specific effects of individual drugs was advanced by the advent of techniques such as radioactive ligands. However, the low spatial resolution of radioactive ligand binding prevents the ability to quantify ligand-gated ion channels in specific subtypes of neurons. 

Genetically encoded fluorescent reporters, such as green fluorescent protein (GFP) and its many color variants, have revolutionized the field of biology7.By genetically tagging a fluorescent reporter to an endogenous protein one can visualize proteins in vivo7-10. One advantage of fluorescently tagging proteins with a probe is the elimination of antibody use, which have issues of nonspecificity and accessibility to the target protein. We have used this strategy to fluorescently label nAChRs, which enabled the study of receptor assembly using F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) in transfected cultured cells11.More recently, we have used the knock-in approach to engineer mice with yellow fluorescent protein tagged &alpha;4 nAChR subunits (&alpha;4YFP), enabling precise quantification of the receptor ex vivo at submicrometer resolution in CNS neurons via spectral confocal microscopy12. The targeted fluorescent knock-in mutation is incorporated in the endogenous locus and under control of its native promoter, producing normal levels of expression and regulation of the receptor when compared to untagged receptors in wildtype mice. This knock-in approach can be extended to fluorescently tag other ion channels and offers a powerful approach of visualizing and quantifying receptors in the CNS.

In this paper we describe a methodology to quantify changes in nAChR expression in specific CNS neurons after exposure to chronic nicotine. Our methods include mini-osmotic pump implantation, intracardiac perfusion fixation, imaging and analysis of fluorescently tagged nicotinic receptor subunits from &alpha;4YFP knock-in mice (Fig. 1). We have optimized the fixation technique to minimize autofluorescence from fixed brain tissue.We describe in detail our imaging methodology using a spectral confocal microscope in conjunction with a linear spectral unmixing algorithm to subtract autofluoresent signal in order to accurately obtain &alpha;4YFP fluorescence signal. Finally, we show results of chronic nicotine-induced upregulation of &alpha;4YFP receptors in the medial perforant path of the hippocampus.

We have developed a novel technique of quantifying nicotinic acetylcholine receptor changes within subcellular regions of specific subtypes of CNS neurons to better understand the mechanisms of nicotine addiction by using a combination of approaches including fluorescent protein tagging of the receptor using the knock-in approach and spectral confocal imaging.

דימות ספקטרלי Confocal של קולטנים ניאציניות מתויג fluorescently ב עקום בעכברים עם מינהל ניקוטין כרונית

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

אורך שני-פוטון הדמיה של CA1 היפוקמאל בעכברים חיים

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Behavior

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with subcellular location within cells where this function is carried out. To study the subcellular location of nicotinic ACh receptors (nAChRs) in native brain tissue, an optical method was developed for precise release of nicotine at discrete locations near neuronal membranes during electrophysiological recordings. Patch-clamped neurons in brain slices are filled with dye to visualize their morphology during 2-photon laser scanning microscopy, and nicotine uncaging is executed with a light flash by focusing a 405 nm laser beam near one or more cellular membranes. Cellular current deflections are measured, and a high-resolution three-dimensional (3D) image of the recorded neuron is made to allow reconciliation of nAChR responses with cellular morphology. This method allows for detailed analysis of nAChR functional distribution in complex tissue preparations, promising to enhance the understanding of cholinergic neurotransmission.

This article presents a method for studying nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in mouse brain slices by nicotine uncaging. When coupled with simultaneous patch clamp recording and 2-photon laser scanning microscopy, nicotine uncaging connects nicotinic receptor function with cellular morphology, providing a deeper understanding of cholinergic neurobiology.

חקירת פונקציה קולטן אצטילכולין Nicotinic פרוסות המוח העכבר באמצעות לייזר פלאש פוטוליזה של ניקוטין Photoactivatable

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

הליך גולגולתי להדמיית פעילויות עצביות בהיפוקמפוס של עכברים מתנהגים

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גבי שלמים

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Co-culturing of Ventral Hippocampal and Nucleus Accumbens

Source: Zhong, C., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52730">Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the process of preparing ventral hippocampal and nucleus accumbens tissues from mouse brains for co-culture. Neurons extend projections to form synaptic connections between the ventral hippocampal and nucleus accumbens tissues. This method allows studying neuronal interactions between these two brain regions, offering insights into cognition, behavior, and neurological disorders.

גידול משותף של היפוקמפוס גחוני וגרעין אקומבנס

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Co-culture and Interaction Studies

Imaging Nicotine-Induced Calcium Signaling along Ventral Hippocampal Axons in Synaptic Co-Cultures

Source: Zhong, C., et al., <a href="https://app.jove.com/v/52730">Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates how nicotine-mediated activation of nicotinic acetylcholine receptors in the mouse ventral hippocampus results in sustained calcium signaling along the axons.

הדמיה של איתות סידן המושרה על ידי ניקוטין לאורך אקסונים של ההיפוקמפוס הגחוני בתרביות סינפטיות

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Calcium Imaging

	Rinse ...