Мы признаем Caenorhabditis генетический центр для C. штаммы Элеганс. Финансовая поддержка была предоставлена ​​Терри Фокс-исследовательского института. Мы также признаем, поддержку эксплуатацию ЕР от Роланд и Марсель Госслин Высшей студенчества и подготовки гранта CIHR / FRSQ в исследовании рака FRN53888 в Макгилл Комплексной программы подготовки исследования рака.

1. Подготовка реагентов <ol><li> Подготовка средств массовой информации для С. Рост Элеганс (в данном случае, животных дикого типа и flcn-1 (ok975) мутантных животных). <ol><li> Готовят изменены только Бакто-пептон (грецкий) сухой смеси, содержащей Youngren 5,5 г Трис HCl, 2,4 г трис-основани, 31 г Bactopetone, 20 г NaCl и 0,08 г холестерина. Хорошо перемешать, встряхивая. Примечание: Эта смесь является достаточным для получения 10 л MYOB среды. Примечание: Нормальные ростовую среду (НГМ) пластины может быть использован вместо грецкий пластин 27. Тем не менее, тот же тип пластины должны быть использованы для сравнения между действительными и штаммов между независимыми повторами. В этом протоколе, мы использовали только грецкий пластины. </li><li> Подготовка 1 л MYOB среды путем добавления 6 г MYOB сухой смеси, 17 г агара и составляют до 1 л Н 2 О и автоклав в течение 45 мин при 122 ° С. Налейте пластин и дайте высохнуть при комнатной температуре в течение 2 дней. </li><li> Использование стерильных, привить 100 мл cultuRe Л.Б. бульона среде с Е. палочка OP50 бактерии и расти O / N на 37 ° C. </li><li> Семя MYOB пластины с Е. палочка OP50 бактерий. Позвольте ему расти при комнатной температуре в течение 48 ч. </li></ol></li><li> Подготовка к генной подавлением с использованием RNAi <ol><li> Подготовка грецкий РНК-интерференции кормления пластины. Действуйте, как в шагах 1.1.1 и 1.1.2. После автоклавирования среда позволяют охладиться до приблизительно 55 ° С и добавляют 1 мл 1 М изопропилового β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) и 1 мл 100 мМ ампициллина. </li><li> Е. подряд палочка HT115 бактерии, трансформированные плазмидой, которая экспрессирует либо управления EV или flcn-1 специфический RNAi на ампициллин (50 мкг / мл) / тетрациклин (15 мкг / мл) чашки с агаром. Выращивают культуры O / N при 37 ° С. </li><li> Выберите колонии и привить Е. палочка HT115 бактерии, трансформированные плазмидой, которая выражает либо контроля Е.В. или flcn-1 РНК-интерференции конкретных и расти культуры в LB / ампициллин (50 мкг / мл) средних и O / N в 37 &amp; #176; С. </li><li> Семенной пластин с Е. палочка HT115 EV бактерии или HT115 flcn-1 RNAi бактерии. ПРИМЕЧАНИЕ: Держите пластины 48 ч при комнатной температуре перед использованием. Если РНК-интерференции нокдаун от кормления в эффективной, использовать другие методы доставки DS-РНК 28. </li></ol></li><li> Стимулирование окислительный стресс, используя параквата (PQ): <ol><li> Подготовьте M9 буфер путем смешивания 3 г КН 2 РО 4, 6 г Na 2 HPO 4, 5 г NaCl и 0,25 г MgSO 4 · 7Н 2 О. Принесите до 1 л дистиллированной воды. Автоклав раствор в течение 45 мин при 122 ° С и хранить при комнатной температуре бутылок. </li><li> В день анализа, подготовить M9 / PQ-содержащий раствор. Для этого протокола, используйте 100 мМ PQ (0,1028 г PQ, растворенного в 4 мл M9 буфера заполняет весь 96-луночных с 40 мкл / M9 PQ на лунку). ВНИМАНИЕ: PQ является опасным и очень токсичен. Обращайтесь в соответствии с соответствующими руководящими принципами. ПРИМЕЧАНИЕ: При первом запуске новых Sпоезд или новое состояние, рекомендуется для анализа выживаемости в увеличении концентрации PQ, чтобы определить наилучший концентрации, чтобы использовать для того, чтобы убить животных в 7-10 ч. </li></ol></li></ol> 2. Подготовка Возраст синхронизированной L4 населения <ol><li> Передача 20 беременных взрослых гермафродитов на свежий MYOB пластины засеянного Е. палочка OP50 бактерий. Подготовьте несколько пластин в зависимости от количества червей, необходимых в процессе анализа. </li><li> Позвольте им, чтобы отложить яйца в течение 6 ч, а затем с помощью платиновой проволоки червя выбрать Удалить матерей. Проверьте пластины под микроскопом, чтобы определить количество яиц. </li><li> Разрешить яйца в люк и расти при 20 ° С в течение 48 ч. В это время, животные в конце L4 / молодой взрослой стадии. Выберите те же стадии животных и передать на PQ решений, содержащих скважин. Примечание: С 48 ч инкубации относится только к мутантам, которые растут так же, как у животных дикого типа, важно контролировать развитияСкорость недавно протестированных мутантов, чтобы обеспечить его соответствие темпов развития дикого типа, в противном случае, другие сроки должны быть использованы. </li><li> Кроме того, использование методов синхронизации. Генерация синхронизированный население L1 личинок червей с использованием гипохлорита раствор (25 мл воды, 125 мл 5,25% раствора гипохлорита натрия, 50 мл 4 М NaOH; обернуть бутылку с алюминиевой фольгой, чтобы изолировать от света). Тем не менее, для этого анализа, не рекомендуется, так как интенсивное отбеливание может повлиять на поведение животных во время теста. ВНИМАНИЕ: Обращайтесь раствор гипохлорита в соответствии с руководящими принципами. ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании RNAi вниз регулировать интерес ген, синхронизировать гермафродитов, как описано в разделе 2, за исключением передачи матерей к РНК-интерференции пластин, посеянных с конкретными бактерий РНК-интерференции. Когда нокдаун с РНК-интерференции является слабым, кормление нескольких поколений рекомендуется. </li></ol> 3. Выполнение окислительного стресса Сопротивление Пробирной &lt;/ P&gt; <ol><li> Пипетка 40 мкл раствора мМ PQ 100 (полученного свежего) к каждой лунке 96-луночного планшета. Используйте по крайней мере 12 скважин, как повторяет каждого условия (лечения, мутанта, и т.д.). Использование платиновой проволоки червя выбор, передать 5-8 L4 личинок животных в каждую лунку с указанием времени начала и время окончания. </li><li> При запуске еще одно условие, обратите внимание на время начала и время окончания. Поместите пластину на 20 ° C во время инкубации между передачи червей и забил мертвых животных через час с момента старта. </li><li> Использование рассекает микроскоп, рассчитывать выживания каждый час. Слегка встряхните пластину, прежде чем начать рассчитывать. Укажите червей, которые не двигаются, даже после кровянистые выделения свет высокой интенсивности, а мертвых животных. Также укажите количество животных в живых. ПРИМЕЧАНИЕ: Глядя на форму червя, хвосты и движения головы при сильном увеличении, поможет определить мертвые черви из живых. </li><li> Повторите этот шаг каждый час, пока большинство червей не мертвы. </li></ol> &lt;р = класс &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Определение выживания Процент на каждый момент времени <ol><li> Рассчитать общее количество животных на каждое условие, добавив общее количество животных, передаваемых в каждую лунку. Не обращайте внимания на животных, которые были повреждены или погибли при передаче. </li><li> Для каждого момента времени, вычислить общее количество погибших животных на каждое условие (сумма мертвых животных в 12 лунок). Для каждого момента времени, расчета процент смерти (число умерших животных, поделенное на общее число животных и умноженное на 100) и процент выживаемости (100 минус процент смерти). </li><li> Повторите этот анализ не менее 3 независимых раза. </li></ol>

<ol>
	<li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).</li><li>Alfadda, A. A., Sallam, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+health+and+disease.">Reactive oxygen species in health and disease.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, 936486 (2012).</li><li>Finkel, T., Holbrook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidants,+oxidative+stress+and+the+biology+of+ageing.">Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing.</a> Nature. 408, 239-247 (2000).</li><li>Di Carlo, M., Giacomazza, D., Picone, P., Nuzzo, D., San Biagio, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+the+key+players+in+the+neurodegenerative+diseases.">Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in the neurodegenerative diseases.</a> Free Radic Res. 46, 1327-1338 (2012).</li><li>Gandhi, S., Abramov, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+oxidative+stress+in+neurodegeneration.">Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration.</a> Oxid Med Cell Longev. 2012, 428010 (2012).</li><li>Trushina, E., McMurray, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases.">Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases.</a> Neuroscience. 145, 1233-1248 (2007).</li><li>Touyz, R. M., Briones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+and+vascular+biology:+implications+in+human+hypertension.">Reactive oxygen species and vascular biology: implications in human hypertension.</a> Hypertens Res. 34, 5-14 (2011).</li><li>Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+oxidative+stress+as+an+anticancer+strategy.">Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 931-947 (2013).</li><li>Sosa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+cancer:+an+overview.">Oxidative stress and cancer: an overview.</a> Ageing research reviews. 12, 376-390 (2013).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans:+Causal+or+Casual+Relationship.">Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship.</a> Antioxid Redox Signal. 13, 1911-1953 (2010).</li><li>Baumeister, R., Schaffitzel, E., Hertweck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+controls+stress+response+and+longevity.">Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity.</a> J Endocrinol. 190, 191-202 (2006).</li><li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnol J. 5, 1261-1276 (2010).</li><li>Rodriguez, M., Snoek, L. B., De Bono, M., Kammenga, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+under+stress:+C.+elegans+stress+response+and+its+relevance+to+complex+human+disease+and+aging.">Worms under stress: C. elegans stress response and its relevance to complex human disease and aging.</a> Trends Genet. 29, 367-374 (2013).</li><li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical approach series. , 282 (1999).</li><li>C. elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turn+to+the+worm!.">Turn to the worm!.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 7, 410-415 (1997).</li><li>Wheelan, S. J., Boguski, M. S., Duret, L., Makalowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+nematode+orthologs--lessons+from+the+analysis+of+1800+human+genes+and+the+proteome+of+Caenorhabditis+elegans.">Human and nematode orthologs--lessons from the analysis of 1800 human genes and the proteome of Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 238, 163-170 (1999).</li><li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes.">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Hum Mol Genet. 9, 869-877 (2000).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+approaches+in+C.+elegans.">Functional genomic approaches in C. elegans.</a> Methods Mol Biol. 351, 127-138 (2006).</li><li>Poulin, G., Nandakumar, R., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screens+in+Caenorhabditis+elegans:+impact+on+cancer+research.">Genome-wide RNAi screens in Caenorhabditis elegans: impact on cancer research.</a> Oncogene. 23, 8340-8345 (2004).</li><li>Moreno-Arriola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+A+Useful+Model+for+Studying+Metabolic+Disorders+in+Which+Oxidative+Stress+Is+a+Contributing+Factor.">Caenorhabditis elegans: A Useful Model for Studying Metabolic Disorders in Which Oxidative Stress Is a Contributing Factor.</a> Oxid Med Cell Longev. , 705253 (2014).</li><li>Possik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folliculin+regulates+ampk-dependent+autophagy+and+metabolic+stress+survival.">Folliculin regulates ampk-dependent autophagy and metabolic stress survival.</a> PLoS Genet. 10, e1004273 (2014).</li><li>Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., Moriyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+cytotoxicity+of+paraquat.">Mechanism of cytotoxicity of paraquat.</a> Environ Health Prev Med. 7, 89-94 (2002).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+is+dispensable+for+normal+animal+lifespan.">Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 5785-5790 (2012).</li><li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress.">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metab. 6, 280-293 (2007).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Timmons, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+methods+for+RNA+interference+in.">Delivery methods for RNA interference in.</a> C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 119-125 (2006).</li><li>Wang, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+Eyes+Absent+Ortholog+EYA-1+Is+Required+for+Stress+Resistance.">Caenorhabditis elegans Eyes Absent Ortholog EYA-1 Is Required for Stress Resistance.</a> Biochemistry (Mosc). 79, 653-662 (2014).</li><li>Paz-Gomez, D., Villanueva-Chimal, E., Navarro, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DEAD+Box+RNA+helicase+VBH-1+is+a+new+player+in+the+stress+response+in+C.+elegans.">The DEAD Box RNA helicase VBH-1 is a new player in the stress response in C. elegans.</a> PLoS One. 9, 97924 (2014).</li><li>Ward, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+the+C.+elegans+acyl-CoA+synthase,+acs-3,+and+nuclear+hormone+receptor,+nhr-25,+cause+sensitivity+to+distinct,+but+overlapping+stresses.">Defects in the C. elegans acyl-CoA synthase, acs-3, and nuclear hormone receptor, nhr-25, cause sensitivity to distinct, but overlapping stresses.</a> PLoS One. 9, 92552 (2014).</li><li>Staab, T. A., Evgrafov, O., Knowles, J. A., Sieburth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+synaptic+nlg-1/neuroligin+abundance+by+the+skn-1/Nrf+stress+response+pathway+protects+against+oxidative+stress.">Regulation of synaptic nlg-1/neuroligin abundance by the skn-1/Nrf stress response pathway protects against oxidative stress.</a> PLoS Genet. 10, e1004100 (2014).</li><li>Greer, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AMPK-FOXO+pathway+mediates+longevity+induced+by+a+novel+method+of+dietary+restriction+in.">An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in.</a> C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).</li><li>Allen, E., Walters, I. B., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brivanib,+a+dual+FGF/VEGF+inhibitor,+is+active+both+first+and+second+line+against+mouse+pancreatic+neuroendocrine+tumors+developing+adaptive/evasive+resistance+to+VEGF+inhibition.">Brivanib, a dual FGF/VEGF inhibitor, is active both first and second line against mouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance to VEGF inhibition.</a> Clin Cancer Res. 17, 5299-5310 (2011).</li><li>Apfeld, J., O'Connor, G., McDonagh, T., DiStefano, P. S., Curtis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMP-activated+protein+kinase+AAK-2+links+energy+levels+and+insulin-like+signals+to+lifespan+in+C.+elegans.">The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin-like signals to lifespan in C. elegans.</a> Genes Dev. 18, 3004-3009 (2004).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+AMP-activated+protein+kinase+AAK-2+is+phosphorylated+by+LKB1+and+is+required+for+resistance+to+oxidative+stress+and+for+normal+motility+and+foraging+behavior.">The Caenorhabditis elegans AMP-activated protein kinase AAK-2 is phosphorylated by LKB1 and is required for resistance to oxidative stress and for normal motility and foraging behavior.</a> J Biol Chem. 283, 14988-14993 (2008).</li><li>Honda, Y., Honda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+daf-2+gene+network+for+longevity+regulates+oxidative+stress+resistance+and+Mn-superoxide+dismutase+gene+expression+in+Caenorhabditis+elegans.">The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans.</a> FASEB J. 13, 1385-1393 (1999).</li><li>Restif, C., Metaxas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+swimming+motions+of+C.+elegans+worms+with+applications+in+aging+studies.">Tracking the swimming motions of C. elegans worms with applications in aging studies.</a> Med Image Comput Comput Assist Interv. 11, 35-42 (2008).</li><li>Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+automated+measurement+of+nematode+swimming+(thrashing)+without+morphometry.">Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry.</a> BMC Neurosci. 10, 84 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

C. Элеганс является привлекательным модельный организм для изучения генетически окислительный стресс устойчивость в естественных условиях, так как он может быть легко культивировать, и быстро приводит к большому количеству генетически идентичных потомков. Различные способ...

A reference was corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/52746">Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates</a>. There was an error with reference 34 in the Citations section. It has been updated from:
Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).
to:
Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., &#38; Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).

Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

У эукариот, окислительного фосфорилирования происходит в электрон-транспортной цепи митохондрий является основным фактором производства энергии в форме АТФ. Активные формы кислорода (АФК) являются естественным побочным продуктом этого процесса. Несмотря на их важную роль в качестве сигнальных молекул, чрезмерное АФК может привести к повреждению ДНК, белков карбонилирования и окисления липидов. Дисбаланс между АФК и детоксикации вызывает окислительный стресс, что приводит к истощению энергии, клеточных повреждений, и запускает клеточную гибель 1,2. Окислительный стресс способствует старению и развитию многих угрожающих жизни заболеваний, включая рак, диабет, сердечно-сосудистые и нейродегенеративные заболевания 3-9. Клетки развивались ферментативные и неферментативные стратегии защиты, чтобы поддерживать надлежащий уровень АФК и защитить своих избирателей от окислительного повреждения 1,2. Супероксиддисмутазы (СОД) ферменты действуют первым удобстRT супероксид-Н 2 О 2, который затем преобразуется в воде каталазы или пероксидазы ферментов. Номера ферментативные оборонные стратегии включают в себя в основном молекулы, которые реагируют быстрее с АФК по сравнению с клеточными макромолекулами, защищающих основные клеточные компоненты. Несмотря на защитной роли АФК детоксикации ферменты, некоторые молекулы АФК избежать антиоксидантными защитные механизмы и привести к окислительному повреждению. Обнаружение, ремонт и деградация поврежденных клеточных компонентов основных стратегий защиты во время окислительного стресса 1,2. Сигнальных путей, участвующих в стрессоустойчивости и специально окислительного стресса высоко эволюционно консервативны 10,11. В отличие от экспериментов культивирования клеток, где организменном условия лишь частично воспроизведена, исследования окислительного стресса в модельных организмов 12,13 имеет большое значение. С Элеганс является свободно живущих нематод, которые могут быть легко и недорого культывается на бактериальной газон на агаре. Это небольшой по размеру (около 1 мм в длину) и нормально растет в качестве самостоятельного удобрения гермафродита, что облегчает генетические манипуляции. Он имеет быстрый жизненный цикл и высокую репродуктивную способность, производя около 300 потомков на поколение, что делает его мощным инструментом для выполнения масштабных генетических экраны 14. С. Элеганс генома полностью секвенировали и 40-50% генов, по прогнозам, будет гомологов болезни генов, ассоциированных с человека 15-18. Нокдаун генов интерес, используя RNAi является быстрым и легким в С. Элеганс. Джин вниз регулирование может быть достигнуто путем кормления животных Е. палочки бактерии, которые укрывают плазмиды, выражающее двухцепочечной РНК, которая нацелена на мРНК интерес 19. Таким образом, определение функции генов с использованием крупномасштабных RNAi экраны имеет большое влияние на понимание заболеваний человека, включая рак 20,21. Исследования Oxidative стрессоустойчивость в С. Элеганс привели к идентификации консервативных механизмов резистентности к окислительному стрессу 13,22. Некоторые пути, выявленные общие пути, которые модулируют долговечность и устойчивость к другим стрессам, а также такие, как гипоксия, тепло, и осмотического стресса. Эти пути включают в себя секрецию инсулина, сигнализации TOR, и аутофагии. Другие ключевые пути привлечь детоксикации АФК, таких как супероксиддисмутаза ферментов и каталазы ферментов, или в репарации повреждений, таких как теплового шока и белков-шаперонов 11,13,22. Этот протокол описывает, как определить устойчивость к окислительному стрессу С. Элеганс в жидкости. Мы использовали flcn-1 (ok975) и животных дикого типа, чтобы продемонстрировать протокол, так как мы показали ранее повышенную устойчивость к окислительному стрессу при потере flcn-1 (ok975) на C. Элеганс 23. Мы также показали, что повышенное сопротивление зависитна AMPK и аутофагии, оси сигнализации, что повышает клеточный биоэнергетику и способствует стрессоустойчивости 23. PQ является окислительный стресс, который влияет на электрон-транспортной цепи для производства видов реактивного кислорода 24. Анализ же могут быть адаптированы и другие источники ROS ROS или генерирующие соединения могут быть использованы, например, H 2 O 2 и ротенона. Аналогичные анализы были разработаны на пластинах, где низкие концентрации PQ используются 25,26. Преимущество такого анализа является то, что очень быстро, а результаты могут быть получены в один день. Кроме того, общий объем жидкости, используемой для выполнения окислительный стресс-устойчивости анализа в 96-луночных планшетах является низкой по сравнению с объемом, используемого для получения PQ-содержащие пластины. Таким образом, количество PQ используется в жидком тесте низкий, что делает этот анализ недорого и ограничивает производство токсичных отходов. Однако ограничения данного анализа по сравнению с пластинчатыми анализов включают ЛАCK пищи в жидком тесте и низкой концентрации кислорода в жидкости по сравнению с воздухом. Они являются важными факторами, которые в некоторых случаях, может повлиять на результаты. Таким образом, подтверждающие воспроизводимость с помощью других методов окислительного стресса сопротивления рекомендуется, чтобы поддержать результаты, полученные в этом тесте.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar bacteriological grade</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>800-010-LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride biotechnology grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8503-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure tris hydrochloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15506-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris aminomethane</td>
			<td>Bio Basic Canada Inc</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-202185A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Bio Basic Inc.</td>
			<td>8013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl viologen dichloride hydrate</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
			<td>856177-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60x15mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 10ml</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1367520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>RC-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-5921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Discovery v8 stereo zeiss microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well clear microtiter plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flcn-1 RNAi source</td>
			<td colspan="2">Ahringer Library</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring oxidative stress resistance of caenorhabditis elegans in 96-well microtiter plates

Окислительный стресс, который является результатом дисбаланса между производством и детоксикации активных форм кислорода, является одной из основных причин хронических заболеваний у человека, в том числе сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний, диабета, старения и рака. Таким образом, важно, чтобы изучить окислительный стресс не только в клеточных системах, но и с помощью целых организмов. С. Элеганс является привлекательной моделью организм изучать генетику окислительных трансдукции сигнала напряжения, которые высоко эволюционно консервативных. Здесь мы предоставляем протокол для измерения окислительного стрессоустойчивости С. Элеганс в жидкости. Вкратце, РОС-индуцирующие реагенты, такие как паракват (PQ) и H 2 O 2 растворяют в буфере M9, и аликвоты растворов в лунках микротитрационного планшета 96 скважины. Синхронное L4 / молодой взрослый С. Элеганс животные передаются в лунки (5-8 животных / а) и выживание измеряетсякаждый час до тех пор, большинство червей не мертвы. При выполнении окислительный стресс сопротивления анализа с использованием низкой концентрации стресса в пластинах, старение может повлиять на поведение животных После окислительного стресса, который может привести к неправильной интерпретации данных. Тем не менее, в исследовании, описанном в данном документе, эта проблема вряд ли произойдет, поскольку используются только L4 / молодых взрослых животных. Кроме того, этот протокол является недорогим и результаты получены в один день, что делает эту технику привлекательной для генетических экранов. В целом, это поможет понять, окислительные пути сигнала напряжение трансдукции, которые могут быть переведены на более характеристик окислительного стресса связанный человека заболеваний.

Сравнивая дикого типа С. Элеганс, чтобы flcn-1 (ok975) мутантных животных Здесь мы использовали 100 мМ PQ для определения сопротивления дикого типа C. Элеганс животных по сравнению с flcn-1 (ok975), который, как было показано, чтобы противостоять окислительного стрес...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates at JoVE.com

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Измерение окислительного стрессоустойчивость<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; В микротитровальных пластинках 96-а

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

measuring-oxidative-stress-resistance-caenorhabditis-elegans-96-well

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

15.3K Views.  McGill University. C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates. 

Video: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни на твердых средах

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Выделение и В пробирке Активация Caenorhabditis Элеганс Сперма

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Покадровый Микроскопия раннего эмбриогенеза в Caenorhabditis Элеганс

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Кап: метод выращивания Arabidopsis И томатов в 96-луночных планшетах для высокопроизводительного генотипирования

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Основной<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Методы синхронизации и наблюдения

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Добыча простагландинов и анализа в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Анализ окислительного стресса у эмбрионов данио рерио

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

Выращивание<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; В трех измерениях в лаборатории

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Измерение коэффициентов потребления кислорода в неповрежденной Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...