The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense&#160;DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240&#160;to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.

הערה: ההליך יכול להתנהל על רקמות קפואים או הבזק. אנו ממליצים מרוססים רקמות כלי דם מאוד עם PBS בעת הנתיחה כדי לחסל תאי דם אדומים וחלבוני פלזמה. אנחנו לא ממליצים לנהל את ההליך ברקמות קבועות כקיבעון (כלומר, crosslinking הכימי) מפריע לdecellularization וגם יכול להתפשר ניתוח ספקטרומטר מסה שלאחר מכן באופן משמעותי. להליך כולו, אנו ממליצים על השימוש בצינורות נמוך שימור וטיפים פיפטה כדי למקסם את התאוששות חלבון ופפטיד. 1. Decellularization של רקמות או גידולים הערה: לפני שמתחיל, להכין את חומרים כימיים ולהוסיף מעכבי פרוטאז (מסופקים עם ערכת חילוץ חלבון תא) להיקף הרצוי של כל מאגר. כל מאגרי דגימות צריכים להיות כל הזמן על קרח למשך הניסוי מלבד CS הצפת שצריך להיות כל הזמן על RT כדי למנוע precip SDSitation. הערה: הפרוטוקול משתמשת בסדרה של דגירה במאגרים של pH שונה ומכיל כמות המלחים וחומרי הניקוי ברצף חלבונים תאיים תמצית ולהעשיר לחלבונים מסיסים ECM (איור 1, טבלת 1 שונה; ראה גם דיון לחלופות לשימוש ב ערכה מסחרית מפורט כאן). הכרכים של ריאגנטים בהתחשב להלן לרקמות או גידולים (ראה טבלה 1) 100 מ&quot;ג וצריכים להיות מותאמים כראוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize של רקמה 100 מ&quot;ג ב 500 μl של הצפת C המכיל מעכבי פרוטאז באמצעות homogenizer רקמה עד הרקמה מופרת לחלוטין והשעיה הומוגנית מתקבלת. deoxyribonuclease להוסיף אני (ריכוז סופי: 200 מיקרוגרם / מיליליטר, מחדש בהתאם להוראות היצרן) הערה וribonuclease (ריכוז סופי: מיליליטר 20 מיקרוגרם /, מחדש בהתאם להוראות היצרן) להמאגר נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חילוץ רציף של חלבונים מסיסים תאיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקה של חלבוני cytosolic. דגירה homogenate על הכתף צינור במשך 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס. שמור aliquot קטן (10 μl 20 μl) של homogenate לניתוח כתם מערבי לאחר מכן (ראה סעיף תוצאות צפויים ואיור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogenate ב16,000 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatant בצינור נקי, זה יהווה חלק cytosolic (ג) ניתוח הכתם המערבי. פלאש להקפיא חלק זה ולאחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף, resuspend גלולה ב400 μl של הצפת W מכיל מעכבי פרוטאז ודגירה מדגם על הכתף צינור במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה homogenate ב16,000 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחלץ, חלבונים גרעיניים, resuspend גלולה ב150 μl של הצפת N המכיל מעכבי פרוטאז, deoxyribonuclease אני וribonuclease דגירה המדגם על הכתף צינור למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם ב16,000 XG במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant בצינור נקי. חזור על פעולה זו פעם אחת: לאחר צנטריפוגה המדגם בפעם השנייה, להוסיף את supernatant לsupernatant הקודם: זה יהווה החלק הגרעיני (N) של ניתוח הכתם המערבי. פלאש להקפיא חלק זה ולאחסן ב -80 ° C. לאחר מכן, לבצע שטיפות לפי צעד 1.2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחלץ חלבוני קרום, resuspend גלולה במאגר של M 100 μl מכיל מעכבי פרוטאז ודגירה מדגם על הכתף צינור למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה המדגם ב16,000 XG במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את supernatant בצינור נקי: זה יהווה חלק הקרום (M) של ניתוח הכתם המערבי. פלאש להקפיא חלק זה ולאחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחלץ חלבוני cytoskeletal, resuspend גלולה ב 200 μl של הצפת CS מכיל מעכבי פרוטאז ודגירה מדגם על הכתף צינור למשך 30 דקות ב RT. שים לב שהגלולה לא לפזר באופן מלא. אנו מציעים לשבש את הכדור על ידי pipetting למעלה ולמטה עד שהתבוננות שיבוש של גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם ב16,000 XG במשך 30 דקות ב RT. לאסוף את supernatant בצינור נקי. שים לב, בשלב זה ירידה מסומנת נוסף בגודל של גלולה (ראה וידאו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב150 μl של מעכבי פרוטאז המכיל מאגר C ו דגירה המדגם על הכתף צינור במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה המדגם ב16,000 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את supernatant ולהוסיף אותו לsupernatant הקודם: זה יהווה חלק cytoskeletal (CS) של ניתוח הכתם המערבי. פלאש להקפיא חלק זה ולאחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שטיפות נוספות. Resuspend גלולה ב 500 μl של PBS המכיל מעכבי פרוטאזND דגירה המדגם על הכתף צינור במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה המדגם ב16,000 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant. חזור על פעולה זו שלוש פעמים. הערה: כל העקבות של חומרי ניקוי צריך להסיר על ידי שוטף נרחב לפני העיכול של החלבונים לפפטידים (ראה סעיף 3). בשלב זה, את גלולה מועשרת ECM יכולה להיות פלאש-קפוא והמשיכה ב -80 מעלות צלזיוס. שים לב שהגודל של גלולה יהיה תלוי בכמות של חלבונים מסיסים (ECM) בחומר ההתחלה ואת היעילות של decellularization. </li></ol></li></ol> 2. ניטור איכות Decellularization / העשרת ECM על ידי SDS-PAGE ומערב כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב 10-20 aliquot μl בסך הכל תמצית רקמה ו -50 aliquots μl של שברים ביניים עם Laemmli מאגר המכיל 100 מ&quot;מ DTT. Resuspend, החלק בלתי מסיס מועשר ECM ב3x Laemmli מאגר המכיל 100 מ&quot;מ DTT. הערה: הוא העלה ריכוזיםשל DTT וSDS לסייע בsolubilization של חלבוני ECM שיחסית לא מסיסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את החלבונים על ידי SDS-עמוד ומועבר על גבי קרומי nitrocellulose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע חיסון כתמים באמצעות נוגדנים כדי לפקח על נציג חלבונים של כל אחד משברי cytosolic, גרעיניים, קרום, cytoskeletal וECM (ראה סעיף נציג תוצאות, לוח 2 ואיור 2). </li></ol> 3. עיכול ב- פתרון של חלבונים לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה הערה: גלולה המתקבלת לאחר הליך decellularization וההסרה של SDS היא מועשרת בחלבוני ECM מסיסים לניתוח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסת חלבונים אלה צריכים להיות מעוכלים לפפטידים. שים לב, כתוצאה מinsolubility חלבון ECM, לא ניתן בשלב זה כדי למדוד את ריכוז החלבון של המדגם. כך אנו מספקים כמויות של חומרים כימיים לעיכול ECM-enriדגימות CHED לפפטידים המבוססים על הגודל (מ&quot;מ) או משקל יבש של גלולה מועשרת ECM (לוח 3). הפתרונות של אמוניום ביקרבונט, אוריאה, DTT, iodoacetamide וחומצת trifluoroacetic כל צריכים להיות מוכנים טרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend המדגם מועשר ECM על ידי הוספת הנפח המתאים של 8 מ &#39;אוריאה לגלולה מועשרת ECM ולהוסיף DTT בריכוז סופי של 10mm (ראה טבלה 3). דגירה עם תסיסה מתמשכת ב1,400 סל&quot;ד 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס. הערה: בשלב זה את חלבוני ECM לא יפורקו באופן מלא וחלקיקי חלבון גדולים בעליל לא צריכים להיות מושלכים על ידי צנטריפוגה או סינון. ההשעיה תנקה על deglycosylation ועיכול (ראה וידאו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקילציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון iodoacetamide במי HPLC כיתה. מגניב המדגם לRT ולהוסיף iodoacetamide לריכוז סופי של 25 מ&quot;מ. לאלקילציה המלאה, DTT: יחס iodoacetamide צריך להיות בין 1: 2.5 ו 1: 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בחושך במשך 30 דקות ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deglycosylation: יש צורך deglycosylation להסיר שרשרות צד פחמימות שמפריעות לזיהוי של פפטידים שונה על ידי N -linked glycosylation: הערה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 2 M אוריאה עם pH אמוניום ביקרבונט 100 מ&quot;מ 8.0 ולהוסיף את הכמות המתאימה של PNGaseF (ראה טבלה 3). דגירה עם תסיסה מתמשכת ב1,400 סל&quot;ד 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ליס-C ודגירה עם תסיסה מתמשכת ב1,400 סל&quot;ד 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס. הוסף את טריפסין ודגירה עם תסיסה מתמשכת ב1,400 סל&quot;ד O / N על 37 מעלות צלזיוס. הערה: ההשעיה ECM-עשיר שהחלה מעונן עם הכינון מחדש ראשוני באוריאת 8M מופיעה ברורה לאחר O / N עיכול (ראה וידאו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף aliquot שני של טריפסין למדגם דגירה עם תסיסה מתמשכת ב1,400 סל&quot;ד 2 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חִמוּץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת העיכול, להשבית טריפסין על ידי acidifying המדגם עם חומצה מוכנה טרי 50% trifluoro-אצטית (TFA). המדגם צריך להגיע pH &lt;2. אנו ממליצים להוסיף 1-1.5 μl של 50% TFA בזמן ושימוש 1 μl של פתרון פפטיד למדוד את ה- pH של התמיסה באמצעות נייר pH (ראה וידאו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם acidified ב16,000 XG במשך 5 דקות על RT. לאסוף את supernatant בצינור נמוך שימור נקי. בשלב זה, פתרון פפטיד ניתן לאחסן ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Desalting הערה: שהצעד אחרון זה בדרך כלל נערך במתקן ספקטרוסקופיית מסות על פי השיטות המועדפות שלהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ניתוח פרוטאומיקה, desalt הדגימות ופפטידים eluted עם אצטוניטריל מוכן טרי 60%, 0.1% חומצת trifluoroacetic, ואחריו ריכוז ברכז ואקום. Resuspend פפטידים בacetonitr 3% מוכנים טריאיל, 0.1% חומצת trifluoroacetic 8. הערה: שלאחר desalting, הריכוז של פתרון פפטיד ניתן למדוד על ידי spectrophotometry (ראה סעיף תוצאות צפוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו לנתח את המדגם על ידי ספקטרומטריית מסה, שוב בהתאם לנהלים אופטימליים של מתקן ספקטרומטר המסה. הערה: אנו מעודדים את החוקרים מעוניינים באפיון הרכב ECMS באמצעות ספקטרומטר מסה להתייחס לפרסומים האחרים שלנו 8-10 ואתר המספקים הסבר מפורט יותר, כוללים פרמטרים LC-MS / MS, חיפוש נתונים ספקטרומטר מסה לניתוח זיהוי חלבונים ונתונים באמצעות בסיליקון וmatrisome כלי ביאורנו פתח 8. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hynes, R. O., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+matrisome--an+inventory+of+extracellular+matrix+constituents+and+functions.">Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (1), a004903 (2012).</li><li>Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+assembly:+a+multiscale+deconstruction.">Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), (2014).</li><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">The extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).</li><li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease.">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).</li><li>Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnological+strategies+for+engineering+complex+tissues.">Nanotechnological strategies for engineering complex tissues.</a> Nat Nanotechnol. 6 (1), 13-22 (2011).</li><li>Wilson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix:+an+underexplored+but+important+proteome.">The extracellular matrix: an underexplored but important proteome.</a> Expert Rev Proteomics. 7 (6), 803-806 (2010).</li><li>Naba, A., Hoersch, S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+definition+of+an+ECM+parts+list:+an+advance+on+GO+categories.">Towards definition of an ECM parts list: an advance on GO categories.</a> Matrix Biol. 31 (7-8), 371-372 (2012).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Hoersch, S., Liu, H., Carr, S. A., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+matrisome:+in+silico+definition+and+in+vivo.+characterization+by+proteomics+of+normal+and+tumor+extracellular+matrices.">The matrisome: in silico definition and in vivo. characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices.</a> Mol. Cell Proteomics. 11 (4), M111.014647 (2012).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Whittaker, C. A., Carr, S. A., Tanabe, K. K., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+signatures+of+human+primary+metastatic+colon+cancers+and+their+metastases+to+liver.">Extracellular matrix signatures of human primary metastatic colon cancers and their metastases to liver.</a> BMC Cancer. 14 (1), 518 (2014).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+signatures+of+human+mammary+carcinoma+identify+novel+metastasis+promoters.">Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters.</a> eLife. 3, e01308 (2014).</li><li>Naba, A., Ding, H., Whittaker, C. A., Hynes, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+altered+extracellular+matrix+turnover+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis.">Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> Mol. Cell Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).</li><li>Tsuchiya, T., Balestrini, J. L., Mendez, J. J., Calle, E. A., Zhao, L., Niklason, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+pH+on+extracellular+matrix+preservation+during+lung+decellularization.">Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization.</a> Tissue Eng Part C Methods. 20 (12), 1028-1036 (2014).</li><li>Byron, A., Humphries, J. D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+extracellular+matrix+using+proteomics.">Defining the extracellular matrix using proteomics.</a> Int J Exp Pathol. 94 (2), 75-92 (2013).</li><li>Wilson, R., Diseberg, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+cartilage+extracellular+matrix+formation+and+maturation+using+sequential+extraction+and+label-free+quantitative+proteomics.">Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).</li><li>Belluoccio, D., Wilson, R., Thornton, D. J., Wallis, T. P., Gorman, J. J., Bateman, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+mouse+growth+plate+cartilage.">Proteomic analysis of mouse growth plate cartilage.</a> Proteomics. 6 (24), 6549-6553 (2006).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Dom&#233;nech, N., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sequential+extraction+methodology+for+cardiac+extracellular+matrix+prior+to+proteomics+analysis.+In.">A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. In.</a> Heart Proteomics: Methods and Protocols. 1005, 215-223 (2013).</li><li>Hansen, K. C., Kiemele, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in-solution+ultrasonication-assisted+digestion+method+for+improved+extracellular+matrix+proteome+coverage.">An in-solution ultrasonication-assisted digestion method for improved extracellular matrix proteome coverage.</a> Mol. Cell Proteomics. 8 (7), 1648-1657 (2009).</li><li>Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+characterization+of+extracellular+space+components+in+the+human+aorta.">Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta.</a> Mol. Cell Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).</li><li>Lennon, R., Byron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+reveals+the+complexity+of+the+human+glomerular+extracellular+matrix.">Global analysis reveals the complexity of the human glomerular extracellular matrix.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 25 (5), 939-951 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

שינויים למרות שאנו מועסקים הליך מדויק זה להעשיר את ECM מעשר רקמות וסוגי גידולים 8 - 10, שינויים בפרוטוקול יש לשקול במקרים הבאים: 1) זיהוי של חלבוני ECM בשברי ביניים. מטריצות תאי מרקמות שונות או סוגי גידולים עשויות להיות שונות בextractability / insolubility, כפי שפורטו לעיל לפיברונקטין וlaminins. לדוגמא, הוא חשב כי ECM של רקמות fibrotic או רקמות שיפוץ מתהפך מאוד דינמי ולכן אפשר להתבונן שיעור גבוה יותר של חלבוני ECM ברקמות אלה להיות יותר בקלות ניתן להפיק 12. בהתאם לחלק שבו חלבוני ECM מזוהים, אנו ממליצים להקטין את זמן הדגירה של הצעד שגרמו למיצוי של חלבוני ECM או השמטת צעד ש. 2) Detection של חלק משמעותי של רכיבים תאיים בגלולה מועשרת ECM. בחלק מרקמות או סוגי גידולי תאי יחס: ECM הוא (גידולים למשל, כבד, טחול, שאינה desmoplastic) גבוהים במיוחד. במקרה זה, זיהום משמעותי של החלק מועשר ECM על ידי חלבונים תאיים (בחלבונים מסוימים cytoskeletal ו / או ההיסטונים) ניתן לצפות. לרוקן את החלבונים תאיים ביעילות, אנו ממליצים לחזור פעמיים הדגירה במאגר M ו / או הצפת CS (שני חומרי הניקוי המכילים, בדרך כלל זה מכלה חלבונים תאיים בשפע). חלופה נוספת תהיה להשתמש מאגרים חלופיים עם ריכוזי אבקת גבוהים יותר, עם האזהרה כי זה עלול להוביל לדלדול של חלבוני ECM יחסית יותר מסיסים וכן (ראה הסעיף הבא). 3) אלטרנטיבי לשימוש בערכה מסחרית. לא הצליחו, מסיבות קנייניות, כדי לקבל את ההרכב המדויק של המאגרים הלוך ושובמ &#39;הספק של ערכת חילוץ חלבון הממודרת. עם זאת, יש לנו כלל בטבלה 1 הערות על סמך הניסיון שלנו באמצעות מאגרי תוצרת בית עם חומר ניקוי מוגדר (NP-40, deoxycholate נתרן וSDS) ריכוזים לנהל עקירות דומות. מחקר שנערך לאחרונה גם הדגיש את חשיבותו של ה- pH של מאגרי decellularization לשמור חלבוני ECM 13. מגבלות של הטכניקה השיטה המוצגת כאן מסתמכת על העובדה שחלבוני ECM הם מהותי יותר מסיס מאשר רוב החלבונים תאיים. עם זאת, שיטת decellularization מתוארת כאן בהחלט תמציות מרכיבים מסיסים הנוכחיים בתוך ECM כגון כמה גורמי גדילה או אנזימי שיפוץ-ECM. למרות שהחלבונים הקשורים ECM ההדוק לחלבוני ECM אותרו על ידי פרוטאומיקה בדגימות מוכנות כפי שתוארו, שיטה זו עשויה להיות מחמירה מדי לפרופיל ההרכב מלא הקשורים matrisomeחלבונים. משמעות של הטכניקה ביחס לשיטות אחרות יתרונה של השיטה שהוצגה כאן על פני שיטות אחרות הוא שזה יכול להיות מותאם לאופי של ECM עניין: ניתן להשמיט צעדי ביניים או חוזר ונשנה, כדי למנוע האובדן של חלבוני ECM או להגדיל את הדלדול של זיהום חלבונים תאיים בהתאמה. שיטה זו משתמשת גם רק כמויות מזעריות של חומרי ניקוי ששטפו כדי למנוע ההפרעה שלהם עם הכנת פפטיד שלאחר מכן וספקטרומטר מסה. לבסוף, בשיטה המתוארת כאן כדי לעכל הכנות חלבון ECM-עשיר לפפטידים יש גם את היתרון של לא דורש חלבונים להיות מסיסים ויכולים להתנהל על שברים מועשרים ECM &quot;גולמיים&quot;. שיטות אלטרנטיביות decellularization ניצול chaotropes (כגון hydrochloride guanidine) ללמוד את ההרכב של ECMS ידי ספקטרומטריית מסה שbeen דווח בספרות (ביקורת ב -14) והיה בשימוש בשילוב עם ספקטרומטריית מסה לאפיין את הרכב ECM של סחוס 15,16, לב 17, בלוטת החלב 18 וכלי דם 19 ו -20 ממברנות מרתף גלומרולרי. המלצות אין להשתמש בשיטות decellularization העסקת טריפסין לעכל את תאים אם ECMS מועשר לפרוטאומיקה לאחר ניתוח, כtrypsinization יגרום עיכול ECM חלקי ואובדן חלבוני ECM ופפטידים. באופן דומה, אם עיכול collagenase היה לשמש כדי לסייע שיבוש רקמות, זה היה צריך להיות במעקב צמוד כפי שהוא גורם לעיכול ECM ואובדן חלבוני ECM ופפטידים. לעומת עיכול בג&#39;ל ב- פתרון? חלבוני ECM הם צולבים ומסיסים מאוד ו, גם כאשר resuspended במאגר 3x Laemmli (המכילים 6% SDS) ו100mm DTT, PO הנפרדאורלי על ג&#39;לי SDS. כך ב- ג&#39;ל עיכול הוא לא שיטה מועדפת. יישומים עתידיים ראוי לציין, כי בעוד לא נדון כאן, בהרכב של כל אחד משברי ביניים שנאספו במהלך decellularization יכול גם להיות מנותח על ידי ספקטרומטריית מסה. זה עשוי להיות יקר במיוחד כאשר לומדים מדגמים קטנים מאוד (כלומר, ביופסיות אנושיות) או כאשר מידע רצוי בשברים סלולריים אחרים.

מטריקס (ECM) הוא meshwork מורכב של חלבונים צולבים ומסוכרים שמספקים תמיכה אדריכלית ומעגן לתאים ומגדיר, בחלקו, ביו-המכאניים המאפיינים &#39;רקמות 1,2. חלבוני ECM גם לאותת לתאים באופן ישיר באמצעות קולטנים (למשל, integrins, syndecans, וכו &#39;) שלהם או על ידי ויסות גורם גדילת איתות 3. ECM כך מספק רמזי biophysical וביוכימיים שרגולטורים עיקריים של תהליכים תאיים כגון התפשטות, הישרדות, קיטוב, בידול, הגירה, וכו &#39; ECM משחק תפקידי מפתח בפיזיולוגיה, התפתחות והזדקנות 4. יתר על כן, כמה פתולוגיות, כגון מחלות לב וכלי דם, סיסטיק, מחלות שרירים ושלד, סרטן, נגרמות על ידי, או לגרום ל, שינויי ECM. יתר על כן, ECM תורם לשמירה על נישות בתאי גזע וזיהוי מולקולות ECM מפתח הבstemness התמיכה יהיה יישום ישיר בהנדסת רקמות ורפואת רגנרטיבית 5. עם זאת, למרות חשיבותה, ECM נשאר, עד לאחרונה, underexplored 6. בסיליקון והניתוח גילה כי matrisome, שהוגדר כהרכב של ECM וחלבונים הקשורים ECM, כולל את המוצרים של כמה מאה גנים בגנום האנושי והן עכבר 1,7,8. עם זאת, insolubility של חלבוני ECM הפריע האפיון השיטתי של הרכב in vivo מטריצות תאית של דגימות נורמליות ופתולוגיים. לאחרונה הוכיחו כי insolubility זה יכול להיות הפך ליתרון ולהשתמש בם כדי להעשיר את חלבוני ECM 8 - 10. אנחנו ואחרים נוספים הוכיחו כי ספקטרומטר מסה הייתה שיטה של בחירה לאפיין את ההרכב של ECMS 8 - 10, 13. אנחנומתאר כאן הליך decellularization שמורכב מincubations רציף במאגרים של pH שונה וריכוזי מלח וחומרי ניקוי. תוצאות הליך זה בחילוץ (או דלדול) של חלבוני cytosolic, גרעיניים, קרום וcytoskeletal וההעשרה של חלבוני ECM. לאחר מכן, אנו מתארים כיצד לעכל הכנות חלבון מועשר ECM לפפטידים לניתוח שלאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה. שימוש בנהלים מפורטים ומאויר כאן, יש לנו מועשר בהצלחה ומאופיינת בספקטרומטר מסת המטריצות תאית מעשר רקמות שונות וסוגי גידולים: ריאות נורמליות עכברית 8, אנושי ומעי גס בעכברי 8,9, כבד אנושי 9, גידולי מעי גס אנושיים ונגזרים גרורות בכבד 9, xenografts מלנומה 8, xenografts החלב גידול 10, איי לבלב בעכברים וinsulinomas עכברי (נאבא et al., לא פורסם). השוואה של matrisom השוניםes חשף חתימות ECM דקיקות ובגידול ספציפי שעוד יכולים לשמש כסמנים ביולוגיים לאבחון או לפרוגנוסטיים פוטנציאליים. אנו מאמינים כי הליך זה יכול להיות מיושם על דגימות אחרות ללא או קטנים יחסית שינויים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer: Bullet blender + beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BB24-AU</td>
			<td>http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compartmental Extraction kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>2145</td>
			<td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34877</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4883</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td>http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0704S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td>http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoro-acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51101</td>
			<td>http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td>http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis

מטריקס (ECM) הוא meshwork מורכב של חלבונים צולבים המספק רמזי biophysical וביוכימיים שרגולטורים עיקריים של התפשטות תאים, הישרדות, הגירה, וכו &#39;ECM משחק תפקידים חשובים בפיתוח ובפתולוגיות שונות, כולל לב וכלי דם ומחלות שרירים ושלד, סיסטיק, וסרטן. לפיכך, המאפיין את ההרכב של ECMS של רקמות בריאות וחולות יכול להוביל לזיהוי של סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים ואבחון חדשניים ומטרות טיפוליות חדשניות פוטנציאל. עם זאת, הטבע מאוד של חלבוני ECM (גדולים בגודל, צולבים וקוולנטית כפותים, glycosylated בכבדות) הפך את הניתוחים ביוכימיים של ECMS המאתגר. כדי להתגבר על האתגר הזה, פיתחנו שיטה להעשרת ECMS מרקמות טריות או קפוא וגידולים שמנצל את insolubility של חלבוני ECM. אנו מתארים כאן בפירוט את הליך decellularization שמורכבת מאני עוקבncubations במאגרים של pH שונה וריכוזי מלח ואבקת כביסה וכי תוצאות 1) הפקת תאית (cytosolic, גרעיני, הקרום וcytoskeletal) חלבונים ו -2) ההעשרה של חלבוני ECM. לאחר מכן, אנו מתארים כיצד deglycosylate ולעכל הכנות חלבון מועשר ECM לפפטידים לניתוח שלאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.

בקרת איכות של הליך decellularization היעילות של decellularization יכולה להיות במעקב על ידי ניתוח תוכן החלבון של כל חלק על ידי כתם מערבי. טבלה 2 חלבוני רשימות של ערך אבחון להעריך את איכותו של הליך decellularization. איור 2A מציג את המיצוי יעיל בשברי ביניים של cytosolic (GAPDH ), גרעיניים (ההיסטונים), קרום (integrin β1) וcytoskeletal (חלבונים אקטין), בעוד שלא חלבוני ECM (אני קולגן) מזוהה בשברים אלה (איור 2). בתורו, את הכדור האחרון הוא מועשר לחלבונים ECM והמדולדל במידה רבה של חלבונים תאיים (איור 2 א). איור 2 מציג דלדול חלבון תאיים משביע רצון (לא היסטון מזוהה בחלק ECM-עשיר), אם כי, אקטין עדיין יכול להיות מזוהים ב חלק ECM-עשיר ודלדול של קולגן אני monomeric- משקל מולקולרי לכאורה ~ 110 kDa, מוחזקים מתאים לקולגן unassembled אני - ניתן לצפות בחלק CS. אנחנו גם לפקח באופן שגרתי חלבוני ECM נוספים כגון פיברונקטין וlaminin, אם כי, ברקמות מסוימות יכולים להיות solubilized רכיבים אלה באופן חלקי בשברים קודמים 8-10. לדוגמא, פיברונקטין מתרחש גם פיברונקטין פלזמה מסיס שכאינו משולב בECM. טפטוף של הרקמה לפני המיצוי מפחית ריכוז פיברונקטין פלזמה אבל לא תמיד לחסל אותו. בחלק מהרקמות, laminins נמצא קשור באופן רופף עם השטח פני התא או ECM ותמצית שבברי ביניים. במקרה זה ניתן לטפל זה על ידי שינוי תנאי חילוץ (ראה דיון). שים לב שההעשרה של חלבוני ECM ודלדול נלווה של רכיבים תאיים מבוססת על מסיסותם היחסית של חלבונים במאגרים השונים. ההוא שונים בין רקמות שונות - ובמקרים מסוימים ההיסטונים ויקטינו בקלות רבה יותר מאשר בחילוץ אחר. כמו כן שימו לב שלמרות שההיסטונים צפויים להיות מופקים בחלק N (איור 2), לעתים קרובות אנו מתבוננים דלדול של ההיסטונים בM או חלק CS (איור 2 א &#39;וב&#39;) שלם יותר. ריכוז הפפטיד אינדיקטיבי צפוי הריכוז של פתרון פפטיד שהושג לאחר עיכול, החמצה וdesalting ניתן למדוד על ידי spectrophotometry או על ידי מדידת הספיגה של פתרון פפטיד באמצעות אורך הגל של 280 ננומטר המתאים לטריפטופן, טירוזין, או באמצעות אורך הגל 205 ננומטר המתאים לספיגה של פפטיד אגרות חוב. מדדנו את הריכוז של פתרונות פפטיד התקבלו מdecellularization של שלוש דגימות עכברי ריאות (82 מ&quot;ג, 100 מ&quot;ג, 100 מ&quot;ג ו, בהתאמה) prepaאדום במקביל ומתקבל מכל אחד: 424 ng / μl, 450 ng / μl, ו580 ng / μl של פפטידים בהתאמה. זיהוי של פפטידים ECM על ידי ספקטרומטריית מסה ניתוח ספקטרומטריה של ההרכב של דגימות חלבון מועשר ECM, הכינו כפי שתואר כאן, הראה כי&gt; 70% מעוצמת האות מתאים לECM והחלבונים הקשורים ECM 8-10. נפח הטבלה 1. של חומרים כימיים מערכה הממודרת הפקה לdecellularize 100 מ&quot;ג (משקל רטוב) של רקמה או גידול. טבלה זו מפרטת את ההרכב ואת עוצמת הקול של כל מאגר המשמש לביצוע decellularization של רקמה או גידול של 100 מ&quot;ג. קוקטייל של מעכבי פרוטאז מסופק כפתרון 50x וצריך להוסיף לכל חיץ 2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריאגנטים מערכת חילוץ חלבון תא </td><td> נפח לרקמה 100 מ&quot;ג </td><td> הרכב (המבוסס על # גליון הנתונים של חתול Millipore 2,145 1) </td></tr><tr><td> המאגר C </td><td> 500 μl </td><td> HEPES (pH 7.9 3), MgCl 2, KCl, 4 EDT, סוכרוז, גליצרול, נתרן Orthovanadate 5 </td></tr><tr><td> המאגר W </td><td> 400 μl </td><td> HEPES (pH 7.9), MgCl 2, KCl, EDTA, סוכרוז, גליצרול, נתרן Orthovanadate </td></tr><tr><td> המאגר N </td><td> 150 μl x 2 </td><td> HEPES (pH 7.9), MgCl 2, NaCl, EDTA, גליצרול, נתרן Orthovanadate </td></tr><tr><td> המאגר W </td><td> 400 μl </td><td> HEPES (pH 7.9), MgCl 2, KCl, EDTA, סוכרוז, גליצרול, נתרן Orthovanadate </td></tr><tr><td> המאגר M </td><td> 100 μl </td><td> HEPES (pH 7.9), MgCl 2, KCl, EDTA, סוכרוז, גליצרול, deoxycholate נתרן (DOC) 6, NP-40 6 </sup&gt;, נתרן Orthovanadate </td></tr><tr><td> המאגר CS </td><td> 200 μl </td><td> צינורות (pH 6.8), MgCl 2, NaCl, EDTA, סוכרוז, נתרן Dodecyl סולפט (SDS) 7, נתרן Orthovanadate </td></tr><tr><td> המאגר C </td><td> 150 μl </td><td> HEPES (pH 7.9), MgCl 2, KCl, EDTA, סוכרוז, גליצרול, נתרן Orthovanadate </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> 500 μl / לשטוף </td><td> - </td></tr></tbody></table> הערות: 1 מסיבות קניינית, שלא הצליחה להשיג את ההרכב המדויק של המאגרים מהספק של הערכה, אך אנו כוללים כאן כמה הערות על סמך הניסיון שלנו באמצעות מאגרי תוצרת בית לנהל עקירות דומות. 2 מעכב פרוטאז: רצוי כולל מגוון של מעכבים נגד ציסטאין, סרין ותראונין peptidases, esterases סרין, metalloproteinases קטיון תלוי דו ערכי וכו &#39;קוקטיילים מעכבי פרוטאז זמינים מסחרי רבים קיימים. 3 pH מעל 7.0 הוא מעכב יעיל של פרוטאזות lysosomal. 4 EDTA (משמש בדרך כלל ב2 מ&quot;מ) הוא מעכב יעיל של פרוטאזות קטיון תלוי דו הערכית. 5 orthovanadate נתרן הוא מעכב phosphatase. ריכוז יעיל טיפוסי יהיה .5-5 מ&quot;מ. 6 NP40 על 0.1% -0.5% מספיקים כדי solubilize שומני הקרום ביותר. השילוב של NP40 וDOC - משמש לעתים קרובות בריכוזים שווים (לדוגמא, 0.5% מכל אחד) - משמשים לעתים קרובות כמוצא מחמיר יותר שעדיין משאיר אינטראקציות בין חלבונים רבים בשלמותה. 7 SDS הוא חומר ניקוי יוני מחמיר יותר (0.1% CMC). גם זה יכול לשמש בשילוב עם שני חומרי ניקוי האחרים SDS / NP40 / DOC 0.1 / 0.5 / 0.5% כחיץ החמרת ביניים. טבלה 2. חלבונים לאבחון ללפקח על איכות הליך decellularization. טבלה זו מפרטת דוגמאות של חלבונים כי הם מאפיינים של כל תא subcellular (cytosol, גרעין, קרום פלזמה, שלד תא וECM), שניתן להשתמש כדי לפקח על האיכות של הליך decellularization ואת היעילות של ECM-העשרה. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תאיים תא </td><td> חלבונים אבחון </td></tr><tr><td> חלבוני cytosolic </td><td> דהידרוגנז glyceraldehyde 3-פוספט (GAPDH) </td></tr><tr><td> חלבונים גרעיניים </td><td> ההיסטונים, Lamins, Nucleoporin </td></tr><tr><td> חלבוני קרום </td><td> Integrins, transferrin קולטן </td></tr><tr><td> חלבוני cytoskeletal </td><td> אקטין, טובולין, vimentin </td></tr><tr><td> חלבוני ECM קרום במרתף </td><td> קולגן IV, Nidogens, Laminins </td></tr><tr><td> חלבוני ביניים ECM (ביניים) </td><td> קולגן אני, קולגן III, קולגן VI, פיברונקטין </td></tr></tbody></table> להמלצה על נוגדנים, לראות הפרסומים שלנו 8-10. נפח הטבלה 3. של חומרים כימיים לעכל דגימות מועשרות ECM לפפטידים. טבלה זו מפרטת חומרים כימיים המשמשים לresuspend דגימות חלבון מועשר ECM ולהפחית, alkylate, deglycosylate ולעכל דגימות חלבונים לפפטידים לפני ניתוח ספקטרומטר מסה. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריאגנטים </td><td> הכנה </td><td> ריכוז / סכום סופי לגלולה 1 מ&quot;מ בעובי (~ 5-10 משקל מ&quot;ג יבש) </td><td> נפח לגלולה 1 מ&quot;מ בעובי (~ 5-10 משקל מ&quot;ג יבש) </td></tr><tr><td> אמוניום ביקרבונט (NH 4 HCO 3) </td><td> 100 פתרון מ&quot;מ במי HPLC כיתה </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> אוריאה </td><td> 8 M פתרון ב100 אמוניום ביקרבונט מ&quot;מ </td><td> 8 מ &#39; </td><td> 50 μl </td></tr><tr><td> Dithiothreitol </td><td> מחדש במי HPLC כיתה ב 500 מ&quot;מ </td><td> 10 מ&quot;מ </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> Iodoacetamide </td><td> מחדש במי HPLC כיתה ב 500 מ&quot;מ </td><td> 25 מ&quot;מ </td><td> 2.5 μl </td></tr><tr><td> Peptide- N -Glycosidase F (PNGaseF) </td><td> פתרון מסחרי ב 500 U / μl </td><td> 1,000 U </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> כיתה ספקטרומטריית Endoproteinase LysC, מסה </td><td> מחדש במי HPLC כיתה ברמה של 0.5 מיקרוגרם / μl </td><td> 1 מיקרוגרם </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> טריפסין, כיתה ספקטרומטר מסה (סיבוב 1) </td><td> פתרון מסחרי ברמה של 0.5 מיקרוגרם / μl </td><td> 3 מיקרוגרם </td><td> 6 μl </td></tr><tr><td> טריפסין, כיתה ספקטרומטר מסה (סיבוב 2) </td><td> פתרון מסחרי ברמה של 0.5 מיקרוגרם / μl </td><td> 1.5 מיקרוגרם </td><td> 3 μl </td></tr><tr><td> חומצה אצטית Trifluoro-(TFA) </td><td> פתרון של 50% במי HPLC כיתה </td><td> - </td><td> 2-5 μl </td></tr><tr><td> אצטוניטריל (elution) </td><td> פתרון 60% עם 0.1% TFA במי HPLC כיתה </td><td> - </td><td> 500 μl </td></tr><tr><td> אצטוניטריל (הכינון מחדש) </td><td> פתרון 3% עם 0.1% TFA במי HPLC כיתה </td><td> - </td><td> 100 μl </td></tr></tbody></table><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig1highres.jpg" width="600" /> תכנית איור 1. של ההליך ניסיוני. עבודה סכמטי של protocol לdecellularize רקמות (סעיף 1), לשלוט באיכות של decellularization ולהעריך את העשרת ECM (סעיף 2) ולעכל דגימות חלבון מועשר ECM לפפטידים לפני ניתוח המוני ספקטרומטריית (סעיף 3). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig2highres.jpg" width="500" /> שליטת איור 2. איכות של הליך decellularization על ידי כתם מערבי כתמים מערביים בוצעו על ריאות עכברי () וxenograft החלב אנושי קרצינומה (ב) דגימות באמצעות הנוגדנים הבאים:. אנטי-אקטין ארנב (שיבוט 14-1) ואנטי ארנב -β1 integrin נוגדנים המיוצרים במעבדה שלנו; אני ארנב נגד קולגן, עכבר אנטי-GAPDH ונוגדני ארנב נגד פאן-ההיסטונים היו מMillipore. לאחר דגירה נוגדן ראשונית, הקרומים נשטפו וטופחו בנוכחות נגד ארנב HRP-מצומדות עז או עז אנטי-mouנוגדנים משני se ממעבדת ImmunoResearch ג&#39;קסון. לבסוף, הקרומים נשטפו וטופחו במערב ברק ™ chemiluminescence מגיב (PerkinElmer LAS). * מציין זיהום היסטון שייר מינימאלי של חלק ECM-עשיר. ** מציין דלדול חלקי שלי monomeric (מוחזקי unassembled) קולגן בשבריר CS. *** מצביע זיהום אקטין שייר של חלק ECM-עשיר. למרוח מזוהה עם הנוגדן אנטי-קולגן מייצג רמות לאחר translational שינויים (למשל, cross-linking, glycosylation) שונות.

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

enrichment-extracellular-matrix-proteins-from-tissues-digestion-into

Research

JoVE Journal

Biology

26.6K Views.  Massachusetts Institute of Technology. This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry. 

Video: Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

גל T-Ion Mobility-ספקטרומטריית מסה: הפרוצדורות בסיסי לניתוח חלבונים מורכבים

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

בלחץ אטמוספרי מולקולרית והדמיה של רקמות ביולוגיות באמצעות Biofilms LAESI המוניים ספקטרומטריית

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

ניתוח ישיר של תאים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

מהיר, שיטת Scalable עבור הבידוד, הלימוד פונקציונלי, וניתוח של מטריקס תאים שמקורם

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

הכנת הדוגמא מסה ספקטרומטר מבוססת על ניתוח פרוטאומיקס של עינית Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...