Name: measuring oxidative stress resistance of caenorhabditis elegans in 96-well microtiter plates
Uploaded: 2015-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates at JoVE.com

אנו מכירים את מרכז Caenorhabditis הגנטיקה לג זני elegans. תמיכת מימון ניתן על ידי טרי פוקס מכון המחקר. אנחנו גם מכירים תמיכה שניתנה לEP מRolande ומרסל גוסלין בוגר Studentship ומענק אימון CIHR / FRSQ בFRN53888 חקר הסרטן של חקר סרטן תכנית הכשרת מקגיל המשולבת.

1. הכנת ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מדיה לג צמיחת elegans (במקרה זה, חיות בר-סוג ובעלי חיים flcn-1 (ok975) מוטציה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן השתנה Bacto-peptone בלבד (MYOB) התערובת היבשה של Youngren המכילה 5.5 גרם של טריס HCl, 2.4 גרם של בסיס טריס, 31 גרם של Bactopetone, 20 גרם של NaCl ו0.08 גרם של כולסטרול. מערבבים היטב עם רעד. הערה: תערובת זו מספיקה כדי להכין 10 ליטר של מדיום MYOB. הערה: ניתן להשתמש בצלחות רגילה מדיום גידול (NGM) במקום צלחות MYOB 27. עם זאת, אותו הסוג של צלחות יש להשתמש להשוואות תקפות בין זנים ובין חזרות עצמאיות. בפרוטוקול זה, השתמשנו רק צלחות MYOB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של מדיום MYOB ידי הוספת 6 גרם של תערובת יבשה MYOB, 17 גרם של אגר ולעשות עד 1 ליטר עם H 2 O וחיטוי במשך 45 דקות ב 122 מעלות צלזיוס. יוצקים צלחות ולתת יבשים ב RT עבור 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות טכניקה סטרילית, לחסן של cultu 100 מיליליטרמחדש של מדיום מרק LB עם E. חיידקים וcoli OP50 לגדול O / N על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות MYOB הזרע עם א חיידקי coli OP50. מאפשר לו לגדול ב RT במשך 48 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה לdownregulation גן באמצעות RNAi <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחות RNAi האכלת MYOB. המשך כמו בשלבים 1.1.1 ו1.1.2. לאחר מעוקר, תאפשר הבינוני להתקרר לכ -55 מעלות צלזיוס ולהוסיף 1 מיליליטר של 1 β-D-1-thiogalactopyranoside M איזופרופיל (IPTG) ו 1 מיליליטר של 100 מ&quot;מ אמפיצילין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס ה coli HT115 חיידקים הפכו עם פלסמיד, שמבטא גם EV שליטה או RNAi flcn-1 ספציפי על אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) / tetracyclin (15 מיקרוגרם / מיליליטר) אגר צלחות. לגדול תרבות O / N על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבות ולחסן E. coli HT115 חיידקים הפכו עם פלסמיד המבטא גם EV השליטה או flcn-1 RNAi הספציפי ולגדול תרבות במדיום LB / אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) וO / N ב 37 &amp; #176; C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות זרע עם א coli HT115 EV חיידקים או חיידקי RNAi HT115 flcn-1. הערה: שמור צלחות 48 שעות בRT לפני השימוש. אם RNAi מציאה על ידי האכלה היא בתוקף, להשתמש בשיטות אחרות של משלוח של DS-רנ&quot;א 28. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרימת סטרס חמצונים באמצעות paraquat (PQ): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ M9 ידי ערבוב 3 גרם של KH 2 PO 4, 6 גרם של Na 2 HPO 4, 5 גרם של NaCl ו0.25 גרם של MgSO 4 · 7 H 2 O. להביא עד 1 ליטר עם מים מזוקקים. פתרון החיטוי במשך 45 דקות ב 122 מעלות צלזיוס בקבוקים ולאחסן ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של assay, להכין את פתרון M9 / PQ המכיל. לפרוטוקול זה, השתמש 100 מ&quot;מ PQ (.1028 גרם של PQ המומס ב 4 מיליליטר של חיץ M9 ממלא צלחות גם כל 96 עם 40 μl של M9 / PQ בכל טוב). זהירות: PQ הוא תרכובת מסוכנת ורעילה ביותר. ידית על פי הנחיות מתאימות. הערה: בעת הפעלה של חדש הראשונהרכבת או מצב חדש, מומלץ assay הישרדות בהגדלת ריכוזים של PQ כדי לקבוע את הריכוז הטוב ביותר להשתמש כדי להרוג חיות בתוך 7-10 שעות. </li></ol></li></ol> 2. הכנת אוכלוסיית L4 מסונכרנת-גיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 20 הרמפרודיטים מבוגרים הרה להולדת לצלחת MYOB טרי זורעים עם E. חיידקי coli OP50. הכן כמה צלחות המבוססות על המספר של תולעי צורך במהלך assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר להם להטיל ביצים במשך שעה 6 ולאחר מכן באמצעות תולעת חוט פלטינה לאסוף להסיר את האמהות. בדוק את הצלחות תחת מיקרוסקופ כדי להעריך את מספר הביצים שהוטלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר הביצים לבקוע ולגדול ב 20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. בשלב זה, בעלי החיים נמצאים ב/ שלב בוגר מאוחר L4 צעיר. פיק אותו שלב חיות ולהעביר לבארות המכיל פתרון PQ. הערה: מאחר 48 הדגירה שעה חלה רק על מוטציות שגדלות באופן דומה לחיות בר-סוג, חשוב לפקח התפתחותיתשיעור מוטציות שנבדקו חדש כדי להבטיח שהיא עומדת בקצב הפיתוח בר-הסוג, אחרת, יש להשתמש בצירה זמן אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להשתמש בטכניקות סנכרון. צור אוכלוסייה מסונכרנת של תולעי זחלי L1 באמצעות פתרון hypochlorite (25 מיליליטר מים, 125 מיליליטר של 5.25% נתרן היפוכלוריט, 50 מיליליטר של 4 M NaOH; לעטוף בקבוק בנייר אלומיניום כדי לבודד מהאור). עם זאת, עבור assay זה, זה אינו מומלץ, שכן הלבנה אינטנסיבית עשויה להשפיע על התנהגותם של בעלי החיים במהלך assay. זהירות: טפל בפתרון hypochlorite על פי הנחיות. הערה: בעת שימוש RNAi להסדיר את הגן של עניין, לסנכרן את הרמפרודיטים כפי שתואר בסעיף 2, למעט העברת האמהות לצלחות RNAi זרע עם חיידקי RNAi הספציפיים. כאשר מציאה עם RNAi היא חלשה, האכלה למספר דורות מומלצת. </li></ol> 3. ביצוע סטרס חמצוני ההתנגדות Assay &lt;/ P&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 40 μl של פתרון 100 מ&quot;מ PQ (מוכנים טרי) לכל גם צלחת 96 היטב. השתמש לפחות 12 בארות כמשכפל של כל תנאי (טיפול, מוטציה, וכו &#39;). באמצעות איסוף תולעת חוט פלטינה, להעביר 5-8 חיות זחלי L4 לכל המציינים את שעת ההתחלה ושעת הסיום היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מתחיל מצב אחר, שים לב לשעת ההתחלה ושעת הסיום. מניחים את הצלחת על 20 מעלות צלזיוס בזמן הדגירה בין העברת התולעים ובקיע חיות מתות כעבור שעה מרגע ההתחלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לספור הישרדות כל שעה. נער בעדינות את הצלחת לפני שמתחיל לספור. מצביע תולעים שלא זזו, אפילו אחרי שהבחין באור בעוצמה גבוהה, כמו חיות מתות. כמו כן לציין את מספר בעלי החיים בחיים. הערה: כאשר מסתכלים על צורת תולעת, זנבות ותנועת הראש בהגדלה גבוהה, לעזור לקבוע תולעים מתים מחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה זו בכל שעה עד שרוב התולעים מתים. </li></ol> &lt;class = &quot;jove_title&quot; p&gt; 4. קביעת אחוז הישרדות בכל זמן נקודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את המספר הכולל של בעלי חיים לכל מצב על ידי הוספת המספר הכולל של בעלי חיים הועברו לכל גם. להתעלם מבעלי החיים שנפגעו או נהרגו על העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל נקודת זמן, לחשב את המספר הכולל של חיות מתות לכל מצב (סכום של חיות מתות בבארות 12). עבור כל נקודת זמן, לחשב את האחוז של מוות (מספר חיות מתות מחולקות במספר כולל של בעלי חיים וכפולים 100) ואחוז ההישרדות (100 מינוס מות אחוזים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור assay זה לפחות 3 פעמים עצמאיות. </li></ol>

<ol>
	<li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).</li><li>Alfadda, A. A., Sallam, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+health+and+disease.">Reactive oxygen species in health and disease.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, 936486 (2012).</li><li>Finkel, T., Holbrook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidants,+oxidative+stress+and+the+biology+of+ageing.">Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing.</a> Nature. 408, 239-247 (2000).</li><li>Di Carlo, M., Giacomazza, D., Picone, P., Nuzzo, D., San Biagio, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+the+key+players+in+the+neurodegenerative+diseases.">Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in the neurodegenerative diseases.</a> Free Radic Res. 46, 1327-1338 (2012).</li><li>Gandhi, S., Abramov, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+oxidative+stress+in+neurodegeneration.">Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration.</a> Oxid Med Cell Longev. 2012, 428010 (2012).</li><li>Trushina, E., McMurray, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases.">Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases.</a> Neuroscience. 145, 1233-1248 (2007).</li><li>Touyz, R. M., Briones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+and+vascular+biology:+implications+in+human+hypertension.">Reactive oxygen species and vascular biology: implications in human hypertension.</a> Hypertens Res. 34, 5-14 (2011).</li><li>Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+oxidative+stress+as+an+anticancer+strategy.">Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 931-947 (2013).</li><li>Sosa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+cancer:+an+overview.">Oxidative stress and cancer: an overview.</a> Ageing research reviews. 12, 376-390 (2013).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans:+Causal+or+Casual+Relationship.">Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship.</a> Antioxid Redox Signal. 13, 1911-1953 (2010).</li><li>Baumeister, R., Schaffitzel, E., Hertweck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+controls+stress+response+and+longevity.">Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity.</a> J Endocrinol. 190, 191-202 (2006).</li><li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnol J. 5, 1261-1276 (2010).</li><li>Rodriguez, M., Snoek, L. B., De Bono, M., Kammenga, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+under+stress:+C.+elegans+stress+response+and+its+relevance+to+complex+human+disease+and+aging.">Worms under stress: C. elegans stress response and its relevance to complex human disease and aging.</a> Trends Genet. 29, 367-374 (2013).</li><li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical approach series. , 282 (1999).</li><li>C. elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turn+to+the+worm!.">Turn to the worm!.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 7, 410-415 (1997).</li><li>Wheelan, S. J., Boguski, M. S., Duret, L., Makalowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+nematode+orthologs--lessons+from+the+analysis+of+1800+human+genes+and+the+proteome+of+Caenorhabditis+elegans.">Human and nematode orthologs--lessons from the analysis of 1800 human genes and the proteome of Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 238, 163-170 (1999).</li><li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes.">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Hum Mol Genet. 9, 869-877 (2000).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+approaches+in+C.+elegans.">Functional genomic approaches in C. elegans.</a> Methods Mol Biol. 351, 127-138 (2006).</li><li>Poulin, G., Nandakumar, R., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screens+in+Caenorhabditis+elegans:+impact+on+cancer+research.">Genome-wide RNAi screens in Caenorhabditis elegans: impact on cancer research.</a> Oncogene. 23, 8340-8345 (2004).</li><li>Moreno-Arriola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+A+Useful+Model+for+Studying+Metabolic+Disorders+in+Which+Oxidative+Stress+Is+a+Contributing+Factor.">Caenorhabditis elegans: A Useful Model for Studying Metabolic Disorders in Which Oxidative Stress Is a Contributing Factor.</a> Oxid Med Cell Longev. , 705253 (2014).</li><li>Possik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folliculin+regulates+ampk-dependent+autophagy+and+metabolic+stress+survival.">Folliculin regulates ampk-dependent autophagy and metabolic stress survival.</a> PLoS Genet. 10, e1004273 (2014).</li><li>Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., Moriyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+cytotoxicity+of+paraquat.">Mechanism of cytotoxicity of paraquat.</a> Environ Health Prev Med. 7, 89-94 (2002).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+is+dispensable+for+normal+animal+lifespan.">Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 5785-5790 (2012).</li><li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress.">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metab. 6, 280-293 (2007).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Timmons, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+methods+for+RNA+interference+in.">Delivery methods for RNA interference in.</a> C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 119-125 (2006).</li><li>Wang, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+Eyes+Absent+Ortholog+EYA-1+Is+Required+for+Stress+Resistance.">Caenorhabditis elegans Eyes Absent Ortholog EYA-1 Is Required for Stress Resistance.</a> Biochemistry (Mosc). 79, 653-662 (2014).</li><li>Paz-Gomez, D., Villanueva-Chimal, E., Navarro, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DEAD+Box+RNA+helicase+VBH-1+is+a+new+player+in+the+stress+response+in+C.+elegans.">The DEAD Box RNA helicase VBH-1 is a new player in the stress response in C. elegans.</a> PLoS One. 9, 97924 (2014).</li><li>Ward, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+the+C.+elegans+acyl-CoA+synthase,+acs-3,+and+nuclear+hormone+receptor,+nhr-25,+cause+sensitivity+to+distinct,+but+overlapping+stresses.">Defects in the C. elegans acyl-CoA synthase, acs-3, and nuclear hormone receptor, nhr-25, cause sensitivity to distinct, but overlapping stresses.</a> PLoS One. 9, 92552 (2014).</li><li>Staab, T. A., Evgrafov, O., Knowles, J. A., Sieburth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+synaptic+nlg-1/neuroligin+abundance+by+the+skn-1/Nrf+stress+response+pathway+protects+against+oxidative+stress.">Regulation of synaptic nlg-1/neuroligin abundance by the skn-1/Nrf stress response pathway protects against oxidative stress.</a> PLoS Genet. 10, e1004100 (2014).</li><li>Greer, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AMPK-FOXO+pathway+mediates+longevity+induced+by+a+novel+method+of+dietary+restriction+in.">An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in.</a> C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).</li><li>Allen, E., Walters, I. B., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brivanib,+a+dual+FGF/VEGF+inhibitor,+is+active+both+first+and+second+line+against+mouse+pancreatic+neuroendocrine+tumors+developing+adaptive/evasive+resistance+to+VEGF+inhibition.">Brivanib, a dual FGF/VEGF inhibitor, is active both first and second line against mouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance to VEGF inhibition.</a> Clin Cancer Res. 17, 5299-5310 (2011).</li><li>Apfeld, J., O'Connor, G., McDonagh, T., DiStefano, P. S., Curtis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMP-activated+protein+kinase+AAK-2+links+energy+levels+and+insulin-like+signals+to+lifespan+in+C.+elegans.">The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin-like signals to lifespan in C. elegans.</a> Genes Dev. 18, 3004-3009 (2004).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+AMP-activated+protein+kinase+AAK-2+is+phosphorylated+by+LKB1+and+is+required+for+resistance+to+oxidative+stress+and+for+normal+motility+and+foraging+behavior.">The Caenorhabditis elegans AMP-activated protein kinase AAK-2 is phosphorylated by LKB1 and is required for resistance to oxidative stress and for normal motility and foraging behavior.</a> J Biol Chem. 283, 14988-14993 (2008).</li><li>Honda, Y., Honda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+daf-2+gene+network+for+longevity+regulates+oxidative+stress+resistance+and+Mn-superoxide+dismutase+gene+expression+in+Caenorhabditis+elegans.">The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans.</a> FASEB J. 13, 1385-1393 (1999).</li><li>Restif, C., Metaxas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+swimming+motions+of+C.+elegans+worms+with+applications+in+aging+studies.">Tracking the swimming motions of C. elegans worms with applications in aging studies.</a> Med Image Comput Comput Assist Interv. 11, 35-42 (2008).</li><li>Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+automated+measurement+of+nematode+swimming+(thrashing)+without+morphometry.">Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry.</a> BMC Neurosci. 10, 84 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

סי אלגנס הוא אורגניזם מודל אטרקטיבי ללמוד התנגדות מתח גנטי חמצוני in vivo שכן הוא יכול להיות בקלות בתרבית, ומהירות מוביל למספר רב של צאצאים זהים גנטי. מספר שיטות למדידת התנגדות סטרס חמצונים תוארו בעבר והם מבוססים על התוספים של צלחות תרבות עם מקורות ROS שונים כגו...

A reference was corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/52746">Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates</a>. There was an error with reference 34 in the Citations section. It has been updated from:
Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).
to:
Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., &#38; Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).

Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

באאוקריוטים, זרחון חמצוני מתרחשים בשרשרת הובלת אלקטרונים של המיטוכונדריה הוא הנהג העיקרי של ייצור אנרגיה בצורה של ה- ATP. מיני חמצן מגיבים (ROS) הם תוצר לוואי טבעי של תהליך זה. למרות תפקידם החשוב כמולקולות איתות, ROS מוגזם יכול לגרום לנזק לדנ&quot;א, carbonylation חלבון, וחמצון שומנים בדם. חוסר איזון בין ייצור וסילוק הרעלים ROS גורם ללחץ חמצוני, מה שמוביל לדלדול אנרגיה, נזק לתאים, וגורם לתא מוות 1,2. סטרס חמצונים תורמים להזדקנות וההתפתחות של מחלות מסכנות חיים רבות, כולל סרטן, סוכרת, לב וכלי דם ומחלות ניווניות 3-9. תאים התפתחו אסטרטגיות הגנה האנזימטית ואינם אנזימטית כדי לשמור על רמות ROS נכונים ולהגן על בוחריהם מפני נזק חמצוני 1,2. סופראוקסיד דיסמוטאז אנזימים (SOD) לפעול ראשון לconveסופראוקסיד RT לH 2 O 2, אשר מאוחר יותר הופך למים על ידי catalase או אנזימי peroxidase. אסטרטגיות הגנה האנזימטית ללא כוללות בעיקר מולקולות המגיבות מהר יותר עם ROS בהשוואה למקרו-מולקולות תאיות, הגנה על מרכיבים תאיים חיוניים. למרות התפקיד המגן של ROS הטיהור אנזימים, כמה מולקולות ROS לברוח מנגנוני הגנה נוגדי חמצון ולגרום לנזק חמצוני. איתור, תיקון, והשפלה של המרכיבים התאיים הפגומים אסטרטגיות הגנה חיוניות בסטרס החמצונים 1,2. מסלולי איתות מעורבים בהתנגדות ללחץ ומתח במיוחד חמצוני הם מאוד שמורים באבולוציה 10,11. בניגוד לניסויי תא תרבות שבה תנאי האורגניזם הם בתמונות באופן חלקי בלבד, המחקר של סטרס חמצונים באורגניזמים מודל 12,13 יש משמעות רבה. ג elegans הוא נמטודות חיים חופשיים שיכול להיות בקלות ובזול רחוב ללאשניחן בדשא חיידקים על תקשורת אגר. הוא קטן בגודלם (כ 1 מ&quot;מ אורך) ובדרך כלל גדל כאנדרוגינוס דישון עצמי, המאפשר מניפולציות גנטיות. יש לה מחזור חיים מהיר ויכולת רבייה גבוהה, הפקה כ -300 צאצאים לדור, מה שהופך אותו לכלי רב עוצמה כדי לבצע מסכי גנטיים בקנה מידה גדולה 14. ג הגנום elegans הוא רצף באופן מלא ו40-50% מהגנים הם חזו להיות homologues של גנים הקשורים למחלות אנושיים 15-18. מציאה של גנים של עניין באמצעות RNAi היא מהירה וקל בג elegans. ג&#39;ין את הרגולציה יכול להיות מושגת על ידי האכלת בעלי החיים א חיידקי coli כי נמל פלסמיד המבטא את RNA פעמיים תקועים שמכוון את ה- mRNA של עניין 19. לכן, קביעת תפקוד גן באמצעות מסכי RNAi בקנה מידה גדולה יש השפעה רבה על הבנת מחלות בבני אדם, כולל סרטן 20,21. מחקרים של oהתנגדות מתח xidative בג elegans הוביל לזיהוי של מנגנוני שימור של התנגדות ללחץ חמצוני 13,22. כמה מסלולים המזוהים הם מסלולים נפוצים שלווסת אריכות ימים והתנגדות ללחצים אחרים, כמו גם כמו היפוקסיה, חום, ולחץ האוסמוטי. מסלולים אלה כוללים את איתות האינסולין, איתות TOR, וautophagy. מסלולים מרכזיים אחרים כרוכים סילוק רעלים של ROS כגון אנזימי סופראוקסיד דיסמוטאז ואנזימי catalase, או בתיקון נזק כגון חלבוני הלם חום ומלווה 11,13,22. פרוטוקול זה מתאר כיצד לקבוע את ההתנגדות ללחץ חמצוני של ג elegans בנוזל. השתמשנו flcn-1 (ok975) וחיות בר-סוג להפגין הפרוטוקול מאז שהראינו בעבר התנגדות מוגברת ללחץ חמצוני על אובדן flcn-1 (ok975) בג elegans 23. יש לנו גם הראה כי התנגדות מוגברת זה תלויהעל AMPK וautophagy, ציר איתות שמשפר bioenergetics הסלולרי ומקדם התנגדות מתח 23. PQ הוא לחץ חמצוני שמפריע לשרשרת הובלת אלקטרונים כדי לייצר מיני חמצן מגיב 24. אותו assay יכול להיות מותאם ומקורות ROS אחרים או תרכובות יצירת ROS יכולים לשמש כגון H 2 O 2 וrotenone. מבחני דומים פותחו על צלחות שבו ריכוזים נמוכים של PQ משמשים 25,26. היתרון של assay זה הוא שזה מאוד מהר, ויכול להיות שהושגו התוצאות ביום אחד. בנוסף, ההיקף הכולל של נוזל המשמש לביצוע assay התנגדות סטרס החמצונים ב 96 צלחות גם הוא נמוך בהשוואה לנפח המשמש להכנת לוחות PQ המכיל. לפיכך, הסכום של PQ משמש הוא בassay הנוזלי הוא נמוך, שהופך את assay זול ומגביל את הייצור של פסולת רעילה. עם זאת, מגבלות של assay זה בהשוואה למבחני צלחת כוללות להck של מזון בassay הנוזלי והריכוז הנמוך של חמצן בנוזל בהשוואה לאוויר. אלה הם גורמים חשובים שבמקרים מסוימים, עלול להשפיע על התוצאות. לכן, המאשר שחזור תוך שימוש בשיטות אחרות של התנגדות ללחץ חמצוני מומלץ לתמוך תוצאות שהתקבלו בassay זה.

<table><tbody><tr><td>Agar bacteriological grade</td><td>Multicell</td><td>800-010-LG</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological peptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0037</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride biotechnology grade</td><td>Bioshop</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure tris hydrochloride</td><td>Invitrogen</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>Tris aminomethane</td><td>Bio Basic Canada Inc</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202185A</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Bioshop</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>8013-01-2</td><td></td></tr><tr><td>Methyl viologen dichloride hydrate</td><td>Aldrich chemistry</td><td>856177-1G</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60 x15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 10 ml</td><td>Fisher</td><td>1367520</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>G-Biosciences</td><td>RC-084</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>M-5921</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Discovery v8 stereo zeiss microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well clear microtiter plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;flcn-1&lt;/em&gt; RNAi source</td><td>Ahringer Library</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring oxidative stress resistance of caenorhabditis elegans in 96-well microtiter plates

סטרס חמצונים, אשר הוא התוצאה של חוסר איזון בין ייצור וסילוק רעלים של מיני חמצן מגיבים, הוא תורם עיקרי להפרעות אנושיות כרוניות, כוללים לב וכלי דם ומחלות ניווניות, סוכרת, הזדקנות וסרטן. לכן, חשוב ללמוד סטרס חמצונים לא רק במערכות תא אלא גם באמצעות כל האורגניזמים. ג elegans הוא אורגניזם מודל אטרקטיבי ללמוד את הגנטיקה של מסלולי חמצוני אות מתח התמרה, אשר השמורים ביותר מבחינה אבולוציונית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול למדידת התנגדות סטרס חמצונים בג elegans בנוזל. ריאגנטים לזמן קצר, ROS-התרמה כגון paraquat (PQ) ו- H 2 O 2 מומסים במאגר M9, ופתרונות aliquoted בבארות של צלחת microtiter 96 גם. L4 המסונכרן / מבוגרים צעירים ג בעלי החיים elegans מועברים לבארות (5-8 בעלי חיים / טוב) והישרדות נמדדתבכל שעה עד שרוב התולעים מתים. בעת ביצוע assay התנגדות סטרס חמצונים באמצעות ריכוז נמוך של לחץ בצלחות, הזדקנות עשויה להשפיע על התנהגותם של בעלי חיים על סטרס חמצונים, אשר עלול להוביל לפרשנות שגויה של הנתונים. עם זאת, בassay תאר במסמך זה, בעיה זה לא סביר שיתרחש שכן רק בעלי חיים מבוגרים צעירים L4 / נמצאים בשימוש. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא זול ותוצאות מתקבלות ביום אחד, אשר הופך את הטכניקה הזאת אטרקטיבית למסכים גנטיים. בסך הכל, זה יעזור להבין מסלולי העברת אותות עקה חמצונית, שיכול להיות מתורגם לאפיון טוב יותר של הפרעות אנושיות הקשורים סטרס חמצונים.

השוואת wild-type ג elegans לflcn-1 (ok975) בעלי חיים מוטציה כאן אנו משמשים 100 מ&quot;מ PQ כדי לקבוע את ההתנגדות של ג wild-type elegans בעלי חיים בהשוואה לflcn-1 (ok975) אשר הוכח להתנגד סטרס חמצונים, חום, ואנוקסיה 23. לאחר 4 שעות של טיפול, 48.3% ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates at JoVE.com

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

מדידת התנגדות סטרס חמצוני של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; בצלחות microtiter 96-היטב

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

measuring-oxidative-stress-resistance-caenorhabditis-elegans-96-well

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

15.4K Views.  McGill University. C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates. 

Video: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Biochemistry

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple and inexpensive method to obtain a large number of animals for the isolation of proteins to proceed with a western blot, mass spectrometry, or further proteomics analyses. Furthermore, an increase of nematode numbers for immunostainings and the integration of multiple analyses under the same culturing conditions can easily be achieved. Additionally, a transfer between plates with different experimental conditions is facilitated. Common techniques in plate culture involve the transfer of a single C. elegans using a platinum wire and the transfer of populated agar chunks using a scalpel. However, with increasing nematode numbers, these techniques become overly time-consuming. This protocol describes the large-scale culture of C. elegans including numerous steps to minimize the impact of the sample preparation on the physiology of the worm. Fluid and shear stress can alter the lifespan of and metabolic processes in C. elegans, thus requiring a detailed description of the critical steps in order to retrieve reliable and reproducible results. C. elegans is a model organism, consisting of neuronal cells for up to one-third, but lacking blood vessels, thus providing the possibility to investigate solely neuronal alterations independent of vascular control. Recently, early neurodegeneration in diabetic retinopathy was found prior to vascular alterations. Thus, C. elegans is of special interest for studying general mechanisms of diabetic complications. For example, an increased formation of advanced glycation end products (AGEs) and reactive oxygen species (ROS) is observed, which are reproducibly found in C. elegans. Protocols to handle samples of adequate size for a broader spectrum of investigations are presented here, exemplified by the study of diabetes-induced biochemical alterations. In general, this protocol can be useful for studies requiring large C. elegans numbers and in which liquid culture is not suitable.

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

This protocol describes a method for the large-scale cultivation of Caenorhabditis elegans on solid media. As an alternative to liquid culture, this protocol allows obtaining parameters of different scales under plate-based cultivation. This increases the comparability of results by omitting the morphological and metabolic differences between liquid and solid media culture.

מבוסס על צלחת Large-scale טיפוח Caenorhabditis elegans: הכנת הדוגמא על המחקר של שינויים מטבוליים בחולי סוכרת

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Genetics

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

לימוד לחץ חימצוני נגרם על-ידי Streptococci קבוצה מיטיס ב Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Developmental Biology

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

מדידות התגובות הפיזיולוגיות של הלחץ בג. אלגיה

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

הקרנה בתפוקה גבוהה של מבודדים מיקרוביאליים עם השפעה על בריאות Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

C. elegans Survival Assay: A Short-Term Toxicity Test

Source: Possik, E. and Pause, A. <a href="https://www.jove.com/video/2496/measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter">Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video introduces a short-term survival assay that tests a treatment for acute toxicity or tests a genetic strain for resistance to a toxic condition.&#160; The example protocol shows an example survival assay in which worms are tested for their ability to&#160; resist oxidative stress induced by paraquat (PQ).

ג. אלגנס בדיקת הישרדות: מבחן רעילות לטווח קצר

Source: Possik, E. and Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.&#160;J. Vis. Exp. ...

מדידת התנגדות סטרס חמצוני של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video