Biz C. Caenorhabditis Genetik Merkezi&#39;nden kabul elegans suşları. Finansman desteği Terry Fox Araştırma Enstitüsü tarafından sağlandı. Biz de Rolande ve Marcel Gosselin Lisans Bursu ve McGill Entegre Kanser Araştırma Eğitim Programı kanser araştırma FRN53888 içinde CIHR / FRSQ eğitim hibe EP verilen destek için minnettarım.

Reaktifler 1. Hazırlık <ol><li> C. medyanın hazırlanması (Bu durumda, vahşi tip hayvan ve FLCN-1 (ok975) mutant hayvanlarda) elegans büyümesi. <ol><li> Tris HCI ve 5.5 g Tris baz, 2.4 g, Bactopetone 31 g, NaCl 20 g ve kolesterol 0.08 g &#39;ını ihtiva Youngren tek Bacto-pepton (MYOB), kuru bir karışım Modifiye hazırlayın. Sallayarak iyice karıştırın. NOT: Bu karışım MYOB ortamı 10 L hazırlamak için yeterlidir. Not: normal büyüme ortamı (NGM) plakaları MYOB plakalar 27 yerine kullanılabilir. Bununla birlikte, plakaların aynı tip suşlar arasında bağımsız tekrarlar arasında geçerli bir karşılaştırması için kullanılmalıdır. Bu protokol, biz sadece MYOB plakaları kullanılır. </li><li> MYOB kuru karışımın 6 g, agar 17 g eklenerek MYOB ortamı 1 L hazırlayın ve 122 ° C &#39;de 45 dakika süre ile H2O ve otoklav ile 1 L&#39;ye tamamlanır. Plakaları dökün ve 2 gün boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li><li> Steril teknik kullanılarak, kültürlerdeki 100 ml&#39;sini aşılamakE. LB sıvı ortamında yeniden E. coli OP50 bakteri ve 37 ° C &#39;de O / N büyür. </li><li> E. Tohum MYOB plakaları E. coli OP50 bakterileri. 48 st için oda sıcaklığında büyümesi izin verin. </li></ol></li><li> RNAi kullanılarak gen baskılanması Hazırlık <ol><li> MYOB RNAi besleme tabak hazırlayın. Adımlar 1.1.1 ve 1.1.2 gibi devam edin. Otoklav sonra, ortam yaklaşık 55 ° C&#39;ye kadar soğutulur ve eklemek için izin 1 M izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ve 100 mM ampisilin, 1 ml 1 mi. </li><li> Streak E. E. coli HT115 kontrol EV veya agar plakaları ampisilin üzerinde FLCN-1 spesifik RNAi (50 ug / ml) / tetrasiklin (15 ug / ml) ya da ifade eden bir plazmid ile transforme edilmiş bakteriler. 37 ° C&#39;de, kültür O / N büyütün. </li><li> Koloniler seçin ve E. aşılamak E. coli HT115 kontrol EV ya da belirli bir RNAi 1 FLCN ve ya 37 ve # LB / ampisilin (50 ug / ml), orta ve O / N kültürünün yetiştirilmesi eksprese eden bir plazmid ile transforme edilen bakteri176 ° C. </li><li> E. ile Tohum plakalar E. coli HT115 EV bakteri veya HT115 FLCN-1 RNAi bakteri. NOT: Kullanımdan önce oda sıcaklığında plakaları 48 saat tutun. Besleme RNAi demonte etkili ise, DS-RNA 28 teslim diğer yöntemleri kullanabilirsiniz. </li></ol></li><li> Parakuat (PQ) ile oksidatif stres oluşturma: <ol><li> PO 4 KH 2, 3 g karıştırılarak M9 tampon hazırlanması, Na 2 6 g HPO 4, 5 g NaCI ve MgSO 4 0.25 g · 7 H2O Damıtılmış su ile 1 L&#39;ye getirin. Oda sıcaklığında 122 ° C ve mağaza şişe 45 dakika süreyle otoklavlanmaktadır çözeltisi. </li><li> Analiz gününde, M9 / PQ-içeren solüsyon hazırlanır. (M9 4 ml tampon içinde eritildi PQ 0,1028 g oyuk başına M9 / PQ 40 ul ile bütün bir 96 gözlü plakalar doldurur) Bu protokol için, 100 mM PQ kullanın. DİKKAT: PQ tehlikeli ve son derece toksik bir bileşiktir. Uygun kurallarına göre işlemek. NOT: İlk yeni s çalışanTren veya yeni bir durum, bu 7-10 saat içinde hayvanları öldürmek için kullanılacak en iyi konsantrasyonunu belirlemek için PQ artan konsantrasyonları hayatta kalma tahlil için tavsiye edilir. </li></ol></li></ol> Yaş senkronize L4 Nüfus 2. Hazırlık <ol><li> E. ile seribaşı taze MYOB plaka Transferi 20 gebe yetişkin çift cinsiyetli E. coli OP50 bakterileri. Tahlil sırasında gerekli solucanlar sayısına dayalı birkaç tabak hazırlayın. </li><li> Onları 6 saat sonra anneleri kaldırmak platin tel solucan kıracağı kullanarak yumurtalarını bırakmak için izin verin. Bıraktıkları yumurta sayısını değerlendirmek için mikroskop altında plakaları kontrol edin. </li><li> Yumurtaların açılması ve 48 saat boyunca 20 ° C&#39;de büyümeye izin verin. Bu zamanda, hayvanlar, bir geç L4 / genç yetişkin aşamasındadır. Aynı sahne hayvanları seçin ve PQ çözüm içeren kuyulara aktarın. NOT: 48 saat inkübasyon, sadece yabani tipte hayvanlara benzer şekilde büyümeye mutantlar için geçerli olduğundan, bu gelişim takip etmek önemlidirYeni test mutantların oranı, vahşi tip gelişme hızına aksi halde, başka bir zaman çizgisi kullanılmalıdır uygun sağlamak. </li><li> Alternatif olarak, senkronizasyon tekniklerini kullanın. Hipoklorit çözeltisi kullanılarak L1 larvalarının solucanların senkronize popülasyonunu üretmek (25 ml su,% 5.25 sodyum hipoklorit 125 mi, 4 M NaOH, 50 ml, ışıktan izole etmek için alüminyum folyo ile bir şişe sarın). Yoğun bir ağartıcı tahlil sırasında hayvan davranışını etkiler olabilir Bununla birlikte, bu deney için, bu, tavsiye edilmez. DİKKAT: kurallarına göre hipoklorit solüsyonu tutun. Not: aşağı ilgilenilen geni düzenleyen özel RNAi bakteri ile ekim yapılmış RNAi plakalara annelerin transferi hariç olmak üzere, bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi çift cinsiyetli eşitlemeye RNAi kullanırken. RNAi ile demonte zayıf olduğunda, birden nesiller için beslenme tavsiye edilir. </li></ol> 3. Oksidatif Stres Direnci Deneyi &lt;Sahne/ P&gt; <ol><li> Pipet 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna (taze elde edilmiş) 100 mM PQ çözeltisi 40 ul. Her durumda (tedavi, mutant, vs.) replike olarak en az 12 kuyu kullanın. Bir platin tel solucan maşası kullanarak, her iyi başlangıç ​​ve bitiş zamanlarını gösteren 5-8 L4 larvaları hayvanları transfer. </li><li> Başka bir koşul başlatırken, başlangıç ​​ve bitiş zamanlarını not edin. Başlangıç ​​zamanından itibaren bir saat sonra ölü hayvanları solucanlar aktarılması ve puanlama arasındaki inkübasyon süresi içinde 20 ° C&#39;de plaka koyun. </li><li> Diseksiyon mikroskobu kullanarak, hayatta kalma her saat saymak. Yavaşça saymak başlamadan önce plakayı sallayın. Ölü hayvanlar gibi, hatta yüksek yoğunluklu ışık lekelenme sonra, hareket etmeyen solucanlar belirtiniz. Ayrıca canlı hayvanların sayısını göstermektedir. NOT: Yüksek büyütmede solucan şekli, kuyrukları ve baş hareketi baktığımızda, diri ölü solucanlar belirlemeye yardımcı olur. </li><li> En solucanlar ölene kadar bu adımı her saat tekrarlayın. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Every Time Point Survival Yüzde Belirlenmesi <ol><li> Iyi her transfer hayvanların toplam sayısı ekleyerek durum başına toplam hayvan sayısını hesaplayın. Hasarlı veya transfer etmesi halinde öldürülen hayvan geçiyoruz. </li><li> Her zaman noktası için, (12 kuyuda ölü hayvanların toplamı) durumuna başına ölü hayvanların toplam sayısını hesaplamak. Her zaman noktası için, ve hayatta kalma (100 eksi yüzde ölümü) yüzdesi (ölü hayvanlar 100 ile hayvanların toplam sayısına bölünmesiyle ve çarpılır sayısı) ölüm yüzdesini hesaplar. </li><li> Bu deney en az 3 bağımsız kez tekrarlayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).</li><li>Alfadda, A. A., Sallam, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+health+and+disease.">Reactive oxygen species in health and disease.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, 936486 (2012).</li><li>Finkel, T., Holbrook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidants,+oxidative+stress+and+the+biology+of+ageing.">Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing.</a> Nature. 408, 239-247 (2000).</li><li>Di Carlo, M., Giacomazza, D., Picone, P., Nuzzo, D., San Biagio, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+the+key+players+in+the+neurodegenerative+diseases.">Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in the neurodegenerative diseases.</a> Free Radic Res. 46, 1327-1338 (2012).</li><li>Gandhi, S., Abramov, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+oxidative+stress+in+neurodegeneration.">Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration.</a> Oxid Med Cell Longev. 2012, 428010 (2012).</li><li>Trushina, E., McMurray, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases.">Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases.</a> Neuroscience. 145, 1233-1248 (2007).</li><li>Touyz, R. M., Briones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+and+vascular+biology:+implications+in+human+hypertension.">Reactive oxygen species and vascular biology: implications in human hypertension.</a> Hypertens Res. 34, 5-14 (2011).</li><li>Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+oxidative+stress+as+an+anticancer+strategy.">Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 931-947 (2013).</li><li>Sosa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+cancer:+an+overview.">Oxidative stress and cancer: an overview.</a> Ageing research reviews. 12, 376-390 (2013).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans:+Causal+or+Casual+Relationship.">Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship.</a> Antioxid Redox Signal. 13, 1911-1953 (2010).</li><li>Baumeister, R., Schaffitzel, E., Hertweck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+controls+stress+response+and+longevity.">Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity.</a> J Endocrinol. 190, 191-202 (2006).</li><li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnol J. 5, 1261-1276 (2010).</li><li>Rodriguez, M., Snoek, L. B., De Bono, M., Kammenga, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+under+stress:+C.+elegans+stress+response+and+its+relevance+to+complex+human+disease+and+aging.">Worms under stress: C. elegans stress response and its relevance to complex human disease and aging.</a> Trends Genet. 29, 367-374 (2013).</li><li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical approach series. , 282 (1999).</li><li>C. elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turn+to+the+worm!.">Turn to the worm!.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 7, 410-415 (1997).</li><li>Wheelan, S. J., Boguski, M. S., Duret, L., Makalowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+nematode+orthologs--lessons+from+the+analysis+of+1800+human+genes+and+the+proteome+of+Caenorhabditis+elegans.">Human and nematode orthologs--lessons from the analysis of 1800 human genes and the proteome of Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 238, 163-170 (1999).</li><li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes.">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Hum Mol Genet. 9, 869-877 (2000).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+approaches+in+C.+elegans.">Functional genomic approaches in C. elegans.</a> Methods Mol Biol. 351, 127-138 (2006).</li><li>Poulin, G., Nandakumar, R., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screens+in+Caenorhabditis+elegans:+impact+on+cancer+research.">Genome-wide RNAi screens in Caenorhabditis elegans: impact on cancer research.</a> Oncogene. 23, 8340-8345 (2004).</li><li>Moreno-Arriola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+A+Useful+Model+for+Studying+Metabolic+Disorders+in+Which+Oxidative+Stress+Is+a+Contributing+Factor.">Caenorhabditis elegans: A Useful Model for Studying Metabolic Disorders in Which Oxidative Stress Is a Contributing Factor.</a> Oxid Med Cell Longev. , 705253 (2014).</li><li>Possik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folliculin+regulates+ampk-dependent+autophagy+and+metabolic+stress+survival.">Folliculin regulates ampk-dependent autophagy and metabolic stress survival.</a> PLoS Genet. 10, e1004273 (2014).</li><li>Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., Moriyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+cytotoxicity+of+paraquat.">Mechanism of cytotoxicity of paraquat.</a> Environ Health Prev Med. 7, 89-94 (2002).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+is+dispensable+for+normal+animal+lifespan.">Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 5785-5790 (2012).</li><li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress.">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metab. 6, 280-293 (2007).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Timmons, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+methods+for+RNA+interference+in.">Delivery methods for RNA interference in.</a> C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 119-125 (2006).</li><li>Wang, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+Eyes+Absent+Ortholog+EYA-1+Is+Required+for+Stress+Resistance.">Caenorhabditis elegans Eyes Absent Ortholog EYA-1 Is Required for Stress Resistance.</a> Biochemistry (Mosc). 79, 653-662 (2014).</li><li>Paz-Gomez, D., Villanueva-Chimal, E., Navarro, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DEAD+Box+RNA+helicase+VBH-1+is+a+new+player+in+the+stress+response+in+C.+elegans.">The DEAD Box RNA helicase VBH-1 is a new player in the stress response in C. elegans.</a> PLoS One. 9, 97924 (2014).</li><li>Ward, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+the+C.+elegans+acyl-CoA+synthase,+acs-3,+and+nuclear+hormone+receptor,+nhr-25,+cause+sensitivity+to+distinct,+but+overlapping+stresses.">Defects in the C. elegans acyl-CoA synthase, acs-3, and nuclear hormone receptor, nhr-25, cause sensitivity to distinct, but overlapping stresses.</a> PLoS One. 9, 92552 (2014).</li><li>Staab, T. A., Evgrafov, O., Knowles, J. A., Sieburth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+synaptic+nlg-1/neuroligin+abundance+by+the+skn-1/Nrf+stress+response+pathway+protects+against+oxidative+stress.">Regulation of synaptic nlg-1/neuroligin abundance by the skn-1/Nrf stress response pathway protects against oxidative stress.</a> PLoS Genet. 10, e1004100 (2014).</li><li>Greer, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AMPK-FOXO+pathway+mediates+longevity+induced+by+a+novel+method+of+dietary+restriction+in.">An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in.</a> C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).</li><li>Allen, E., Walters, I. B., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brivanib,+a+dual+FGF/VEGF+inhibitor,+is+active+both+first+and+second+line+against+mouse+pancreatic+neuroendocrine+tumors+developing+adaptive/evasive+resistance+to+VEGF+inhibition.">Brivanib, a dual FGF/VEGF inhibitor, is active both first and second line against mouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance to VEGF inhibition.</a> Clin Cancer Res. 17, 5299-5310 (2011).</li><li>Apfeld, J., O'Connor, G., McDonagh, T., DiStefano, P. S., Curtis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMP-activated+protein+kinase+AAK-2+links+energy+levels+and+insulin-like+signals+to+lifespan+in+C.+elegans.">The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin-like signals to lifespan in C. elegans.</a> Genes Dev. 18, 3004-3009 (2004).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+AMP-activated+protein+kinase+AAK-2+is+phosphorylated+by+LKB1+and+is+required+for+resistance+to+oxidative+stress+and+for+normal+motility+and+foraging+behavior.">The Caenorhabditis elegans AMP-activated protein kinase AAK-2 is phosphorylated by LKB1 and is required for resistance to oxidative stress and for normal motility and foraging behavior.</a> J Biol Chem. 283, 14988-14993 (2008).</li><li>Honda, Y., Honda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+daf-2+gene+network+for+longevity+regulates+oxidative+stress+resistance+and+Mn-superoxide+dismutase+gene+expression+in+Caenorhabditis+elegans.">The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans.</a> FASEB J. 13, 1385-1393 (1999).</li><li>Restif, C., Metaxas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+swimming+motions+of+C.+elegans+worms+with+applications+in+aging+studies.">Tracking the swimming motions of C. elegans worms with applications in aging studies.</a> Med Image Comput Comput Assist Interv. 11, 35-42 (2008).</li><li>Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+automated+measurement+of+nematode+swimming+(thrashing)+without+morphometry.">Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry.</a> BMC Neurosci. 10, 84 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

C. elegans kolaylıkla kültürlenebilir yana in vivo genetik olarak oksidatif stres direnci çalışma için çekici bir model organizma ve hızlı bir şekilde genetik olarak özdeş yavruların çok sayıda yol açar. Oksidatif stres direncini ölçmek için birden çok yöntem, daha önce tarif edilmiştir ve böyle PQ, rotenone, H2O 2 ve juglon 25,26,29-32 gibi çeşitli ROS kaynakları ile kültür levhaları takviyesi dayanmaktadır. Burada 100 mM PQ kullanılarak 96 yuval?...

A reference was corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/52746">Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates</a>. There was an error with reference 34 in the Citations section. It has been updated from:
Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).
to:
Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., &#38; Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).

Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Ökaryotlarda, mitokondri elektron taşıma zincirinde yer alan oksidatif fosforilasyon ATP şeklinde enerji üretimi temel sürücüdür. Reaktif oksijen türleri (ROS) Bu işlem doğal bir yan ürünü bulunmaktadır. Sinyal molekülleri olarak önemli bir rolü olmasına rağmen, aşırı ROS DNA hasarı protein karbonilasyonu ve lipid oksidasyonuna neden olabilir. ROS üretimi ve detoksifikasyon arasında bir dengesizlik enerji tükenmesi, hücresel hasara yol açan oksidatif strese neden olur ve hücre ölümünü 1,2 tetikler. Oksidatif stres, yaşlanma ve kanser, diyabet, kalp-damar ve nörodejeneratif hastalıklar 3-9 dahil olmak üzere birçok yaşamı tehdit eden hastalıkların gelişimine katkıda bulunur. Hücreler uygun ROS düzeylerini korumak için ve oksidatif hasara karşı 1,2 bileşenlerinin korumak için enzimatik ve non-enzimatik savunma stratejilerini geliştirmişlerdir. Süperoksit dismutaz (SOD) enzim conve ilk hareketDaha sonra, katalaz veya peroksidaz enzimleri tarafından suya dönüştürülür H2O 2, RT süperoksit. Sigara enzimatik savunma stratejilerinin daha çok temel hücresel bileşenleri korumak makromoleküllerle, karşılaştırıldığında ROS ile daha hızlı reaksiyona molekülleri içerir. ROS enzimler detoks koruyucu rolüne rağmen, bazı ROS molekülleri antioksidan savunma mekanizmalarını kaçış ve oksidatif hasara yol açar. Algılama, onarım ve hasarlı hücre bileşenlerinin bozulması oksidatif strese 1,2 sırasında gerekli savunma stratejileri vardır. Stres direnci ve özellikle oksidatif stres yer alan sinyal yolları çok evrimsel 10,11 muhafaza edilir. Organizma koşullar sadece kısmen çoğaltılmış hücre kültürü deneyleri, 12,13 büyük önem taşımaktadır model organizmaların oksidatif stresin çalışmanın aksine. C elegans cul kolay ve ucuz olabilir serbest yaşayan nematod olanAgar medya üzerinde bir bakteri çim tured. Küçük boyutta normal olarak (yaklaşık 1 mm uzunluğunda) ve genetik manipülasyonlar kolaylaştıran kendiliğinden gübre hermafrodit olarak büyür. Bu hızlı bir yaşam döngüsü ve yüksek üreme kapasitesine, nesilden başına yaklaşık 300 yavru üreten o büyük ölçekli genetik ekranlar 14 gerçekleştirmek için güçlü bir araç yapma vardır. C. C. elegans genomunun tam dizilenmiş ve genlerin% 40-50, insan hastalığı ile ilişkili genlerin 15-18 homologları olduğu tahmin edilmektedir. RNAi kullanılarak ilgi genlerinin yok etme, hızlı ve C kolay elegans. Gene aşağı düzenleme E. hayvan besleme ile elde edilebilir İlgi 19 mRNA hedef çift iplikçikli RNA eksprese eden bir plazmide E. coli bakterileri. Bu nedenle, büyük ölçekli RNAi ekranlarını kullanarak gen fonksiyonu belirlenmesi kanseri 20,21 dahil olmak üzere insan hastalıklarının anlaşılması üzerinde büyük etkisi vardır. O çalışmalarıC. xidative stres direnci elegans oksidatif stres 13,22 direnç muhafaza mekanizmaları tanımlanmasına yol açmıştır. Belirlenen bazı yollar hipoksi, ısı ve ozmotik stres gibi diğer stresler yanı gibi uzun ömürlü ve direnci modüle ortak yollar vardır. Bu yollar, insülin sinyalizasyon, TOR sinyalizasyon ve Otofaji sayılabilir. Diğer önemli yollar gibi, ya da hasar onarım gibi ısı şoku proteinleri ve şaperon 11,13,22 olarak süperoksit dismutaz enzim ve katalaz enzimleri olarak ROS detoksifikasyon içerir. Bu protokol C. oksidatif strese karşı direnci nasıl belirleneceği açıklanır sıvı içinde elegans. Daha önce C&#39;de kaybı ortaya FLCN-1 (ok975) oksidatif strese karşı artmış bir direnç göstermiştir beri protokol göstermek için FLCN-1 (ok975) ve vahşi tip hayvanlara kullanılan elegans 23. Ayrıca, bu daha iyi direnç gösterme bağlı olduğunu göstermiştirAMPK ve Otofaji hücresel biyoenerjitiklerinin artırır ve gerilme direnci 23 teşvik eden bir sinyal ekseninde. PQ reaktif oksijen türleri 24 üretmek için elektron taşıma zinciri engelleyen bir oksidatif stres olduğunu. Aynı deney, adapte edilebilir ve ROS kaynakları veya ROS üreten bileşikler, H2O 2 ve rotenone gibi kullanılabilir. Benzer deneyler, PQ düşük konsantrasyonlarda 25,26 kullanılan plakalar üzerinde geliştirilmiştir. Bu deneyde avantajı çok hızlı ve sonuçlar bir gün içinde elde edilebilir olmasıdır. Buna ek olarak, 96 gözlü plakalar içinde oksidatif stres direnci deneyi gerçekleştirmek için kullanılan sıvının toplam hacmi PQ-ihtiva eden plakalar hazırlamak için kullanılır hacmi ile karşılaştırıldığında düşüktür. Bu nedenle, kullanılan PQ miktarı sıvı analizde ise ucuz tahlil işler ve zehirli atıkların üretimini sınırlayan, düşük. Bununla birlikte, levha tahlilleri ile karşılaştırıldığında bu analizde sınırlamaları la bulunmaktadırSıvı deneyde gıda ve sıvı oksijen daha düşük bir konsantrasyonda CK hava ile karşılaştırıldığında. Bunlar bazı durumlarda, sonuçlar etkileyebilecek önemli faktörlerdir. Bu nedenle, bu tahlilde elde edilen sonuçlar desteklemek için tavsiye edilir, oksidatif stres direnci diğer yöntemlerle tekrarlanabilirlik teyit etmektedir.

<table><tbody><tr><td>Agar bacteriological grade</td><td>Multicell</td><td>800-010-LG</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological peptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0037</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride biotechnology grade</td><td>Bioshop</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure tris hydrochloride</td><td>Invitrogen</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>Tris aminomethane</td><td>Bio Basic Canada Inc</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202185A</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Bioshop</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>8013-01-2</td><td></td></tr><tr><td>Methyl viologen dichloride hydrate</td><td>Aldrich chemistry</td><td>856177-1G</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60 x15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 10 ml</td><td>Fisher</td><td>1367520</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>G-Biosciences</td><td>RC-084</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>M-5921</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Discovery v8 stereo zeiss microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well clear microtiter plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;flcn-1&lt;/em&gt; RNAi source</td><td>Ahringer Library</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring oxidative stress resistance of caenorhabditis elegans in 96-well microtiter plates

Üretim ve reaktif oksijen türlerinin detoksifikasyon arasındaki dengesizliğin sonucudur Oksidatif stres, kardiyovasküler ve nörodejeneratif hastalıklar, diyabet, yaşlanma ve kanser gibi kronik insan bozuklukları, büyük bir katkıda bulunuyor. Bu nedenle, hücre sistemlerinde değil, aynı zamanda bütün organizmalar kullanılarak sadece oksidatif stres çalışma için önemlidir. C. elegans yüksek evrimsel korunmuş olan oksidatif stres sinyal iletim yollarının, genetiğinin incelemek için cazip bir model organizmadır. Burada, biz C. oksidatif stres direnci ölçmek için bir protokol sağlamak sıvı içinde elegans. Bu tür paraquat (PQ) ve H2O 2 Kısaca, ROS-indükleyici reaktifler M9 tampon içinde çözülür ve çözeltiler 96 gözlü bir mikrotitre plakasının gözenekleri içinde bölünür. Senkronize L4 / genç yetişkin C. elegans hayvanlar oyuklara transfer edilir (5-8 hayvan / oyuk) ve hayatta kalma ölçülürher saat en fazla solucanlar ölene kadar. Verilerin yanlış yorumlanmasına yol açabilecek oksidatif stres üzerine hayvanların davranışlarını etkileyebilecek yaşlanma, plakalarda streslerinin düşük konsantrasyonu kullanılarak bir oksidatif stres direnci deneyi yaparken. Bununla birlikte, bu tarifnamede tarif edilen deneyde, bu sorun yalnızca L4 / genç yetişkin hayvanlar kullanılmaktadır çünkü pek mümkün değildir. Ayrıca, bu protokol, ucuz ve sonuçlar genetik ekranlar cazip bu teknik kılan bir gün içinde elde edilmektedir. Genel olarak, bu oksidatif stres ile ilişkili insan bozukluklarının daha iyi karakterizasyonu tercüme edilebilir oksidatif stres sinyal iletim yollarını, anlamanıza yardımcı olacaktır.

Karşılaştırılması vahşi tip C. elegans FLCN-1 (ok975) mutant hayvanlar Burada yabani tip C direncini belirlemek için 100 mM PQ kullanılan oksidatif stres, ısı ve anoksi 23 karşı gösterilmiştir FLCN-1 (ok975) ile karşılaştırıldığında elegans hayvanlar. Tedavi 4 saat, yabani tip% 48.3 sonra hayatta olarak FLCN-1 (ok975) hayvanlarda% 77.8 hayatta kalma ile karşılaştırıldığında. Beklendiği gibi, FLCN-1 (o...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates at JoVE.com

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Oksidatif Stres Direnci Ölçüm<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 oyuklu mikrotiter plakalarında

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

measuring-oxidative-stress-resistance-caenorhabditis-elegans-96-well

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

15.4K Görüntüleme.  McGill University. C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates. 

Video: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Biyokimya

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple and inexpensive method to obtain a large number of animals for the isolation of proteins to proceed with a western blot, mass spectrometry, or further proteomics analyses. Furthermore, an increase of nematode numbers for immunostainings and the integration of multiple analyses under the same culturing conditions can easily be achieved. Additionally, a transfer between plates with different experimental conditions is facilitated. Common techniques in plate culture involve the transfer of a single C. elegans using a platinum wire and the transfer of populated agar chunks using a scalpel. However, with increasing nematode numbers, these techniques become overly time-consuming. This protocol describes the large-scale culture of C. elegans including numerous steps to minimize the impact of the sample preparation on the physiology of the worm. Fluid and shear stress can alter the lifespan of and metabolic processes in C. elegans, thus requiring a detailed description of the critical steps in order to retrieve reliable and reproducible results. C. elegans is a model organism, consisting of neuronal cells for up to one-third, but lacking blood vessels, thus providing the possibility to investigate solely neuronal alterations independent of vascular control. Recently, early neurodegeneration in diabetic retinopathy was found prior to vascular alterations. Thus, C. elegans is of special interest for studying general mechanisms of diabetic complications. For example, an increased formation of advanced glycation end products (AGEs) and reactive oxygen species (ROS) is observed, which are reproducibly found in C. elegans. Protocols to handle samples of adequate size for a broader spectrum of investigations are presented here, exemplified by the study of diabetes-induced biochemical alterations. In general, this protocol can be useful for studies requiring large C. elegans numbers and in which liquid culture is not suitable.

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

This protocol describes a method for the large-scale cultivation of Caenorhabditis elegans on solid media. As an alternative to liquid culture, this protocol allows obtaining parameters of different scales under plate-based cultivation. This increases the comparability of results by omitting the morphological and metabolic differences between liquid and solid media culture.

Large-scale tarımı plaka tabanlı Caenorhabditis elegans: diyabet metabolik değişiklikler çalışma için numune hazırlama

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Genetik

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Oksidatif stres nedeniyle Mitis grubu streptokok Caenorhabditis elegans içinde eğitim

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Gelişim Biyolojisi

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Biyoloji

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

Caenorhabditis elegans Health Üzerinde Etkisi Olan Mikrobiyal İzolatların Yüksek Verimli Taraması

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

C. elegans Survival Assay: A Short-Term Toxicity Test

Source: Possik, E. and Pause, A. <a href="https://www.jove.com/video/2496/measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter">Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video introduces a short-term survival assay that tests a treatment for acute toxicity or tests a genetic strain for resistance to a toxic condition.&#160; The example protocol shows an example survival assay in which worms are tested for their ability to&#160; resist oxidative stress induced by paraquat (PQ).

C. elegans Hayatta Kalma Testi: Kısa Süreli Bir Toksisite Testi

Source: Possik, E. and Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.&#160;J. Vis. Exp. ...

Oksidatif Stres Direnci Ölçüm

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler