The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.

1. תא ניקוי מערכת Sonifier <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את האיחוד בין כלורופורם הקרן וממיר באמצעות ספוגית וכותנה. החל נפט אור או שמן מינרלים לאשכולות של הצופר וממיר כדי להסיר הצטברות של שבבי מתכת, חלודה, או חמצון נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש כלורופורם כדי להסיר את השמן וכל מזהמים אחרים מברית לאחר שנגב את החוטים עם שמן. </li></ol> 2. הרכבת התא Sonifier והגדרת המערכת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר מחדש את הקרן לממיר. למומנט המערכת כראוי, להסיר את ממיר התאסף וקרן ממכלול הכוס על ידי משיכת הקרן מתוך תחתית הכוס (איור 2 א). מניחים ברגים חריץ בתוך אחד משלושת החורים הקטנים בחלק העליון של ממיר (איור 2). לאחר מכן, מקם מצוידים ברגל של עורב אינץ &#39;וחצי בחלק מחוררת של הקרן (איור 2) מומנט-מפתח ברגים. להדק ביםtandard כיוון השעון עד מטר המומנט קורא 54.23 N. מ &#39;(איור 2 ג), המומנט המומלץ על ידי היצרן 16. התאם את ממיר התהדק וקרן חזרה לכוס, והר הקרן וממיר לעמדת טבעת בתנוחה זקופה. חבר מחדש את ממיר לאספקת החשמל לפני הגדרת המערכת למינון דופק ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המערכת למינון דופק באמצעות 1 שניות של sonication עם 1 שניות בין פולסים. מודלים מינון שונים עשויים לשמש לתנאי ניסוי אחרים. משתנים רבים, כגון נפח מים וקוטר קרן פוטנציאלי ידרשו שינויים במינון זה. שימוש בסוגים הנ&quot;ל מדגם תא, הנפח, וריכוז, הנתונים ותצפיות אמפיריים הובילו לגיבוש משטר מינון זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאמת המערכת למשרעת הרצויה. בפרוטוקול זה, להשתמש 33% ו -50% משרעת כדי למנוע הרס תא שלם, אשר יהפוך את היעילות של sonosensitizers קשה או בלתי אפשרי לאמוד. הערה: במחקר זה אמפליטודות מושווה. </li></ol> 3. הערכת עצמת מערכת ופונקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את מד cavitation 1.5 סנטימטר, שהיא הרמה של sonication המדגם. שים לב לקריאות להעריך כי המערכת פועלת בעצמה צפויה. שימוש ברמות המערכת והמים הנוכחיות, מצפה בין 100-110 W / 2 סנטימטר למשרעת של 33% ו115-125 W / 2 סנטימטר למשרעת של 50%. שים לב לקריאות מונה cavitation מתצוגת המטר המייצגת אנרגיית cavitation בסנטימטרי W / 2 באופן ישיר. קח הקריאות הללו על פני השטח של המים, ולהבטיח שאין בועות נמצאות בפרצוף של חללית מטרים. הערה: חשוב לציין כי הליכים אלה נעשים ללא הכובע לגישה מעל הצופר. הם לא צריכים להיות חוזרים ונשנים אחרי כל sonication. במקום זאת, הם צריכים להתבצע רק לאחר הניקוי, הרכבה, והקמת המערכת. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את hydrophone בבקבוקון המכיל מדגם 12.5 מיליליטר של מים כדי לטבול את חיישן hydrophone מלא. להשעות את hydrophone באמצעות דוכן הטבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את hydrophone לקלט של אוסצילוסקופ כדי להעריך מאפייני צורת גל. בדוק את אוסצילוסקופ לגל סינוס ברור, כמו גלים חריגים יכולים לשנות את התדר של המערכת מהמפרט של היצרן. שני מטר cavitation ואוסצילוסקופ לתת קריאת תדר, אלא רק את אוסצילוסקופ יציג גלים חריגים שמעידים על מערכת פגומה או לא תקינה הרכבה. </li></ol> 4. הכנת תאים ובינוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום באמצעות 240 מיליליטר בינוני של Dubecco (IMDM) השתנה של Iscove ו -50 מיליליטר בסרום שור עוברי. לא להפשיר בסרום שור עוברי באמבט מים חם, עם עלייה מהירה בטמפרטורה יכולה להוביל לפשרה ביציבות בסרום. לשלב 240 μl גנטמיצין 50 מ&quot;ג / מיליליטר ו -5 מיליליטר פניצילין/ סטרפטומיצין 100x בבקבוק תרבות סטנדרטי, ולהוסיף לבינוני. אחסן הבינוני על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הזרע U937 ב ~ 4 x 10 4 תאים / מיליליטר בבקבוק 25 סנטימטר 2 באמצעות המדיום מוכן. להעריך תאים לריכוז ויכולת קיום באמצעות דלפק תא TC20 וtrypan הדרה כחולה על ידי הצבת 15-20 μl של תאים וtrypan כחול 15-20 μl לתוך צינור מיקרו צנטריפוגות וערבוב את התוכן. μl Pipette15-20 של תערובת זו לשקופית דגימת TC20, וליזום ספירה על ידי הצבת את השקופית לדלפק תא TC20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ולבדוק כדאיות תא באמצעות הרחקת trypan כחולה ודלפק תא TC20. כאשר התאים בריכוז מתאים ו / או טופלו בsonosensitizers למסגרת זמן מתאים, העברה 3 מיליליטר של תאים מהבקבוק התרבות לבקבוקון נצנץ זכוכית 20 מיליליטר. בפרוטוקול זה, לגדל תאי U937 במשך 48 שעות, ולאחר מכן לטפל עם 0.5, 1,או 5 מ&quot;מ MeβCD למשך 30 דקות לרוקן מספיק הכולסטרול של תאים לפני sonication. </li></ol> 5. תא Sonication <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגה deionized, מים מזוקקים באמצעות ואקום ובקבוק בוכנר. העבר את המים לכוס הקרן, ולמלא עד לרמה של 15 מ&quot;מ מעל החלק העליון של הקרן. תהליך sonication גורם סילוק גזים נוספים של המים לתקופה של כמה דקות, ויכול להוביל לחוסר עקביות במהלך הניסוי אם המערכת לא תפעל לפני לטעום sonication. לכן, להפעיל את המערכת ל~ 7 דקות לפני לטעום sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את בקבוקון הנצנץ המכיל את התאים למכשיר החזקה. לאחר מכן, חבר את מכשיר האחזקה לחלק העליון של קרן הכוס ולהגדיר לגובה של 15 מ&quot;מ מהחלק העליון של הקרן (על פני המים באמצעות מנגנון הזזה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים בדרך כלל sonicated באמצעות שלושה 1 פולסים שניות של אולטרסאונד, עם 1 שניות מרווח בין כל אחד מאלה קטניות. לזהפרוטוקול, תאי sonicate ב 33% ומשרעת 50% באמצעות מינון הדופק הנ&quot;ל. </li></ol> 6. הערכת תאים לניזק לאחר sonication <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את התאים הושעו לנזק וכדאיות באמצעות trypan כחול ודלפק תא TC20. בנוסף, לנתח את המדגם באמצעות דלפק Z2. לניתוח דלפק Z2, פיפטה השעיה תא 100 μl למלוח 20 מיליליטר איזוטוני (200: 1 יחס). לפני הניתוח, לשטוף את הצמצם של מנתח חלקיקי Z2 לפחות פעמיים באמצעות מלוח איזוטוני. מניחים את מדגם Z2 בבעל הדלפק, ולהעלות את הפלטפורמה לצמצם לפני ביצוע ספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש נתונים מדלפקי TC20 וZ2 באמצעות תוכנה המסופקת על ידי היצרן. לנתח נתונים אלה לנזק לתאים, כדאיות, ויצירת פסולת הסלולר מsonication. </li></ol> 7. XTT Assay לקביעת כדאיויות תא ומיטוכונדריאלי הפעילות של U937 טופל וTHP1 תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PRIOr למבחני XTT, לגדול U937 וTHP1 תאים באותם תנאים. Pretreat תאים עם אותו טווח הריכוז של MeβCD למשך 30 דקות לפני sonication. השתמש באותם הפרמטרים אולטרסאונד כמו קודם, אלא שתאים עכשיו sonicated באמצעות מגוון של 1-3 אחד פולסים שניות במרווחים של שניות אחד לפתח מגוון של נזק לערכת XTT להעריך. הערה: רבים מהפעולות הבאות לקוחים ישירות מהמדריך לערכת XTT וחוזרים על עצמם רק לנוחיות של מעבדות מעוניינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים על ידי צנטריפוגה XG 200 במשך 10 דקות. גלולה תא גלולה במדיום הגידול שתוארה קודם לכן. תאי Resuspend ב ~ 1 x 10 5 תאים / מיליליטר. תאי זרע U937 בכל טוב 100 μl לצלחת microtiter 96-גם שטוחות תחתונה בשלושת עותקים, ולאחר מכן לחזור לTHP1 תאים באמצעות צלחת 96-היטב נפרדת. כולל 3 בארות שליטה המכילות מדיום גידול להשלים לבד כמו קריאות ספיגה ריקה 100 μl. לאחר מכן, דגירה הצלחות המחוסנות עבור 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר שני aliquots של מגיב XTT ומגיב הפעלה על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. aliquots מערבולת בעדינות עד פתרונות ברורים מתקבלים. להוסיף 0.1 מיליליטר של מגיב ההפעלה 5.0 מיליליטר של מגיב XTT, המהווה פתרון XTT הופעל מספיק עבור assay צלחת microtiter 96-גם אחד. חזור על התהליך עבור הצלחת אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של הפתרון מופעל-XTT היטב כל אחד. להחזיר את הצלחת לתרבות תא חממת CO 2 לשעה 2. לנער את הצלחת בעדינות לאחר תקופת הדגירה לפזר באופן אחיד את הצבע הכתום בבארות החיוביות. מדוד את הספיגה של בארות assay המכילות את התאים ואת בארות שליטת רקע ריקות באורך גל בין 450-500 גל ננומטר באמצעות קורא צלחת microtiter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> או אפס קורא צלחת microtiter באמצעות בארות שליטה ריקות או לגרוע הערך הממוצע שלהם מהתוצאות הספציפיות. מדוד את הספיגה של כל בארות assay שוב בwavelengה בין 630-690 ננומטר ולהפחית את הערכים מ450-500 ערכי ננומטר הושגו. הערה: קביעת הספיגה שנייה זה עוזרת למנוע קריאות שאינן ספציפיות מתוצאות assay. Assay XTT חזר על עצמו ארבע פעמים לשתי שורות התאים. </li></ol>

<ol>
	<li>Trendowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+sonodynamic+therapy.">The promise of sonodynamic therapy.</a> Cancer Metastasis Rev. 33 (1), 143-160 (2014).</li><li>Semins, M. J., Trock, B. J., Matlaga, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+shock+wave+rate+on+the+outcome+of+shock+wave+lithotripsy:+A+meta-analysis.">The effect of shock wave rate on the outcome of shock wave lithotripsy: A meta-analysis.</a> J Urol. 179 (1), 194-197 (2008).</li><li>Pace, K. T., Ghiculete, D., Harju, M., Honey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shock+Wave+Lithotripsy+at+60+or+120+shocks+per+minute:+A+randomized,+double-blind+trial.">Shock Wave Lithotripsy at 60 or 120 shocks per minute: A randomized, double-blind trial.</a> J Urol. 174 (2), 595-599 (2005).</li><li>McClain, P. D., Lange, J. N., Assimos, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+shock+wave+lithotripsy:+a+comprehensive+review.">Optimizing shock wave lithotripsy: a comprehensive review.</a> Rev Urol. 15 (2), 49-60 (2013).</li><li>Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healing+sound:+the+use+of+ultrasound+in+drug+delivery+and+other+therapeutic+applications.">Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications.</a> Nat Rev Drug Discov. 4 (3), 255-260 (2005).</li><li>Cordeiro, E. R., Cathelineau, X., Th&#252;roff, S., Marberger, M., Crouzet, S., de la Rosette, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-intensity+focused+ultrasound+(HIFU)+for+definitive+treatment+of+prostate+cancer.">High-intensity focused ultrasound (HIFU) for definitive treatment of prostate cancer.</a> BJU Int. 110 (9), 1228-1242 (2012).</li><li>Li, P. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-intensity+focused+ultrasound+treatment+for+patients+with+unresectable+pancreatic+cancer.">High-intensity focused ultrasound treatment for patients with unresectable pancreatic cancer.</a> Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 11 (6), 655-660 (2012).</li><li>Xiaoping, L., Leizhen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+of+high+intensity+focused+ultrasound+(HIFU)+for+pancreatic+cancer.">Advances of high intensity focused ultrasound (HIFU) for pancreatic cancer.</a> Int J Hyperthermia. 29 (7), 678-682 (2013).</li><li>Lukka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-intensity+focused+ultrasound+for+prostate+cancer:+a+systematic+review.">High-intensity focused ultrasound for prostate cancer: a systematic review.</a> Clin Oncol (R Coll Radiol). 23 (2), 117-127 (2011).</li><li>So, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIFU+ablation+is+not+a+proven+standard+treatment+for+localized+prostate+cancer).">HIFU ablation is not a proven standard treatment for localized prostate cancer).</a> Can Urol Assoc J. 5 (6), 424-426 (2011).</li><li>Crouzet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-gland+ablation+of+localized+prostate+cancer+with+high-intensity+focused+ultrasound:+oncologic+outcomes+and+morbidity+in+1002+patients.">Whole-gland ablation of localized prostate cancer with high-intensity focused ultrasound: oncologic outcomes and morbidity in 1002 patients.</a> Eur Urol. 65 (5), 907-914 (2014).</li><li>Tezel, A., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+inertial+cavitation+bubbles+with+stratum+corneum+lipid+bilayers+during+low-frequency+sonophoresis.">Interactions of inertial cavitation bubbles with stratum corneum lipid bilayers during low-frequency sonophoresis.</a> Biophys J. 85, 3502-3512 (2003).</li><li>Tang, H., Wang, C. C., Blankschtein, D., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+role+of+cavitation+in+low-frequency+ultrasound-mediated+transdermal+drug+transport.">An investigation of the role of cavitation in low-frequency ultrasound-mediated transdermal drug transport.</a> Pharm Res. 19 (8), 1160-1169 (2002).</li><li>Ueda, H., Mutoh, M., Seki, T., Kobayashi, D., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+cavitation+as+an+enhancing+mechanism+of+low-frequency+sonophoresis+for+transdermal+drug+delivery.">Acoustic cavitation as an enhancing mechanism of low-frequency sonophoresis for transdermal drug delivery.</a> Biol Pharm Bull. 32 (5), 916-920 (2009).</li><li>Trendowski, M., Yu, G., Wong, Y., Aquafondata, C., Christen, T., Fondy, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+real+deal:+Using+cytochalasin+B+in+sonodynamic+therapy+to+preferentially+damage+leukemia+cells.">The real deal: Using cytochalasin B in sonodynamic therapy to preferentially damage leukemia cells.</a> Anticancer Res. 34 (5), 2195-2202 (2014).</li><li>Lagneaux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic+low-energy+treatment:+A+novel+approach+to+induce+apoptosis+in+human+leukemic+cells.">Ultrasonic low-energy treatment: A novel approach to induce apoptosis in human leukemic cells.</a> Exp Hematol. 30 (11), 1293-1301 (2002).</li><li>Krasovitskia, B., Frenkelb, V., Shohama, S., Kimmel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramembrane+cavitation+as+a+unifying+mechanism+for+ultrasound-induced+bioeffects.">Intramembrane cavitation as a unifying mechanism for ultrasound-induced bioeffects.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (8), 3258-3263 (2011).</li><li>Sundaram, J., Mellein, B. R., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+and+theoretical+analysis+of+ultrasound-induced+permeabilization+of+cell+membranes.">An experimental and theoretical analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes.</a> Biophys J. 84 (5), 3087-3101 (2003).</li><li>Mizrahi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+intensity+ultrasound+perturbs+cytoskeleton+dynamics.">Low intensity ultrasound perturbs cytoskeleton dynamics.</a> Soft Matter. 8 (8), 2438-2443 (2012).</li><li>Chen, X., Leow, R. S., Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-site+sonoporation+disrupts+actin+cytoskeleton+organization.">Single-site sonoporation disrupts actin cytoskeleton organization.</a> J R Soc Interface. 11 (95), 20140071 (2014).</li><li>Trendowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+enlargement+of+leukemia+cells+using+cytoskeletal-directed+agents+and+cell+cycle+growth+control+parameters+to+induce+sensitivity+to+low+frequency+ultrasound.">Preferential enlargement of leukemia cells using cytoskeletal-directed agents and cell cycle growth control parameters to induce sensitivity to low frequency ultrasound.</a> Cancer Lett. In press, (2015).</li><li>Dumontet, C., Sikic, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+of+and+resistance+to+antitubulin+agents:+Microtubule+dynamics,+drug+transport,+and+cell+death.">Mechanisms of action of and resistance to antitubulin agents: Microtubule dynamics, drug transport, and cell death.</a> J Clin Oncol. 17 (3), 1061-1070 (1999).</li><li>Verrills, N. M., Kavallaris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+targeting+of+tubulin-binding+agents:+lessons+from+drug+resistance+studies.">Improving the targeting of tubulin-binding agents: lessons from drug resistance studies.</a> Curr Pharm Des. 11 (13), 1719-1733 (2005).</li><li>Trendowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inherent+metastasis+of+leukaemia+and+its+exploitation+by+sonodynamic+therapy.">The inherent metastasis of leukaemia and its exploitation by sonodynamic therapy.</a> Crit Rev Oncol Hematol. In press, (2014).</li><li>Trendowski, M., Wong, V., Wellington, K., Hatfield, S., Fondy, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerated+doses+in+zebrafish+of+cytochalasins+and+jasplakinolide+for+comparison+with+tolerated+doses+in+mice+in+the+evaluation+of+pre-clinical+activity+of+microfilament-directed+agents+in+tumor+model+systems+in+vivo.">Tolerated doses in zebrafish of cytochalasins and jasplakinolide for comparison with tolerated doses in mice in the evaluation of pre-clinical activity of microfilament-directed agents in tumor model systems in vivo.</a> In Vivo. 28 (6), 1021-1031 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

כדי להשיג תוצאות אופטימליות, יש לנקוט זהירות מיוחדת למצב בזהירות את המדגם ולנקות את איחוד ממיר-קרן. המיקום של המדגם בקרן הוא חשוב להשגת הרס תא עקבי, כמו שינוי המרחק מהקרן ישנה את המוקדים אקוסטי, ולכן משנה את אנרגיית המדגם חשופה ל. האנרגיה אקוסטית בתוך קרן הכוס יכולה להיות ממופה באמצעות מד cavitation כדי למצוא את המיקום של cavitation המרבי. בנוסף, מטר cavitation, יחד עם אוסצילוסקופ הוא חיוניים לקביעת עוצמת צליל התאים נחשפים ל, כמו גם את ההומוגניות של צורת הגל. לכן, יש להשתמש במכשירים אלה כדי לזהות בעיות במערכת, ולעזור לקבוע מה עשוי להיות נחוצים לפתרון בעיות כדי לתקן חוסר יציבות של מערכת. כאמור, מערכת התדירות הנמוכה עשויה לפעול לדגה נוספת המים לאורך כל הניסוי אם לא לרוץ לכמה דקות לפני לטעום sonication. זה ראשוני ריצה יש לבצע להניב בינוני יחסית degassed sonication ותוצאות וכך עולות בקנה אחד במהלך ניסויים. בנוסף, לא צריכים להיות sonicated תאים ליד או משרעת המרבי כאשר להערכת היעילות של sonosensitizers, כמידה נכונה של רגישות תהיה קשה להעריך. שימוש במשרעת של 33% על מערכת קילוהרץ 40 היא הגדרה אידיאלית, כפי שהיא מייצרת נזק בולט, אבל מספק מספיק מקום sonosensitizers להפגין יעילותם, כפי שהודגם בMeβCD נגד U937 ותאי THP1 (איור 7). נתונים אלה גם לאשר שMeβCD sensitizes קווי לוקמיה מרובים לאולטרסאונד בתדר הנמוך באופן תלוי מינון. יש כבר מספר הניסויים שנעשו בתדירות גבוהה יותר בטווח של 0.75 MHz עד 8 ​​מגה-הרץ מציג ראיות של בועות cavitation intramembrane שנוצר באמצעות sonication 17-19. עם זאת, questioNS עדיין יישאר בכל הקשור למנגנון של תמוגה תא מושרה אולטרסאונד 18 המדויק. הראינו קשר בין fluidizing שלד התא והגדיל את רגישות קולית באמצעות אולטרסאונד הנמוך תדר 15, תופעה שהפגינה מעבדות אחרות 20, 21. בנוסף, מצאנו כי סוכני שיבוש-microfilament כגון cytochalasin B להגביר רגישות קולית בלוקמיה מרובה קווים, אך לא hHSCs או כדוריות דם לבנות 22, המצביע על עיכוב של פילמור אקטין עשויה להיות מנגנון sonosensitizing עניין מיוחד. ראינו גם שvincristine, סוכן שיבוש-microtubule שמעכב פילמור טובולין 23, 24, במידה ניכרת מגבירה את הרגישות קולית סוגים שונים של סרטן דם במבחנה כוללים לוקמיה חריפה מיאלואידית, לוקמיה מיאלואידית הכרונית, ולוקמיה החריפה הלימפה. לעומת זאת, סוכנים מכוונים cytoskeletal שלייצב רכיבי cytoskeletal (paclitaxeljasplakinolide ד) מופיע כדי להפוך לתאים עמידים לsonication, באו לידי ביטוי בשיעורים נמוכים יותר של תא תמוגה 22. יחדיו, נתונים אלה תומכים בהשערה כי fluidizing רכיבי cytoskeletal של תאי neoplastic היא אכן גורם חשוב בהגדלת היעילות של SDT 25. המחקר הנוכחי מוכיח כי גם דלדול כולסטרול עשוי להיות שיטה אחרת שבו להגברה נוספת הרגישות קולית של תאי neoplastic, כמו תאי U937 טופל MeβCD במידה ניכרת רגישים עד 40 קילוהרץ אולטרסאונד. בעוד פרוטוקולי sonication שלנו הוכיחו פעילות antineoplastic מסומנת במבחנה, המתודולוגיה הנוכחית מוגבלת לעבודה במודלי תרבות וחוליות קטנות שיכולים להתאים בבקבוקונים המשמשים לsonication. הראינו דג הזברה שניתן sonicated בבטחה באמצעות אולטרסאונד פעמו תדירות נמוכה (20 קילו-הרץ), ושהסובלנות שלהם לתרופות כימותרפיות היא כמותית דומה למינונים נסבלים על ידי מודלים עכברי 26, המצביעים על כך דג הזברה גידול נושאות ניתן להשתמש בחקירות מקדימות כדי להעריך את פעילות antineoplastic vivo של פרוטוקולים אלה. עם זאת, מתן תרופות כימותרפיות לפני sonication של דגמי יונקים דווח בטווח MHz 1, ויכולים להניח יוארכו פרוטוקולים כגון לשלב אולטרסאונד נמוך תדר, כמו גם כולסטרול-מרוקן וסוכנים מכוונים cytoskeletal. יישומים קליניים אפשריים של צורה זו של SDT עשויים להיות כרוכים sonication דם extracorporeal בי סוכני antineoplastic מנוהלים דרך הווריד (IV) לפני הוצאתו לדם sonication 25. שיטה זו מסירה מחסומי קול פוטנציאליים שמציבים האנטומיה אנושית, ועשויה להיות דרך יעילה לניזק תקיעות leukemic, כמו גם גרורות מגידולים מוצקים. ייתכן גם שיכלו כולסטרול-מרוקן וסוכנים מכוונים cytoskeletalניתן להשתמש בפרוטוקולי HIFU שכבר נבחנו במרפאת בניסיון לשפר את היעילות של שיטת טיפול זו. השיטות שתוארו במחקר הנוכחי הן מסוגלים להעריך את הערך של sonosensitizers הפוטנציאלי, ועידון מערכת נוסף עשויים לשפר את השירות הזה. עם זאת, יש הרבה משתנה שיש להתחשב בעת שימוש ממציא קולי כגון, כולל איכות אספקת חשמל, מוקדי אקוסטי, ווריאציה בודדת בין ממירים. לכן, מחקר עתידי יתמקד בלדמיין את הגלים על-קוליים והבנה השפעתם על תוצאות. SDT הוכיח כדי לשפר את תמוגה תא במבחנה ועשוי להיות בר-קיימא מבחינה קלינית, אם יותר בנתונים vivo במודלים של יונקים נרכשים. ניסויים בוחנים מאפיינים אחרים ניתן לנצלם של תאים ממאירים, וכן דרכים משולבות שונים מעורבים סוכנים ואולטרסאונד מרובים להמשיך במעבדה שלנו.

אולטראסאונד מתייחס לכל גל לחץ קול נדנוד בתדירות גבוהה יותר מהגבול העליון של יכולות שמיעה אנושיות (~ 20 קילו-הרץ) 1. אולטרסאונד בתדר נמוך בטווח 20-60 קילוהרץ נוצל במעבדה כאמצעי ליצירת תחליבים, הכנת דגימות סלולריות להפקת חומצות גרעין, לשיבוש רקמות, ועבור מגוון רחב של בדיקות אחרות. השירות של אולטרסאונד בתדר הנמוך גם הורחב להגדרה התעשייתית לריתוך, חומרי ניקוי שונים, ובטיפול בחומרים. מסחרי גנרטורים אולטרסאונד זמינים לבוא בתדרים הנעים 18-60 קילוהרץ, ובקנה מידה מלא wattages מ100-1,200 W. למרות אולטרסאונד משמש כבר זמן רב בהגדרה הקלינית להדמיה לאבחון, זה כבר מיושם ככלים טיפוליים רק לאחרונה. אולטראסאונד ≥1 MHz מסוגל לשבש calculi שתן (אבנים בכליות) וcalculi מרה בשלום (אבנים בהכיס מרה דואר או בכבד) בחולים כדי להפחית סימפטומים 2,3. גישה זו ידועה כריסוק Shockwave extracorporeal (ESWL) עכשיו מיושמת באופן נרחב במרפאת (מטופלים חולים יותר ממיליון בשנה עם ESWL בארצות הברית לבדה 4), ומציעה שיטה שבי להלא פולשני לשבור את calculi עם ניזק סביבתי מינימאלי באמצעות פולסים אקוסטי לשימוש חיצוני בעוצמה גבוהה, ממוקדת, 2-4. בשל הכוחות הייחודיים הישירים הגז, כמו גם בועות cavitation שנוצרו על ידי אולטרסאונד בעוצמה גבוה, מתודולוגיות אלה נבדקו בטיפול בסרטן לטיפול בסרטן הערמונית עמיד לסירוס ואדנוקרצינומה של לבלב בגישה הידועה כממוקדים בעוצמה גבוהה אולטרסאונד (HIFU ) 5-8. באופן דומה מאוד לESWL, HIFU משתמש קורות אולטרסאונד מרובים ומתמקד באזור מוקדי שנבחר כדי ליצור טמפרטורות של 60 מעלות צלזיוס או HIGשלה באמצעות השימוש באנרגיה האקוסטית, גרימת נמק מִתקַרֵשׁ ברקמות הממוקדות 5. למרות ששיטות אחרות של אבלציה תרמית קיימות כיום (אבלציה בתדר רדיו ואבלציה מיקרוגל), HIFU מציע יתרון ברור על פני שיטות אלה בכך שהוא השיטה hyperthermic לא פולשנית רק 5. HIFU השיג תוצאות מעורבות במרפאת וזמינה כרגע רק בניסויים קליניים 8-11. עם זאת, ההצלחה המוגבלת שהשיג, ומבטיח מאוד בנתונים vivo נרכשו מדגמי יונקים פרה-קליניים הדגימו את הפוטנציאל של אולטרסאונד בטיפול בסרטן. במאמץ לשפר את HIFU, חוקרים ניסו לשלב אולטרסאונד עם סוכני antineoplastic מתאימים כדי ליצור צורה של sonochemotherapy. טיפול Sonodynamic (SDT) הוא שיטת טיפול חדשנית מבטיחה שהוכיחה פעילות antineoplastic מרשימה בהיא במבחנה <em&gt; מחקרי in vivo 1. הוכח אולטרסאונד שמעדיף נזקי תאים ממאירים המבוססים על ההפרש בין גודל תאים כאלה ואלה של היסטולוגיה הרגילה 1,5. SDT משלב סוכנים מיוחדים הידועים כsonosensitizers להגדיל את היקף הנזק מועדף המופעל על ידי אולטרסאונד נגד תאי neoplastic. בעוד יישומים טיפוליים של SDT כבר נבדקו בעבר, מערכות אולטרא סאונד משמשות בדרך כלל להעסיק אולטרסאונד הגבוה תדר (≥1 MHz), ואת ההשפעות של אולטרסאונד בתדר kHz הנמוך טרם נחקרו באופן מלא. תדרים נמוכים של אולטרסאונד לעתים קרובות יותר בקיאים בהפקת cavitation אינרציה, תופעה שגורמת להרס של תאים עקב מתכווצת המהיר של microbubbles, גרימת נזק physicochemical 12-14. הבדל בדור של cavitation אינרציה בין MHz ואולטרסאונד kHz הנמוך זו יוחס לעובדה שתדרי גל נמוכים יאפשר microbubbleזה יותר זמן לגדול על ידי דיפוזיה לתקן במחצית הרחבת המעגל, וכתוצאה מכך הייצור מתמוטט אלים יותר במחצית המחזור 12 הדחיסה הבאה. הראינו בעבר כי תאי monocytic אדם U937 לוקמיה רגישים לאולטרסאונד הנמוך תדר (23.5 kHz), ושרגישות זו יכולה להיות מוגברת במידה ניכרת באמצעות היישום של סוכני antineoplastic שלטרוד את שלד התא 15. יתר על כן, יש לנו הראינו שתאים באופן מועדף ניזק שמבוססים על גודל, עם תאים גדולים יותר מציגים רגישות קולית גבוהה יותר. בנוסף, תאים נורמלים אדם hematopoietic גזע (hHSCs) וכדוריות דם לבנות בגדלי תא דומים הרבה יותר עמידים לsonication מאשר עמיתיהם neoplastic 15, בהיסוס טוענים כי אולטרסאונד בתדר הנמוך ניתן להשתמש כדי לפגוע באופן מועדף תאים ממאירים בנוכחות של רקמה נורמלית. כדי לבחון את האבזר הייחודי נוסףerties של אולטרסאונד בתדר הנמוך לשימוש טיפולי פוטנציאלי, פיתחנו תהליכי ניקוי וייצוב כדי להגדיל את היעילות ואמינה של אחת ממערכות sonication הנוכחיות שלנו, W ברנסון דגם SLPe 150, המשבש סלולארי 40 קילוהרץ, מצויד בצופר 20 מ&quot;מ מצויד לתוך כוס 7.62 סנטימטר. בנוסף, יש לנו כבר הצליח לקבוע אנרגיות מדויקות cavitation המדגם, כמו גם גל עקבי ומשרעת בטווח של 40 קילוהרץ באמצעות מד cavitation ואוסצילוסקופ עם hydrophone. על ידי זיקוק ושיטתי הפרוטוקולים שלנו, יש לנו כבר הצליח להקים עקביות בsonications הניסוי שלנו, ומאפשר לנו להשוות כמותית הרגישויות קולית של תאי אנטינאופלסטיים ונורמלים של שושלות שונות histogenetic. הפרוטוקול שלנו למערכת 40 קילוהרץ מוצג בפירוט רב על מנת למעבדות מעוניינות להיות מסוגל לבצע ניסויים דומים, וכדי להעריך את הממצאים של השפעות antineoplastic שהושרו על ידיאולטרסאונד בתדר נמוך. בנוסף, אנו בוחנים את ההשפעות תלויות מינון של מתיל-β-cyclodextrin (MeβCD; איור 1), סוכן מדלל את כולסטרול, על הגדלת הרגישות קולית של U937 וTHP1 תאים לוקמיה monocytic אנושיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium w/ NaHCO3 &#38; 25mM Hepes&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B Solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100x Solution&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3&#34; (25mm) Cuphorn</td>
			<td>Branson Ultrasonics</td>
			<td>101-063-726</td>
			<td>sonication device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater</td>
			<td>Brisk Heat</td>
			<td>SDCJF1A-GBH1000-1</td>
			<td>heater used for temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp&#174; Software</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>6605700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 50mg/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL &#38; 25mL Vented Culture Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-605C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>&#160;A35473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuJet Pro Auto Pipet&#160;</td>
			<td>BrandTech Scientific</td>
			<td>26330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1840, 1126-7810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100uL Micropipette&#160;</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>851164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000uL Micropipette</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>851168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Dual Chamber Counting Slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tektronix&#160; DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>DPO2002B</td>
			<td>used to measure the ultrasonic waveform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter</td>
			<td>PPB Megasonics</td>
			<td>PB-500&#160;</td>
			<td>used to assess the sound intensity in W/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone</td>
			<td>Teledyne</td>
			<td>TC4013-1&#160;</td>
			<td>connects to the oscilloscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton 250mL Flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z364827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mL Glass Scintillation Vials&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z190527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>diluent for Z2 counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof Anhydrous&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XTT Cell Proliferation Assay Kit</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-1011K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Microplate Reader</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>&#160;EW-13055-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U937 Human Monocytic Leukemia Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL&#173;1593.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP1 Human Monocytic Leukemia Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and quantitative analysis of pulsed low frequency ultrasound to determine the sonic sensitivity of untreated and treated neoplastic cells

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.

יציבות מערכת היא בעל חשיבות עליונה בהשגת תוצאות הדיר ואמינות. מפרט המומנט הנכון של 54.23 N. מ &#39;השיג צימוד נאות של המתמר וsonotrode 2, עם העקביות של הגל שהוערכה באמצעות שימוש ב( איור 3 א) אוסצילוסקופ וhydrophone. איור 3 מתאר מדידות בתוך בקבוקון המדגם, ו איור 3 ג מעריך יציבות בקרן הכוס. כצפוי, משרעת היה מעט מופחת בשל כמה אנרגיה להיקלט על ידי הזכוכית. עם זאת, צורת הגל לא הייתי מוטרד או מעוותת בכל לוח ב &#39;או ג&#39;, אשר הוא הכרחי עבור אספקה ​​אמינה של אנרגיה קולית למדגם. צורת גל שאינו מופיע כגל סינוס יחיד ברור מצביעה על מתמר פגום או התקנה לא תקינה. זה בא לידי ביטוי באיור 3D שמראה גלים חריגים מרובים, היעדר ברור של גל סינוס, ותדירות קריאה לאלא צפוי עם מערכת מתפקדת כראוי. מטר cavitation משמש למדידת אנרגיית cavitation שנוצר (איור 4) מצא את עוצמת הקול להיות 100-110 W / 2 סנטימטר במשרעת של 33%, ו125-130 W / 2 סנטימטר במשרעת של 50%. ברגע שמערכת 40 קילוהרץ הייתה כראוי מכוילת והורכבה בשלמותו (איור 5), הרס תא אמין היה בקלות השיג, כפי שנקבע על ידי שני דלפקי TC20 וZ2 (איור 6). כצפוי, נזק לתאים נרחבים יותר נצפו באוכלוסיות תאי sonicated ב 50%, ולא במשרעת של 33%. עם זאת, 33% משרעת שימושי כנקודת פתיחה לזיהוי תופעות רגישות קולית פוטנציאל של סוכנים מנוהלים, כפי שהיא מייצרת נזק ניכר, אבל משאיר מקום ליותר נזק להתגלות כאשר סוכנים מיושמים להעריך הגברתם של רגישות קולית. זו באה לידי ביטוי באיור 7 א, שבוהשפעות תלויות מינון של MeβCD על potentiating הרגישות קולית של תאי U937 מוצגות. למרות שהתאים שטופלו MeβCD אינו sonicated היו דומים מאוד ביכולת קיום לתאים-sonicated עישון, שלא טופלו, הכדאיות ירדה במידה ניכרת לאחר שלושה פולסים של אולטרסאונד kHz 1 שניות 40 יושם. בנוסף, הירידה בכדאיות לאחר sonication נראה היו תלוי מינון, כמו 5 מ&quot;מ MeβCD מיוצר הירידה הגדולה ביותר בספירת תאים, ואחריו 1 מ&quot;מ, ולאחר מכן 0.5 מ&quot;מ MeβCD. השפעות דומות על כדאיות תא ופעילות המיטוכונדריה נצפו בשני תאי U937 וTHP1 שטופלו בריכוזים שונים של MeβCD לפני sonication, כפי שהוערך עם ערכת XTT (איור 7). למרות THP1 תאים נראים מעט יותר קולי עמיד מאשר תאי U937, שני הקווים לוקמיה ניזוק באופן תלוי מינון. ריכוזים גבוהים יותר של MeβCD ויותר פולסים של לדרבן אולטרסאונדuced ההפחתה הנמוכה ביותר של XTT לנגזר מסיס, צבעוני כתום לשני U937 וTHP1 תאים, המתאים להורדת כדאיות תא ופעילות המיטוכונדריה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig1.jpg" /> איור 1. מבנה מולקולרי של β-cyclodextrin methyl-. () מבנה שלם של מתיל-β-cyclodextrin (MeβCD). (ב) MeβCD הוא פולימר של שבע יחידות חוזרות עם קבוצת R של שני H או CH 3. נוסחה מולקולרית: C 56 H 98 O 35. משקל מולקולרי = 1,331.36. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig2.jpg" /> איור 2. torqueing מערכת אולטרסאונד 40 קילוהרץ כראוי. (א) הקרן וממיר יוסרו מן פרי הכוסאו לtorqueing. (ב) מקם את מפתח הברגים חריץ ומפתח מומנט בעמדותיהם. (ג) החל 54.23 N. מ &#39;של מומנט בכיוון השעון לפני reattaching הקרן וממיר לכוס. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig3.jpg" /> איור 3. שימוש באוסצילוסקופ לאפיין את צורת הגל של המערכת קולית. () אוסצילוסקופ עם hydrophone ניתן להשתמש כדי להעריך עקביות משרעת וצורת גל. הקלטה (ב &#39;) שצולמה בכוס ישירות מעל הקרן 1.5 סנטימטר ונקבעה על משרעת של 33%. (ג) צורת הגל בתמונה כאן היא מקריאה רכשה כאשר hydrophone ממוקם בתוך בקבוקון נצנץ זכוכית 20 מיליליטר. הבקבוקון ממוקם ב -1.5 סנטימטרים מעל הקרן וקבע שוב במשרעת של 33%. O מסך אוסצילוסקופ (D)מערכה ה- FA עם תדרים חריגים כפי שניתן היה לצפות עם מערכת פגומה או לא תקין של צימוד איחוד ממיר קרן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig4.jpg" /> שימוש איור 4. מטר cavitation לאפיין את עוצמת הקול של המערכת קולית. מטר cavitation ראה כאן משמש כדי לייצג אנרגיית cavitation בW / 2 סנטימטר. זה מכשיר מאוד חשוב להערכת עקביות של אנרגיה ביחס למדגם. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig5.jpg" /> 5. מרכיבי מפתח איור של מערכת אולטרסאונד 40 קילוהרץ. המערכת קולית מוצגים להשלים עם קרן כוס ( <strong&gt;), מנגנון חימום (ב &#39;), ממיר (C), ומנגנון מיצוב מדגם (ד&#39;). עיצוב זה מאפשר למיצוב קל של המדגם (E) מעל הצופר (F). <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig6.jpg" /> 6. אפקטי איור של רמות שונות של משרעת על תמוגה קולית של תאי U937 באמצעות מוני TC20 וZ2. תאים היו sonicated עם dismembrator 40 קילוהרץ התא במשרעת של 33% (100-110 W / 2 סנטימטר) או משרעת 50% (125-130 W / 2 סנטימטר) באמצעות שלושה 1 פולסים שניות של אולטרסאונד, עם מרווח 1 שניות בין כל פולסים אלה. (א) צילום מסך מהתוכנה דלפק Z2 מדגים את ההשפעה של sonication על תאי U937. (ב) נתונים מדלפק TC20 לוקטו בגרף כדי להדגים את שחזור של התוצאהים. נתונים אלה כוללים את הסעיפים המוחלט ולחיות תא, כמו גם trypan הכחול העריך כדאיות תא. ברים משקפים את סטיית התקן של הממוצע (SEM) במשך 4 אוכלוסיות תאים עצמאיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig7.jpg" /> איור 7. השפעות של β-cyclodextrin methyl- על potentiating הרגישות קולית של U937 וTHP1 תאים. טופלו () תאי U937 עם משתנה ריכוז של MeβCD במשך 30 דקות לפני שsonicated עם אולטרסאונד kHz 40 (105 W / 2 סנטימטר ) באמצעות שלוש 1 פולסים שניות במרווחים 1 שניות זה מזה. אוכלוסיות תאים קובצו ל≥12 מיקרומטר ו≥17 מיקרומטר. תאים שטופלו (ב) U937 או THP1 שוב עם concent שונהמנות של MeβCD במשך 30 דקות לפני שsonicated עם מערכת 40 קילוהרץ באמצעות 1-3 פולסים של אולטרסאונד 1 שניות במרווחים של 1 שניות. כדאיות תא ופעילות המיטוכונדריה הוערכו עם ערכת XTT. של תאים 100 μl היו זרע לכל גם לצלחת microtiter 96-גם שטוח תחתונה. צלחת הודגר למשך 24 שעות לפני התוספת של פתרון XTT. תאים אז הודגרו לשעה 2 נוספת לפני הגל היה לקרוא. ברים משקפים SEM ל4 אוכלוסיות תאים עצמאיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells at JoVE.c

Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells

Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.

דור וניתוח כמותי של תדר נמוך פעמו אולטראסאונד כדי לקבוע את הרגישות של סוניק שלא טופלו ותאים שטופלו neoplastic

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In ...

generation-quantitative-analysis-pulsed-low-frequency-ultrasound-to

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K Views.  Syracuse University. Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells. 

Video: Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

המדידה והטיפול בדיכוי בעין עצלה

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

ניתוח הכמות של Proteomes הכרומטין במחלות

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Fetal Echocardiography and Pulsed-wave Doppler Ultrasound in a Rabbit Model of Intrauterine Growth Restriction

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ultrasound and fetal echocardiography. Increasingly, these imaging modalities are being employed clinically to examine cardiac function and assess wellbeing in utero, thereby guiding timing of birth decisions. Here, we used a rabbit model of IUGR that allows analysis of cardiac function in a clinically relevant way. Using isoflurane induced anesthesia, IUGR is surgically created at gestational age day 25 by performing a laparotomy, exposing the bicornuate uterus and then ligating 40-50% of uteroplacental vessels supplying each gestational sac in a single uterine horn. The other horn in the rabbit bicornuate uterus serves as internal control fetuses. Then, after recovery at gestational age day 30 (full term), the same rabbit undergoes examination of fetal cardiac function. Anesthesia is induced with ketamine and xylazine intramuscularly, then maintained by a continuous intravenous infusion of ketamine and xylazine to minimize iatrogenic effects on fetal cardiac function. A repeat laparotomy is performed to expose each gestational sac and a microultrasound examination (VisualSonics VEVO 2100) of fetal cardiac function is performed. Placental insufficiency is evident by a raised pulsatility index or an absent or reversed end diastolic flow of the umbilical artery Doppler waveform. The ductus venosus and middle cerebral artery Doppler is then examined. Fetal echocardiography is performed by recording B mode, M mode and flow velocity waveforms in lateral and apical views. Offline calculations determine standard M-mode cardiac variables, tricuspid and mitral annular plane systolic excursion, speckle tracking and strain analysis, modified myocardial performance index and vascular flow velocity waveforms of interest. This small animal model of IUGR therefore affords examination of in utero cardiac function that is consistent with current clinical practice and is therefore useful in a translational research setting.

We describe examination of fetal cardiac function with contemporary functional fetal echocardiography and fetoplacental Doppler ultrasound using the VisualSonics VEVO 2100 microultrasound in a surgically induced model of intrauterine fetal growth restriction in a rabbit.

אקו העוברי ואולטראסאונד דופלר פעמו גל בדגם ארנב של הגבלת גדילה תוך רחמית

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ...

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating important information on the pathogenesis of lesion formation and the action of novel therapies. Use of atherosclerosis-prone mice, surgical methods of lesion induction, and dietary modification has dramatically improved understanding of the mechanisms that contribute to disease development and the potential of new treatments.
Classically, analysis of lesions is performed ex vivo using 2-dimensional histological techniques. This article describes application of optical projection tomography (OPT) to 3-dimensional quantitation of arterial lesions. As this technique is non-destructive, it can be used as an adjunct to standard histological and immunohistochemical analyses.
Neointimal lesions were induced by wire-insertion or ligation of the mouse femoral artery whilst atherosclerotic lesions were generated by administration of an atherogenic diet to apoE-deficient mice.
Lesions were examined using OPT imaging of autofluorescent emission followed by complementary histological and immunohistochemical analysis. OPT clearly distinguished lesions from the underlying vascular wall. Lesion size was calculated in 2-dimensional sections using planimetry, enabling calculation of lesion volume and maximal cross-sectional area. Data generated using OPT were consistent with measurements obtained using histology, confirming the accuracy of the technique and its potential as a complement (rather than alternative) to traditional methods of analysis.
This work demonstrates the potential of OPT for imaging atherosclerotic and neointimal lesions. It provides a rapid, much needed ex vivo technique for the routine 3-dimensional quantification of vascular remodelling.

Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.

דור וQuantitation 3 ממדים של עורקי פצעים בעכברים באמצעות טומוגרפיה הקרנה אופטית

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have been developed to facilitate the study of the molecular and cellular pathophysiology of this disease. In this manuscript we describe specific techniques for the quantification and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus and ascending aorta. The advantage of this procedure is that it provides an accurate measurement of the cross-sectional area and total volume of the lesion, which can be used to compare atherosclerotic progression across different treatment groups. This is possible through the use of the valve leaflets as an anatomical landmark, together with careful adjustment of the sectioning angle. We also describe basic staining methods that can be used to begin to characterize atherosclerotic progression. These can be further modified to investigate antigens of specific interest to the researcher. The described techniques are generally applicable to a wide variety of existing and newly created dietary and genetically-induced models of atherogenesis.

We describe procedures to quantify and characterize atherosclerotic lesions in mouse models using precision sectioning of the aortic sinus and ascending aorta combined with histochemical and immunohistochemical analysis.

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive surgical procedures. Although this is an effective method of assessing in vitro diaphragm activity, it involves non-survival surgery. The application of non-invasive ultrasound imaging as an in vivo procedure is beneficial since it not only reduces the number of animals sacrificed, but is also suitable for monitoring disease progression in live mice. Thus, our ultrasound imaging method may likely assist in the development of novel therapies that alleviate muscle injury induced by various respiratory diseases. Particularly, in clinical diagnoses of obstructive lung diseases, ultrasound imaging has the potential to be used in conjunction with other standard tests to detect the early onset of diaphragm muscle fatigue. In the current protocol, we describe how to accurately evaluate diaphragm contractility in a mouse model using a diagnostic ultrasound imaging technique.

Diagnostic ultrasound imaging has proven to be effective in diagnosing various respiratory diseases in human and animal subjects. We demonstrate a comprehensive ultrasound protocol utilized by Dr. Zuo's lab to analyze diaphragm kinetics specifically in mouse models. This is also a non-invasive research technique which can provide quantitative information on mouse respiratory muscle function.

אולטראסאונד הדמיה לאבחון של תפקוד העכבר דיאפרגמה

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

בתדירות גבוהה אולטראסאונד הדמיה של בלוטות לימפה עכבר צוואר הרחם

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...