באמצעות הפרוטוקול שלנו, אנו יכולים לדמיין ולהעריך באופן כמותי את הדינמיקה של איתות אנדוזומים ומיטוכונדריה בתוך אקסונים מתאי עצב מוטוריים וחושיים של עכברים מורדמים חיים. שיטה זו שניתן להשתמש בה כדי להבין את הפיזיולוגיה הבסיסית של אקסונים in vivo ולחשוף מנגנון פתו חשוב המניע ניוון עצבי היקפי במודל העכבר של המחלה. ניתן להשתמש בטכניקה שלנו כדי להעריך את ההשפעה של טיפולים פוטנציאליים כגון חומרים פרמקולוגיים וטיפולים גנטיים על הובלה אקסונאלית בתאי עצב מוטוריים וחושיים חיים.
טכניקה זו יכולה לשמש כדי לדמות בו זמנית אברונים שונים באקסון עצב היקפי מסוים ולהעביר את המחקר של מודלים של מחלות מוטוריות, כמו גם הזדקנות. התחל את ההכנות על ידי משיכת מיקרופיפט זכוכית מדורג להזרקות תוך שריריות אופטימליות לשרירים קטנים יותר. לצורך הניתוח, אבטחו וילון כירורגי סטרילי על משטח חום המשוקע ל-37 מעלות צלזיוס והניחו את המיקרוסקופ התפעולי ומקדו אותו.
לאחר מכן, פרקו את כל כלי הניתוח והמכשירים הנדרשים כמתואר בכתב היד. בסיום ההכנות, העבירו את העכבר המרדים לשופר הממוקם באזור נפרד של החלל הכירורגי וודאו שגם רפלקס הגמילה מהקרנית וגם רפלקס הגמילה מהדוושה נעדרים לפני גילוח הפרווה מהאזור הכירורגי. לאחר מכן, הסר את הפרווה המגולחת מהעכבר באמצעות הצד הדביק של סרט הניתוח.
לאחר מכן, הניחו את העכבר על מאזני שקילה כדי לרשום את המשקל הטרום-ניתוחי. לאחר מכן, השתמשו במטוש צמר גפן כדי למרוח חומר סיכה לעיניים ולהעביר את העכבר והפה לאזור הניתוח. כדי להזריק את שריר הטיביאליס הקדמי, או TA, הניחו את העכבר על הגב ומתחו את הגפה האחורית ב-10 מעלות מקו האמצע.
כאשר הגפה האחורית נמצאת במצב הנכון, הניחו סרט כירורגי על פני כף הרגל. לעקר את האזור המגולח באמצעות 70% אתנול או תמיסה מקבילה. ציירו את השבר האטוקסי העובד של טטנוס, נוירוטוקסין או תמיסת HcT למיקרופיפט זכוכית משוך.
לאחר מכן, לעשות חתך קטן על שריר העניין באזור כי מתאים עם המנוע ואת אזורי הצלחת. ולאחר מכן. לחדור את החיתולית החיצונית על השריר כדי להזריק את HcT. להשאיר את micropipette במצב במשך חמש עד 10 שניות לפני נסיגה איטית.
לאחר ההזרקה, סגור את החתכים עם תפר אחד עד שניים. לאחר מכן, העבירו את העכבר לכלוב התאוששות מבודד תחת תצפית למשך 30 דקות. היכונו לחשיפת העצב הסיאטי על ידי סידור כלי הניתוח והמכשירים סביב האזור הכירורגי.
צור טריז על ידי חיתוך פרפילם למלבן צר ברוחב סנטימטר אחד עם קצה זוויתי כדי לסייע בתהליך ההדמיה. לאחר סיום ההכנות, העבירו את העכבר לשופר באזור הניתוח והשתמשו בנייר דבק כירורגי כדי לאבטח את הראש אל השופר. יש להאריך ולאבטח את הגפה האחורית הממוקדת ב-45 מעלות מקו האמצע באמצעות סרט כירורגי.
אם רפלקסים של גמילה מהקרנית והדוושה נעדרים, חותכים את העור שמעל העצב הסיאטי באמצעות מספריים. לאחר מכן, הסר את שריר הירך שריר הירך biceps יתר על המידה ואת השרירים או רקמת החיבור מבלי לפגוע בעצב הסיאטי ובכלי הדם. כאשר העצב הסיאטי השלם חשוף מספיק, יש למרוח מלח סטרילי מחומם מראש על האזור סביב העצב הסיאטי כדי למנוע ייבוש.
לאחר מכן, השתמשו במלקחיים מעוקלים כדי לשבש את רקמת החיבור העמוקה והניחו את טריז הפרפילם שהוכן מראש מתחת לעצב. מניחים צמר גפן ספוג מלח על האזור החשוף לפני שהם מזיזים את העכבר על גבי מחצלת החום לתוך תא האינדוקציה המלא באיזופלורן וחמצן. לצורך ההדמיה, הניחו זכוכית כיסוי בגודל 22 על 64 מילימטרים על במת המיקרוסקופ המותאמת אישית והבטיחו את מיקום זכוכית הכיסוי באמצעות סרט הדבקה.
לאחר מריחת שמן טבילה על המטרה, חברו את שלב המיקרוסקופ למיקרוסקופ ההפוך והעלו באיטיות את המטרה השקועה בשמן כדי ליצור קשר עם זכוכית הכיסוי. כאשר ההתקנה מוכנה, הצמידו את פיית ההרדמה לבמת המיקרוסקופ באמצעות סרט הדבקה. לאחר מכן, הסר את צמר הגפן מהעצב הסיאטי והעביר את העכבר מתא האינדוקציה אל הפייה כאשר העצב החשוף פונה אל זכוכית הכיסוי.
הצמידו את ראשו של העכבר לשופר, ותוך שמירה על רמת ההרדמה הנמוכה ביותר, הרימו בעדינות את העכבר בזנבו כדי להוסיף מלח סטרילי להחלקת הכיסוי ליד העצב הסיאטי החשוף. בעזרת העיניים, אתר את העצב הסיאטי כדי לקבוע את נקודת המוקד האופטימלית ובחר אזור עניין המכיל אברונים אקסונאליים תנועתיים. לאחר מכן, עבור לתוכנת המחשב על ידי לחיצה על לחצן רכישה ובחירת אזור עניין.
השתמש בזום דיגיטלי כדי לקבל הגדלה של פי 80 וסובב את האזור שנבחר כדי להציג את האקסונים בצורה אופקית לחץ על התיבה אזורים ובחר אזור מלבני בעל עניין. במצב הרכישה, הגדר את גודל המסגרת למינימום של 1024 על 1024 פיקסלים והתחל רכישה של 100 עד 1, 000 פריימים לפחות. ללכוד מינימום של 10 מטעני תנועתיות משלושת האקסונים לכל עכבר.
במחקר, תיוג in vivo motor axon-specifc הושג באמצעות עכברים מהונדסים. חלבון הפלורה הירוק המשופר, או ביטוי eGFP, באקסונים מוטוריים כולינרגיים נצפה מתוך ChAT חי ומורדם. עכבר eGFP.
בשיטה החלופית, ביטוי tdTomato בעצב שנכרת זה עתה מ- ChAT. עכבר tdTomato הושג ללא עיבוד רקמות נוסף. בנוסף, אקסונים זוהו על ידי הזרקת עוקבים או סמנים כגון HcT או אדנו-וירוסים המקודדים eGFP לשרירי השלד.
הניתוח הייצוגי מדגים סדרת תמונות בהילוך מהיר המייצגת הובלה אקסונאלית in vivo של אנדוזומים איתות בתאי עצב מוטוריים חיים של HB9. עכבר GFP. ל-GFP הייתה תבנית גרעינית יותר ב-HB9.
אקסונים של GFP. הרבייה של מיטו. עכברי CFP עם ChAT.
עכברי tdTomato אפשרו הדמיה של מיטוכונדריה באקסונים המוטוריים. יתר על כן, ניתן היה לזהות גם את הצומת של Ranvier. הזרקת HcT לשרירי המיטו.
עכברי CFP אפשרו הדמיה בו-זמנית של אנדוזומים ומיטוכונדריה מאותתים בתוך אותם אקסונים in vivo. נצפו אברונים הנעים באופן אנטרוגרדיאלי ומדרדר, כמו גם אברונים תקועים. הרדמה מופחתת במהלך תהליך ההדמיה היא יתרון משום שהיא יכולה להגביל את ההשפעה של ממצאי נשימה גדולים, ובכך לפשט את המעקב והניתוח של הובלה אקסונאלית.
עצבים סיאטיים יכולים להיות מאלפים עבור RNA וניתוח חלבונים כדי לתאם את הדינמיקה האברונית עם מרכיבים מרכזיים של מנגנון ההובלה האקסונאלי, כגון חלבונים מוטוריים ומתאמים ספציפיים למטען.
