מספר תאי העצב המנוטרים בשיטה זו מאפשר איסוף נתוני רשת נוירונים שלא היו אפשריים בשיטות ישנות או אחרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לפקח על כמעט 2, 000 נוירונים חושיים ראשוניים בבת אחת, להגיב ישירות לגירויים החלים על הכף האחורית. הליך זה מתאים במיוחד ללימוד התערבויות טיפוליות עבור אלודיניה היקפית ורגישות יתר לכאב.
שיטה זו יכולה להיות מותאמת לחקר גרעינים טריגמינליים או גניקולטים או להשתמש בהם עם חיישנים מקודדים גנטית עבור מולקולות מתח או איתות תאי, כגון AMP מחזורי. נדרש תרגול כדי לבצע ניתוח זה. אתה יכול להתאמן על עד שישה גרעיני שורש גבי על חיה אחת.
מי שידגים את ההליך יהיה אני, בעזרתם של ג'ון שאנון ומר רובן גומז. כדי להתחיל, הנח את העכבר על כרית מחוממת כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ב 37 מעלות צלזיוס. אתר את ההגדלה המותנית על ידי הרגשת עצם האגן של העכבר.
לאחר מכן, לגלח את גב העכבר מעל האזור של הגדלת מותני. בעזרת מספריים מבצעים חתך מלבני תלת צדדי מעל ההגדלה המותנית, ומקפלים את העור בעזרת מלקחיים. השתמש במספריים לדיסקציה קפיץ של 13 מ"מ כדי לבצע חתכים של שלושה עד ארבעה מילימטרים בצד ימין של עמוד השדרה.
השתמש מספריים לחתוך את העור ואת השרירים לצדדים כדי לחשוף את עמוד השדרה. לאחר מכן, באמצעות מספריים שמונה מילימטר, לחתוך את השריר ואת רקמת החיבור כדי לנקות את התהליך הרוחבי של צד ימין L5 DRG. נסה למזער דימום באמצעות כותנה או Gelfoam כדי לספוג את הדם.
פתח את התהליך הרוחבי L5 בצד ימין באמצעות רונגיורים פרידמן-פירסון או מלקחיים עדינים חזקים, תוך זהירות לא לגעת DRG. לאחר מכן, העבר את העכבר ואת כרית החימום אל הבמה המותאמת אישית. השתמש בסרט הבמה כדי לאבטח את בעל החיים ואת כרית החימום במקומה.
מניחים את אפו של בעל החיים בחרוט האף להרדמה איזופלורנית רציפה. אבטחו את הכף האחורית הימנית הבולטת לעמדה מחוץ לבמה ליישום קל של הגירויים. אבטחו את עמוד השדרה במקומו עם מהדקי הבמה על העור בחוליות או עצם האגן רק רוסטרלית וקאודלית ל- L5 DRG.
התאם את המלחציים ואת הבמה כדי להפוך את פני השטח של DRG לרמה ככל האפשר. לאחר מכן, מקם את השלב מתחת למיקרוסקופ כך שהמטרה תהיה ישירות שמונה מילימטרים מעל DRG כאשר מורידים אותו. הכנס את המדחום הרקטלי.
חברו את קווי החשמל לכרית החימום ולמדחום פי הטבעת. חבר את חרוט האף לקווי הגז איזופלורן. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי זקוף עם מטרה 10x 0.4 DIC והתוכנה המשויכת להדמיה.
השתמש בהגדרות מסנן FITC הירוק של עירור ב 495 ננומטר, פליטה ב 519 ננומטר, ואורך גל גילוי בין 500 ל 580 ננומטר. מתחת למיקרוסקופ, למצוא את פני השטח של DRG. התאם את המהדקים על הבמה כך שמשטח DRG יהיה ברמה ככל האפשר ושטח הפנים המרבי יודגם במישור המוקד.
לפקח על החיה לאורך כל ההליך כדי לשמור על הרדמה isoflurane ללא מנת יתר. כדי לטעון את פרוטוקול הסריקה המהירה של המיקרוסקופ, השתמש בהגדרות האופייניות של גודל ווקסל 2.496 על 2.496 על 16 מיקרון, 512 על 512 פיקסלים, 10 פרוסה אופטית Z-stack, יחידה אוורירית אחת עבור 32 מיקרומטר, 1% עוצמת לייזר של 488 ננומטר וחמישה מיליוואט, זמן פיקסל 1.52 מיקרו-שניות, זמן קו 0.91 אלפיות השנייה, זמן פריימים 465 אלפיות השנייה, מהירות סריקת LSM של שמונה, סריקה דו-כיוונית, גלאי PMT רווח של 650 וולט, ורווח דיגיטלי של אחד. בצע סריקה קצרה בת שמונה מחזורים של DRG על ידי לחיצה על התחל ניסוי תחת הכרטיסייה רכישה.
צור סרט על-ידי ביצוע הקרנה אורתוגונלית של סריקות בסריקה אחת לכל מסגרת לאורך זמן. בדוק ידנית את בהירות התמונה ואת תוצרי ההדמיה, כגון גלי בהירות החוצים את DRG. התאם את מיקום המהדק ואת עובי המקטע האופטי, וחזור על שלב זה עד לקבלת סרט ברור ואיכותי.
לאחר מכן, טען את פרוטוקול הסריקה ברזולוציה גבוהה במיקרוסקופ באמצעות ההגדרות האופייניות של גודל ווקסל 1.248 על 1.248 על 14 מיקרון, 1024 על 1024 פיקסלים, שש פרוסות אופטיות Z-stack, 1.2 יחידה אוורירית או 39 מיקרומטר, 5% עוצמת לייזר של 488 ננומטר ו 25 מילי וואט, זמן פיקסל 2.06 מיקרו-שניות, זמן קו 4.95 אלפיות השנייה, זמן מסגרת 5.06 שניות, מהירות סריקת LSM של שש, סריקה דו-כיוונית, רווח גלאי PMT ב-650 וולט ורווח דיגיטלי של אחד. לחץ על התחל ניסוי כפתור תחת הכרטיסייה רכישה כדי ליצור תמונה ברזולוציה גבוהה של DRG. טען את פרוטוקול הסריקה המהירה של המיקרוסקופ, ורשום פעילות ספונטנית ב- DRG במשך 80 מחזורים.
צור סרט הקרנה אורתוגונלי וודא שהתמונה באיכות מספקת לניתוח. להחלת גירויים, הגדר את המיקרוסקופ לביצוע 15 עד 20 סריקות. המתן להשלמת סריקות אחת עד חמש כדי להפיק את קו הבסיס.
החל את הגירוי במהלך סריקות שש עד 10. המתן לפחות חמש דקות לאחר כל גירוי לפני החלת הגירוי הבא כדי למנוע דה-סנסיטיזציה. ללחיצה מכנית, החזיקו את הפינצ'ר של האלגומטר עם הכף בין המשוטים מבלי לגעת בכפה.
צבוט את הכף מיד לאחר סיום סריקה חמש ועצור מיד לאחר סריקה 10. עקוב אחר כוח הלחיצה באמצעות אלגומטר, וודא שהוא אינו עולה על 10 גרם מעל הכוח הרצוי. לגירויים תרמיים, חממו מים בדיוק מעל הטמפרטורה הרצויה.
כאשר המים נמצאים בטמפרטורה הנכונה, יש להפעיל את הגירוי מיד לאחר הסריקה החמישית על ידי טבילת הכף במים. משכו את הכד מיד לאחר סריקה 10. חשיפה כירורגית L5 DRG ואחריה מיקרוסקופ קונפוקלי אפשרה עד 1, 800 נוירונים להיות הדמיה בבת אחת באמצעות עכברי Pirt-GCaMP3.
נוירונים חושיים ראשוניים נצפו באנסמבל ברמת האוכלוסייה עבור מעברי סידן ספונטניים בהיעדר גירויים ובתגובה לגירויים בהקשר הפיזיולוגי הרגיל שלהם. גירויים חזקים או חום מזיק הגבירו את תגובות הסידן. בהשוואה ללחיצה עם 100 גרם, לחיצה עם 300 גרם הגדילה את מספר תאי העצב המייצרים מעבר סידן ואת אזור הדלתא F על ידי F0 מתחת לעקומה.
חום חם בטווח טמפרטורות לא מזיק של 21 ו -45 מעלות צלזיוס הגדיל את מספר תאי העצב המייצרים מעברי סידן ואת אזור הדלתא F על ידי F0 מתחת לעקומה. טמפרטורות לא מזיקות הפעילו מספר קטן יותר של תאי עצב המייצרים חולפים בהשוואה לגירוי חום מזיק בטמפרטורה של 57 מעלות צלזיוס. יתר על כן, נוירונים בקוטר קטן ובינוני ייצרו סידן חולף באופן ספונטני ומתחת לכל הגירויים, אך נוירונים בקוטר גדול יותר ייצרו רק סידן חולף בתגובה לגירוי העיתונות של 300 גרם.
ה- DRG צריך להיות מפולס ועובי פרוסה אופטי אופטימלי. זה צריך להיות כזה שאתה יכול לזהות את המספר המרבי של תאים ואין waviness בסרט. טכניקה זו שימשה לניתוח שיטות חושיות ברמת האוכלוסייה עבור סומטוסנסציה וטעם ולחקר תאי עצב סמוכים הפועלים בזוגות או בצבירים מסונכרנים התורמים לכאב כרוני ונוירופתי.
