Reconocemos el Centro de Genética Caenorhabditis para C. cepas elegans. El apoyo financiero fue proporcionado por el Instituto de Investigación de Fox Terry. También reconocemos el apoyo otorgado a EP de la Rolande y Marcel Gosselin Graduate Beca y la beca de formación CIHR / FRSQ en FRN53888 investigación del cáncer del Programa de Formación de Investigación del Cáncer de McGill Integrado.

1. Preparación de los reactivos <ol><li> Preparación de los medios de comunicación para C. crecimiento elegans (en este caso, los animales de tipo salvaje y los animales FLCN-1 (ok975) mutantes). <ol><li> Prepárese Modificado Sólo Bacto-peptona (MYOB) mezcla seca de Youngren que contiene 5,5 g de Tris HCl, 2,4 g de base Tris, 31 g de Bactopetone, 20 g de NaCl y 0,08 g de colesterol. Mezclar bien con agitación. NOTA: Esta mezcla es suficiente para preparar 10 litros de medio MYOB. NOTA: placas de medio de crecimiento normal (NGM) podrían utilizarse en lugar de placas de 27 MYOB. Sin embargo, el mismo tipo de placas se debe utilizar para comparaciones válidas entre las cepas y entre repeticiones independientes. En este protocolo, sólo utilizamos placas MYOB. </li><li> Preparar 1 l de medio MYOB añadiendo 6 g de MYOB mezcla seca, 17 g de agar y completar hasta 1 l con H2O y autoclave durante 45 minutos a 122 ° C. Verter en las placas y dejar secar a temperatura ambiente durante 2 días. </li><li> Utilizando una técnica estéril, inocular 100 ml de culture de medio de caldo LB con E. bacterias coli OP50 y crecen O / N a 37 ° C. </li><li> Placas MYOB Semilla con E. bacterias coli OP50. Deje que crezca a temperatura ambiente durante 48 horas. </li></ol></li><li> Preparación para la regulación a la baja de genes utilizando RNAi <ol><li> Preparar platos RNAi alimentación MYOB. Proceda como en los pasos 1.1.1 y 1.1.2. Después de la esterilización en autoclave, deje que el medio se enfríe a aproximadamente 55 ° C y añadir 1 ml de 1 M isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y 1 ml de ampicilina 100 mM. </li><li> Streak E. coli HT115 bacterias transformadas con un plásmido, que expresa ya sea de control o FLCN EV-1 RNAi específica sobre ampicilina (50 mg / ml) / tetraciclina (15 g / ml) en placas de agar. Crecer cultivo O / N a 37 ° C. </li><li> Escoja colonias e inocular E. coli HT115 bacterias transformadas con un plásmido que expresa ya sea de control o FLCN EV-1 RNAi específica y crecen en cultivo LB / ampicilina (50 mg / ml) a medio y O / N a 37 &amp; #176; C. </li><li> Placas de semillas con E. coli HT115 EV bacterias o HT115 FLCN-1 RNAi bacterias. NOTA: Mantenga las placas de 48 horas a temperatura ambiente antes de su uso. Si RNAi desmontables por la alimentación es en efectivo, utilice otros métodos de entrega de la ds-RNA 28. </li></ol></li><li> La inducción de estrés oxidativo usando paraquat (PQ): <ol><li> Preparar tampón M9 mediante la mezcla de 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl y 0,25 g de MgSO 4 · 7 H 2 O. Llevar hasta 1 L con agua destilada. Autoclave solución durante 45 minutos a 122 ° C botellas y almacenar a temperatura ambiente. </li><li> En el día del ensayo, preparar la solución de M9 / PQ-que contiene. Para este protocolo, utilizar mM PQ 100 (0.1028 g de PQ disuelto en 4 ml de tampón M9 llena toda una placas de 96 pocillos con 40 l de M9 / PQ por pocillo). PRECAUCIÓN: PQ es un compuesto peligroso y altamente tóxico. Manipular de acuerdo con las directrices apropiadas. NOTA: Cuando se ejecuta primero un nuevo stren o una nueva condición, se recomienda analizar la supervivencia en concentraciones crecientes de PQ para determinar la mejor concentración para utilizar con el fin de matar a los animales dentro de 7 a 10 h. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de sincronizada-Edad L4 Población <ol><li> Transferencia 20 adultos hermafroditas grávidas a una placa MYOB fresco sembrado con E. bacterias coli OP50. Preparar varias placas basadas en el número de gusanos necesarios durante el ensayo. </li><li> Deje que se ponen huevos durante 6 horas y luego utilizando un gusano alambre de platino pick de quitar las madres. Compruebe las placas bajo el microscopio para evaluar el número de huevos puestos. </li><li> Permita que los huevos eclosionan y crecen a 20 ° C durante 48 horas. En este momento, los animales están en un estado adulto finales L4 / joven. Escoja mismos animales de escenario y la transferencia a los pozos que contienen solución-PQ. NOTA: Desde 48 horas de incubación sólo se aplica a los mutantes que crecen de manera similar a los animales de tipo salvaje, es importante vigilar el desarrollotasa de mutantes recién probado para asegurar que se ajusta a la tasa de desarrollo de tipo salvaje, de lo contrario, deben utilizarse otras líneas de tiempo. </li><li> Alternativamente, utilizar técnicas de sincronización. Generar población sincronizada de L1 gusanos larvas utilizando una solución de hipoclorito (25 ml de agua, 125 ml de 5,25% de hipoclorito de sodio, 50 ml de 4 M de NaOH; envuelva botella con papel de aluminio para aislar de la luz). Sin embargo, para este ensayo, no se recomienda, ya intensa blanqueo podría afectar el comportamiento de los animales durante el ensayo. PRECAUCIÓN: Manipular solución de hipoclorito de acuerdo con las directrices. NOTA: Al usar el ARNi para regular por el gen de interés, sincronizar los hermafroditas como se describe en la sección 2, con la excepción de la transferencia de las madres a las placas de RNAi sembradas con la bacteria específica RNAi. Cuando la caída con el ARNi es débil, se recomienda la alimentación para varias generaciones. </li></ol> 3. Realizar el estrés oxidativo Resistencia Ensayo &lt;/ P&gt; <ol><li> Pipetear 40 l de la solución 100 mM PQ (preparado fresco) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Utilice al menos 12 pozos como repeticiones de cada condición (tratamiento, mutante, etc.). El uso de un gusano selección alambre de platino, transferir 5-8 animales larvas L4 a cada bien indicando la hora de inicio y la hora de finalización. </li><li> Al iniciar otra condición, tenga en cuenta el tiempo de inicio y la hora de finalización. Colocar la placa a 20 ° C en el tiempo de incubación entre la transferencia de los gusanos y anotando animales muertos una hora después de la hora de inicio. </li><li> Utilizando el microscopio de disección, cuente la supervivencia cada hora. Agite suavemente la placa antes de comenzar a contar. Indique gusanos que no se mueven, incluso después de ver una luz de alta intensidad, como animales muertos. Asimismo, indique el número de animales vivos. NOTA: En cuanto a la forma de gusano, las colas y el movimiento de la cabeza en la alta ampliación, ayudar a determinar gusanos muertos de vida. </li><li> Repita este paso cada hora hasta que la mayoría de los gusanos están muertos. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Determinación del porcentaje de supervivencia en Every Time Point <ol><li> Calcular el número total de animales por condición sumando el número total de animales transferidos a cada pocillo. No haga caso de los animales que se encuentren dañados o muertos tras la transferencia. </li><li> Por cada punto de tiempo, calcular el número total de animales muertos por enfermedad (suma de los animales muertos en los 12 pozos). Por cada punto de tiempo, calcular el porcentaje de mortalidad (número de animales muertos dividido por el número total de animales y multiplicado por 100) y porcentaje de supervivencia (100 menos ciento muerte). </li><li> Repita este ensayo de al menos 3 veces independientes. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

C. elegans es un organismo modelo atractivo para estudiar la resistencia al estrés oxidativo genéticamente in vivo, ya que puede ser fácilmente cultivada, y rápidamente conduce a un gran número de descendencia genéticamente idéntica. Múltiples métodos para medir la resistencia al estrés oxidativo se han descrito anteriormente y se basan en la administración de suplementos de placas de cultivo con varias fuentes de ROS tales como PQ, rotenona, H 2 O 2, y juglone 25,26,29-32. Aquí se describe un protocolo que mide la resistencia al estrés oxidativo en el líquido en placas de 96 pocillos utilizando mM PQ 100. Un ensayo similar ha sido realizado por Greer et al. 33. Este ensayo podría ser adaptado, además, para estudiar el estrés oxidativo en líquido usando otras fuentes de ROS. Por ejemplo, hemos demostrado que la pérdida de FLCN-1 aumenta la resistencia a varias H 2 O 2 concentraciones tan bien 23. Este ensayo podría ser técnicoly un reto para algunas cepas que muestran defectos de la motilidad o la natación inducida fenotipos parálisis tales como cepas que portan una mutación en el transportador de dopamina dat-1 34. En este caso, la imposibilidad de moverse es confuso ya que no significa necesariamente disminuye la resistencia al estrés oxidativo, sino más bien un defecto de la motilidad. Por otra parte, el conteo de animales muertos debe ser cuidadosamente completado y los investigadores tienen que prestar atención a C. elegans detalles del comportamiento tales como movimientos de la cola, y los movimientos de la cabeza, o los movimientos del cuerpo, incluso lentas. Si la concentración de PQ es demasiado alto, y la cinética de la muerte de los animales es muy rápido, se podría considerar la disminución de la concentración de PQ con el fin de obtener las tasas de mortalidad más bajas. Algunos animales son extremadamente sensibles al estrés oxidativo tales como AAK-2 animales mutantes 26,33,35,36 mientras que otros son altamente resistentes tales como DAF-2 37 animales mutantes. En este caso, el ensayo de supervivencia con diferentes concentrations de PQ deben ser considerados. Para los experimentos de ARNi, los resultados negativos podría ser debido a una ineficiencia del tratamiento RNAi. En este caso, la medición de los niveles de mRNA es esencial para determinar si el gen desmontables tiene éxito. Este protocolo podría ser adaptado, además, para el cribado de alto rendimiento de la resistencia al estrés oxidativo utilizando un detector que sigue el comportamiento natatorio de C. elegans en líquidos 38,39. Potencialmente, esto permitiría a la vigilancia de la resistencia de C. elegans y el comportamiento de natación tales como la frecuencia de flexión bajo estrés oxidativo cuerpo. Las tasas más altas de movimiento del cuerpo podrían indicar mayor aptitud gusano bajo estrés. Vías que conducen a la resistencia al estrés oxidativo en eucariotas inferiores están altamente conservadas a través de la evolución y están vinculadas a las enfermedades asociadas a estrés oxidativo y el envejecimiento en los seres humanos. Mitohormesis y la generatio equilibradan de ROS son esenciales para prolongar la vida y mejorar la duración de la salud. Sin embargo, el exceso de ROS es altamente perjudicial para las células, tejidos / órganos y organismos. Encontrar vías, que si alterado, proporcionan un equilibrio óptimo ROS es, pues, esencial y las pantallas para fármacos que modulan la resistencia al estrés oxidativo podría ayudar al desarrollo de curas para varias enfermedades con el denominador común: el estrés oxidativo. La realización de estas proyecciones en C. elegans es un método rápido, barato y fiable ventajoso que tiene un gran potencial y valor para la comprensión y el tratamiento de enfermedades humanas relacionadas con el estrés oxidativo.

A reference was corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/52746">Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates</a>. There was an error with reference 34 in the Citations section. It has been updated from:
Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).
to:
Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., &#38; Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).

Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

En eucariotas, la fosforilación oxidativa que tiene lugar en la cadena de transporte de electrones de la mitocondria es el principal motor de la producción de energía en forma de ATP. Especies reactivas del oxígeno (ROS) son un subproducto natural de este proceso. A pesar de su importante papel como moléculas de señalización, excesiva ROS puede conducir a daños en el ADN, carbonilación de proteínas, y la oxidación de los lípidos. Un desequilibrio entre la producción y la desintoxicación ROS causa el estrés oxidativo, que conduce a agotamiento de la energía, el daño celular, y desencadena la muerte celular 1,2. El estrés oxidativo contribuye al envejecimiento y al desarrollo de muchas enfermedades que amenazan la vida, incluyendo cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas 3-9. Las células han desarrollado estrategias de defensa enzimáticos y no enzimáticos para mantener los niveles de ROS adecuadas y para proteger a sus electores contra el daño oxidativo 1,2. La superóxido dismutasa (SOD) enzimas actúan primero en convert superóxido a H 2 O 2, que más tarde se convierte en el agua por la catalasa o enzimas peroxidasa. Estrategias para no enzimáticos de defensa incluyen principalmente moléculas que reaccionan más rápidamente con ROS en comparación con macromoléculas celulares, protegiendo los componentes celulares esenciales. A pesar de la función protectora de ROS desintoxicación enzimas, algunas moléculas ROS escapan los mecanismos de defensa antioxidante y conducen al daño oxidativo. Detección, reparación, y la degradación de los componentes celulares dañados son estrategias esenciales de defensa durante el estrés oxidativo 1,2. Vías de señalización implicadas en la resistencia a la tensión y el estrés oxidativo en concreto son altamente conservadas evolutivamente 10,11. A diferencia de los experimentos de cultivo de células, donde las condiciones organismal son sólo parcialmente reproducidos, el estudio del estrés oxidativo en organismos modelo 12,13 tiene un gran significado. C. elegans es un nematodo de vida libre que puede ser fácil y económicamente culrado en un césped de bacterias en medios de agar. Es de tamaño pequeño (alrededor de 1 mm de longitud) y normalmente crece como un hermafrodita auto-fertilización, lo que facilita las manipulaciones genéticas. Tiene un ciclo de vida rápido y una alta capacidad reproductiva, produciendo aproximadamente 300 crías por generación, por lo que es una poderosa herramienta para realizar cribados genéticos a gran escala 14. El C. elegans genoma está completamente secuenciado y el 40-50% de los genes se predice para ser homólogos de genes asociados a enfermedades humanas 15-18. La caída de los genes de interés utilizando RNAi es rápida y fácil en C. elegans. génica por la regulación se puede lograr mediante la alimentación de animales de la E. bacterias coli que albergan un plásmido que expresa el ARN de doble cadena que se dirige el mRNA de interés 19. Por lo tanto, la determinación de la función de genes utilizando pantallas de RNAi gran escala tiene un gran impacto en la comprensión de las enfermedades humanas como el cáncer 20,21. Estudios de oresistencia al estrés xidative en C. elegans han conducido a la identificación de conservados mecanismos de resistencia al estrés oxidativo 13,22. Algunas vías identificadas son vías comunes que modulan la longevidad y la resistencia a otros factores de estrés, así como la hipoxia, el calor, y el estrés osmótico. Estas vías incluyen la señalización de la insulina, la señalización de TOR y la autofagia. Otras vías importantes implican la desintoxicación de ROS como las enzimas superóxido dismutasa y catalasa enzimas, o en la reparación de daños tales como choque térmico y chaperón proteínas 11,13,22. Este protocolo describe cómo determinar la resistencia al estrés oxidativo de C. elegans en líquido. Utilizamos FLCN-1 (ok975) y de tipo salvaje animales para demostrar el protocolo ya que hemos demostrado anteriormente una mayor resistencia al estrés oxidativo sobre la pérdida de FLCN-1 (ok975) en C. elegans 23. También hemos demostrado que este aumento de la resistencia dependeen AMPK y la autofagia, un eje de señalización que mejora la bioenergética celular y promueve la resistencia al estrés 23. PQ es un factor de estrés oxidativo que interfiere con la cadena de transporte de electrones para producir especies de oxígeno reactivo 24. El mismo ensayo se podría adaptar y otras fuentes de ROS o compuestos que generan ROS podría ser utilizado como H 2 O 2 y rotenona. Ensayos similares se han desarrollado en las placas donde se utilizan bajas concentraciones de PQ 25,26. La ventaja de este ensayo es que es muy rápido, y los resultados se podría obtener en un día. Además, el volumen total de líquido usado para llevar a cabo el ensayo de la resistencia al estrés oxidativo en placas de 96 pocillos es baja en comparación con el volumen utilizado para preparar placas PQ-que contienen. Por lo tanto, la cantidad de PQ es utilizado en el ensayo de líquido es bajo, lo que hace que el ensayo de bajo costo y limita la producción de desechos tóxicos. Sin embargo, las limitaciones de este ensayo en comparación con los ensayos de placa incluyen el lack de comida en el ensayo de líquido y la menor concentración de oxígeno en el líquido en comparación con el aire. Estos son factores importantes que en algunos casos, podrían influir en los resultados. Por lo tanto, lo que confirma la reproducibilidad utilizando otros métodos de la resistencia al estrés oxidativo se recomienda para apoyar los resultados obtenidos en este ensayo.

<table><tbody><tr><td>Agar bacteriological grade</td><td>Multicell</td><td>800-010-LG</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological peptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0037</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride biotechnology grade</td><td>Bioshop</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure tris hydrochloride</td><td>Invitrogen</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>Tris aminomethane</td><td>Bio Basic Canada Inc</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202185A</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Bioshop</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>8013-01-2</td><td></td></tr><tr><td>Methyl viologen dichloride hydrate</td><td>Aldrich chemistry</td><td>856177-1G</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60 x15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 10 ml</td><td>Fisher</td><td>1367520</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>G-Biosciences</td><td>RC-084</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>M-5921</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Discovery v8 stereo zeiss microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well clear microtiter plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;flcn-1&lt;/em&gt; RNAi source</td><td>Ahringer Library</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring oxidative stress resistance of caenorhabditis elegans in 96-well microtiter plates

El estrés oxidativo, que es el resultado de un desequilibrio entre la producción y la desintoxicación de especies reactivas del oxígeno, es un importante contribuyente a trastornos humanos crónicas, incluyendo enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas, diabetes, envejecimiento, y cáncer. Por lo tanto, es importante para estudiar el estrés oxidativo no sólo en sistemas celulares, sino también el uso de organismos enteros. C. elegans es un organismo modelo atractivo para estudiar la genética de las vías de transducción de señales de estrés oxidativo, que se conservan altamente evolutivamente. Aquí, ofrecemos un protocolo para medir la resistencia al estrés oxidativo en C. elegans en líquido. Reactivos Brevemente, ROS inductores como el paraquat (PQ) y H 2 O 2 se disuelven en tampón M9, y las soluciones se dividen en partes alícuotas en los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos. L4 Sincronizada / joven C. elegans animales se transfieren a los pocillos (5-8 animales / pocillo) y se mide la supervivenciacada hora hasta que la mayoría de los gusanos están muertos. Cuando se realiza un ensayo de resistencia al estrés oxidativo usando una baja concentración de factores de estrés en las placas, el envejecimiento podría influir en el comportamiento de los animales sobre el estrés oxidativo, lo que podría dar lugar a una interpretación errónea de los datos. Sin embargo, en el ensayo descrito en el presente documento, este problema es poco probable que ocurra ya que se están utilizando sólo L4 / animales adultos jóvenes. Por otra parte, este protocolo es de bajo costo y los resultados se obtienen en un día, lo que hace que esta técnica atractiva para pantallas genéticos. En general, esto le ayudará a entender las vías de transducción de señales de estrés oxidativo, lo que podría traducirse en una mejor caracterización de los trastornos humanos con el estrés oxidativo asociado.

La comparación de tipo salvaje C. elegans para FLCN-1 (ok975) animales mutantes Aquí hemos utilizado PQ 100 mM para determinar la resistencia de tipo salvaje C. elegans animales en comparación con FLCN-1 (ok975) que se ha demostrado para resistir el estrés oxidativo, el calor y la anoxia 23. Después de 4 horas de tratamiento, el 48,3% de los de tipo salvaje sobrevivido en comparación con el 77,8% de supervivencia en-1 FLCN (ok975) animales. Como era de esperar, FLCN-1 (ok975) animales mutantes eran más resistentes a PQ 100 mM en comparación con el de tipo salvaje (Figura 2 y Tabla 1). La comparación de tipo salvaje animales alimentados con EV control o bacterias RNAi 1 FLCN- Al igual que el resultado presentado en la sección anterior, en la regulación de FLCN-1 utilizando RNAi incrementa la resistencia a la mM PQ 100. Este resultado demuestra que la regulación hacia abajo de la función génica usando imita RNAi pérdida de la función de m<html> reputa- (Figura 2 y Tabla 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52746/52746fig1.jpg" /> Figura 1. Figura esquemática del método de determinación de la resistencia al estrés oxidativo en placas de 96 pocillos en C. elegans. Sincronizados L4 / animales adultos jóvenes cultivadas en placas MYOB y alimentados con bacterias E. coli OP50 se transfieren a los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos que contiene 100 mM PQ y la supervivencia se mide por hora hasta que un gran número de gusanos están muertos. En el caso de caídas de ARNi, el mismo procedimiento es seguido excepto que los animales sincronizados se cultivan en placas suplementadas con IPTG, y se alimentan con la E. bacterias HT115 coli que albergan el plásmido que desmontables gen diana tras la expresión. archivos / ftp_upload / 52746 / 52746fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Pérdida de la resistencia FLCN-1 aumenta con el estrés oxidativo en C. elegans. (A - B) Porcentaje de supervivencia a PQ 100 mM de (A) en peso y FLCN-1 (ok975) animales mutantes y (B) en peso de los animales tratados con control o FLCN-1 RNAi. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="5"> El porcentaje de supervivencia a 100 mM PQ </td></tr><tr><td> 1 hr </td><td> Colar, RNAi </td><td> Porcentaje de supervivencia (± SD) </td><td> P Valor </td><td> Número de experimentos </td><td> Número total de gusanos </td></tr><tr><td></td><td> en peso </td><td> 82,38 ± 1,31 </td><td align="right"> 0.0002 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 210 </td></tr><tr><td></td><td> FLCN-1 (ok975) </td><td> 99,03 ± 1,67 </td><td></td><td align="right"> 3 </td&gt; <td align="right"> 224 </td></tr><tr><td></td><td> en peso; control </td><td> 91,70 ± 0,55 </td><td align="right"> 0.0462 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 202 </td></tr><tr><td></td><td> en peso; FLCN-1 (RNAi) </td><td> 95,93 ± 2,48 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 207 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 horas </td><td> Colar, RNAi </td><td> Porcentaje de supervivencia (± SD) </td><td> P Valor </td><td> Número de experimentos </td><td> Número total de gusanos </td></tr><tr><td></td><td> en peso </td><td> 72,13 ± 7,13 </td><td align="right"> 0,005 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 210 </td></tr><tr><td></td><td> FLCN-1 (ok975) </td><td> 96,33 ± 2,28 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 224 </td></tr><tr><td></td><td> en peso; control </td><td> 80,27 ± 5,34 </td><td align="right"> 0.0261 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 202 </td></tr><tr><td></td><td> en peso; FLCN-1 (RNAi) </td><td> 91,23 ± 1,42 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 207 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 horas </td><td> Colar, RNAi </td><td> Porcentaje de supervivencia (± SD) </td><td> P Valor </td><td> Número de experimentos </td><td> Número total de gusanos </td></tr><tr><td></td><td> en peso </td><td> 55,37 ± 4,72 </td><td align="right"> 0.0004 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 210 </td></tr><tr><td></td><td> FLCN-1 (ok975) </em&gt; </td><td> 87,00 ± 1,36 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 224 </td></tr><tr><td></td><td> en peso; control </td><td> 70,77 ± 3,50 </td><td align="right"> 0.0027 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 202 </td></tr><tr><td></td><td> en peso; FLCN-1 (RNAi) </td><td> 87,63 ± 2,67 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 207 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 horas </td><td> Colar, RNAi </td><td> Porcentaje de supervivencia (± SD) </td><td> P Valor </td><td> Número de experimentos </td><td> Número total de gusanos </td></tr><tr><td></td><td> en peso </td><td> 48,30 ± 6,39 </td><td align="right"> 0,002 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 210 </td></tr><tr><td></td><td> FLCN-1 (ok975) </td><td> 77,80 ± 3,12 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 224 </td></tr><tr><td></td><td> en peso; control </td><td> 63,77 ± 0,66 </td><td align="right"> 0.0122 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 202 </td></tr><tr><td></td><td> en peso; FLCN-1 (RNAi) </td><td> 80,57 ± 6,68 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 207 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 horas </td><td> Colar, RNAi </td><td> Porcentaje de supervivencia (± SD) </td><td> P Valor </td><td> Número de experimentos </td><td> Número total de gusanos </td></tr><tr><td></td><td> en peso </td><td> 41,60 ± 8,33 </td><td align="right"> 0.0062 </td><td align="right"> 3 </td><td align = &quot;right&quot;&gt; 210 </td></tr><tr><td></td><td> FLCN-1 (ok975) </td><td> 67,43 ± 1,42 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 224 </td></tr><tr><td></td><td> en peso; control </td><td> 60,53 ± 2,58 </td><td align="right"> 0.0313 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 202 </td></tr><tr><td></td><td> en peso; FLCN-1 (RNAi) </td><td> 71,53 ± 5,24 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 207 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 hr </td><td> Colar, RNAi </td><td> Porcentaje de supervivencia (± SD) </td><td> P Valor </td><td> Número de experimentos </td><td> Número total de gusanos </td></tr><tr><td></td><td> en peso </td><td> 34,86 ± 5,88 </td><td align="right"> 0.0021 </td&gt; <td align="right"> 3 </td><td align="right"> 210 </td></tr><tr><td></td><td> FLCN-1 (ok975) </td><td> 60,34 ± 2,05 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 224 </td></tr><tr><td></td><td> en peso; control </td><td> 44,43 ± 3,93 </td><td align="right"> 0.0042 </td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 202 </td></tr><tr><td></td><td> en peso; FLCN-1 (RNAi) </td><td> 62,13 ± 3,44 </td><td></td><td align="right"> 3 </td><td align="right"> 207 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Resumen de los resultados y análisis estadístico de la resistencia al estrés oxidativo en la Figura 2.

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Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Medición de la resistencia de estrés oxidativo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 pocillos en placas de microtitulación

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

measuring-oxidative-stress-resistance-caenorhabditis-elegans-96-well

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

15.4K vistas.  McGill University. C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates. 

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Investigación

Bioquímica

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple and inexpensive method to obtain a large number of animals for the isolation of proteins to proceed with a western blot, mass spectrometry, or further proteomics analyses. Furthermore, an increase of nematode numbers for immunostainings and the integration of multiple analyses under the same culturing conditions can easily be achieved. Additionally, a transfer between plates with different experimental conditions is facilitated. Common techniques in plate culture involve the transfer of a single C. elegans using a platinum wire and the transfer of populated agar chunks using a scalpel. However, with increasing nematode numbers, these techniques become overly time-consuming. This protocol describes the large-scale culture of C. elegans including numerous steps to minimize the impact of the sample preparation on the physiology of the worm. Fluid and shear stress can alter the lifespan of and metabolic processes in C. elegans, thus requiring a detailed description of the critical steps in order to retrieve reliable and reproducible results. C. elegans is a model organism, consisting of neuronal cells for up to one-third, but lacking blood vessels, thus providing the possibility to investigate solely neuronal alterations independent of vascular control. Recently, early neurodegeneration in diabetic retinopathy was found prior to vascular alterations. Thus, C. elegans is of special interest for studying general mechanisms of diabetic complications. For example, an increased formation of advanced glycation end products (AGEs) and reactive oxygen species (ROS) is observed, which are reproducibly found in C. elegans. Protocols to handle samples of adequate size for a broader spectrum of investigations are presented here, exemplified by the study of diabetes-induced biochemical alterations. In general, this protocol can be useful for studies requiring large C. elegans numbers and in which liquid culture is not suitable.

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

This protocol describes a method for the large-scale cultivation of Caenorhabditis elegans on solid media. As an alternative to liquid culture, this protocol allows obtaining parameters of different scales under plate-based cultivation. This increases the comparability of results by omitting the morphological and metabolic differences between liquid and solid media culture.

Base de placa de cultivo a gran escala de elegans de Caenorhabditis: preparación de muestras para el estudio de alteraciones metabólicas en la Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

Encuesta de métodos de bajo costo para medir la esperanza de vida y la salud en Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Genética

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Estudiar el estrés oxidativo causado por los estreptococos del grupo Mitis en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Biología del Desarrollo

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en 96 placas de microtitulación Bueno

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Biología

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Medición de las tasas de consumo de oxígeno en intacto Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Mediciones de las respuestas fisiológicas de estrés en C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Cuantificación de la disminución proteostática específica del tejido en Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

Detección de alto rendimiento de aislados microbianos con impacto en la salud de Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

C. elegans Survival Assay: A Short-Term Toxicity Test

Source: Possik, E. and Pause, A. <a href="https://www.jove.com/video/2496/measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter">Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video introduces a short-term survival assay that tests a treatment for acute toxicity or tests a genetic strain for resistance to a toxic condition.&#160; The example protocol shows an example survival assay in which worms are tested for their ability to&#160; resist oxidative stress induced by paraquat (PQ).

C. elegans Ensayo de supervivencia: una prueba de toxicidad a corto plazo

Source: Possik, E. and Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.&#160;J. Vis. Exp. ...

Medición de la resistencia de estrés oxidativo

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