This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).

הערה: לפני מתן דגימות רוק כל הנושאים נתנו הסכמה מדעת התואמת את הקווים המנחים לטיפול בבני אדם בבית החולים לילדים בפריסה ארצית. .1 רוק איסוף ואחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני אוסף רוק, להבטיח כי הפה של הנושא הוא ללא מזון או חומרים זרים אחרים על ידי בעל העניין לשטוף את פיהם במים והימנעות אכילה או שתייה במשך 30 דקות לפני איסוף הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל עם 2.5 מ&quot;ל של חיץ ייצוב DNA 2 והקפד להימנע מלגעת בחלק הפנימי של הכובע או צינור, ויש לי את הנושא לירוק 2.5 מ&quot;ל של רוק לפתרון החיץ. שים לב: איסוף יותר מ 2.5 מ&quot;ל של רוק יכול להוביל להשפלת מדגם מיחס מספק של מדגם לחיץ ייצוב DNA. איסוף רוק מעט מדי יפחית תשואות הצפויות מהפרוטוקול. כדי להעריך את היקפי גבייה, להשתמש במעברי הצבע הממוספרים בצד של tהוא הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף כובע ומערבבים על ידי היפוך עד לקבלת התערובת הומוגני. טלטול נמרץ הוא לא הכרחי. אחסן את הדגימות ב RT עבור אחסון לטווח קצר או 4 ° C לאחסון לטווח ארוך (&gt; 3 חודשים). </li></ol> 2 הכנות ראשוניות ותמוגה תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת ההפקה, לחמם אמבט מים ל37 מעלות צלזיוס, ולהכין דלי קרח. שלושה 15 צינורות מ&quot;ל צנטריפוגות חרוטי יהיה צורך עבור כל דגימה שחולצה. שלושה צינורות ישמשו כדי להחזיק את התא גלולה וחלבון, gDNA חילוץ הסופי, וsupernatants isopropanol ואתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג דוגמאות קרקע מאחסון, ודגימות הפכו כמה פעמים ואז מערבולת במהירות בינונית במשך 15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 2.5 מ&quot;ל של מדגם לתוך צינור צנטריפוגות נקי 15 מ&quot;ל, ולהוסיף 5 מ&quot;ל של תא תמוגה פתרון. מערבבים את המדגם 50 פעמים על ידי היפוך, ולדגור על RT למשך 30 דקות. </li></ol> הסרת .3 RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של RNase סולution ב100 מ&quot;ג / מ&quot;ל, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדגם מאמבט המים 37 מעלות צלזיוס ומגניבה על קרח למשך 3 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה RNase, להעלות את הטמפרטורה של המים באמבטיה ל65 מעלות צלזיוס למשך הצעד להחזרת נוזלי DNA של הפרוטוקול. </li></ol></li></ol> .4 חלבון והסרת שומנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של proteinase K פתרון ב20 מ&quot;ג / מ&quot;ל, לערבב כמה פעמים על ידי היפוך, ולדגור על RT למשך תקופה מינימאלית של 30 דקות. הערה: זוהי נקודת השהיה אפשרית לפרוטוקול. לאחר התוספת של proteinase K הפתרון, המדגם יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד ליכול להסתיים החילוץ. האחסון בC ° 4 עד 24 שעה לא הוצג להיות השפעה משמעותית על תשואות מיצוי או איכות DNA. אחסון לטווח ארוך, בשלב זה לא נבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1.7 מ&quot;ל של פתרון משקעים חלבון, מערבולת במרץ ל20 שניות במהירות גבוהה, ומניחים על קרח עבור 10 דקות. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהדגימות התקררו על קרח עבור 10 דקות, צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 3,000 XG ו4 מעלות צלזיוס. החלבונים זירז חייבים ליצור גלולה חזקה להמשיך. אם גלולה היא לא חזקה או הפתרון הוא עדיין מעונן, יכולות להיות מקוררות על דגימות קרח למשך 5 דקות נוספות וצנטריפוגה חוזרת ונשנית. הדגימות חייבות להיות כל הזמן על קרח כדי להבטיח גלולה הדוקה. </li></ol> .5 בידוד וטיהור של gDNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתוך צינור צנטריפוגות נקי 15 מ&quot;ל, pipet 5 מ&quot;ל של אלכוהול איזופרופיל ו8 μl של טהור גליקוגן פתרון ב20 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את supernatant המכיל gDNA משלב 4.3 לתוך הצינור המכיל האלכוהול איזופרופיל וגליקוגן פתרון, והותיר אחריו את כדור החלבון זירז. ברגע שsupernatant נוסף, לערבב בעדינות המדגם 50 פעמים על ידי היפוך וצנטריפוגות במשך 30 דקות ב 3,000 XG ו4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את supernatant לאט לתוך צינור 15 מ&quot;ל נקי. לאחר הסרת supernatant, להוסיף 1 מ&quot;ל של אתנול 70% ללשטוף את הכדור על ידי נדנדה לאט ובעדינות נעו אתנול על גלולה זירז כמה פעמים. שמור אתנול בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה הראשונית, צנטריפוגות המדגם 1 דקות ב2,000 XG ו20 מעלות צלזיוס. ניתן לעשות צעד צנטריפוגה זה ברמת 4 מעלות צלזיוס או 20 מעלות צלזיוס. אין השפעה משמעותית של טמפרטורה הוכחה בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , בעקבות לשטוף וצנטריפוגה הראשוניות של גלולה לשפוך לאט לשטוף אתנול מהצינור וזורקים, ולאחר מכן לבצע לשטוף את השני על ידי חזרה על שלבי 5.3 ו5.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת supernatant מלשטוף את השני, לאפשר את גלולה לייבוש באוויר במשך 15 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המדגם לא התייבש לחלוטין, אוויר יבש לעוד דקות 15. </li></ol></li></ol> .6 Rehydration של gDNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדגם התייבש, להוסיף 300 μl של טריס-EDTA לרעננות גלולה gDNA המיובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת המדגם במשך 5 שניות במהירות בינונית ומניחים באמבט מים חמים 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הדגימות מאמבט המים ודגירת O / N ב RT. הערה: כל מוצרים וחומרים כימיים המשמשים מפורטים בלוח חומרים, כמו גם לוח 4. </li></ol>

<ol><li>Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saliva+as+a+source+of+human+DNA+for+population+and+association+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies.</a> Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).</li>
<li>Min, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mircosatellite+and+SNP+genotyping+success+rates+established+in+a+large+number+of+genomic+DNA+samples+extracted+from+mouth+swabs+and+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Twin+Research+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes.</a> Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).</li>
<li>Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+rates+and+fear+of+phlebotomy+in+pediatric+patients+in+a+genetic+study+of+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy.</a> Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).</li>
<li>Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+saliva+by+mail+for+genetic+and+cotinine+analyses+in+participants+recruited+through+the+internet%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet.</a> European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).</li>
<li>Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+blood%2C+saliva%2C+and+buccal+cell+samples+in+a+pilot+study+on+the+danish+nurse+cohort%3A+Comparison+of+the+response+rate+and+quality+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).</li>
<li>Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva%3A+A+convenient+source+of+DNA+for+analysis+of+bi-allelic+polymorphisms+of+fc%CE%B3+receptor+iia+%28cd32%29+and+fc%CE%B3+receptor+iiib+%28cd16%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16).</a> Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).</li>
<li>Dawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates%2C+from+salivary+analyses%2C+of+the+turnover+time+of+oral+mucosal+epithelium+in+humans+and+the+number+of+bacteria+in+an+edentulous+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth.</a> Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).</li>
<li>Bahlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva-derived+DNA+performs+well+in+large-scale%2C+high-density+single-nucleotide+polymorphism+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+performance+between+saliva+and+blood-derived+genomic+dnas+on+the+dmet+array%3A+A+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison.</a> PLoS ONE. 7 (3), e33968(2012).</li>
<li>Simmons, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+genotype-phenotype+model+determinism%3A+Application+to+bivariate+reading%2Flanguage+traits+and+epistatic+interactions+in+language-impaired+families%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Heredity%22%5BJournal%5D)">Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families.</a> Human Heredity. 70, 232-244 (2010).</li>
<li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+precipitation+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">Ethanol precipitation of DNA.</a> Focus. 7, 1-2 (1985).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+Transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li>
<li>DePristo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+variation+discovery+and+genotyping+using+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data.</a> Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

ההליך הנוכחי הוא פרוטוקול מיצוי DNA מותאם שהשתפר במידה ניכרת תשואה של DNA משקל המולקולרי הגבוה בהשוואה לשיטות סטנדרטית, מבלי להתפשר על איכות DNA. השלב הקריטי עם ההשפעה הגדולה ביותר על התשואה ביותר היה צעד 5.2, הכולל צעד צנטריפוגה כבר במהלך משקעים אתנול מכל פרוטוקול שפורסם ...

קבלת DNA באיכות גבוהה עבור מחקרים גנטיים אנושיים היא חיונית בתהליך גילוי גנים למחלות. דם, אם כי דורש הליך פולשני וגם להיות יקר יותר מאשר אוסף רוק, הוא מועדף ליצירת שורות תאים הונצחו כמקור אינסופי של DNA, או iPSCs ללימודים פונקציונליים, ולפעמים DNA הדם משמש בעת שורות תאים אינן זמינות. עם זאת, קבלת דם דורשת phlebotomist מאומן ויש לו דם מחצית חיים קצרים יותר מאשר רוק 1. DNA מרוק הוא פחות יקר וקל יותר להשגה, שכן הוא יכול להיות שנאסף ונשלח באמצעות הדואר ללא הצורך בphlebotomist, ובכך להגדיל בריכות נושא הפוטנציאל הרבה מעבר לאגן ההיקוות של בתי חולים ומעבדות 2. הרשמה למחקר ניתן לשפר את האיכות יש לי נושאים האפשרות של מתן דגימת רוק במקום דם 3, 4. חששות לגבי הכמות והאיכות של DNA מרוק יכולים להיות המוגבלים הנרחבדואר למרות מחקרים שנעשה לאחרונה מחקרים רבים המראים את התאמתו של כל רוק, עם ממוצע של 4.3 x 10 5 תאים למיליליטר, לבדיקות DNA על פני שיטות מטליות buccal המבוגרות שלא לקבל כמויות משמעותיות של רוק 2, 3, 4, 5, 6. בעוד ספרות צנועה קיימת מראה את ההתאמה של DNA רוק השלם נגזר עבור יישומי גנוטיפ כולל שיטות המבוסס על microarray 8, 9, רצף 10, אין מחקרים בחנו הדור הבא (NGS). המטרה לייעול פרוטוקול חילוץ זה כל DNA הרוק הייתה למקסם את הכמות ואיכות עבור יישומי גנטיקה בדרך יעילה עלות שמיושמת בקלות במעבדות עם חומרים כימיים וחומרים נפוצים. מיצוי DNA מרוק דורש מספר הליכים: 1) איסוף ואחסון, טיפול RNase 2) תמוגה תא, 3), 4) ממטרים חלבון, 5) משקעים אתנול, 6) להחזרת נוזלי DNA. פתרון DNA ייצוב הצפת, שתוארבעבר 2, פונקציות כראוי ללא שינוי. שום ניסיון לייעל את טיפול RNase וצעדים להחזרת נוזלי DNA נעשה. לכל שלב שנותר, מספר משתנה שיכול להשפיע על תשואה זוהו. כל אחד ממשתנים היו מניפולציות באופן אישי ושיפור בתפוקה ואיכות הוערך סטטיסטי. עבור משתנים שהוצגו כדי לשפר את התשואה ו / או איכות DNA, הערכים אופטימליים נכללו בפרוטוקול הסופי.

<table><tbody><tr><td>15 ml Centrifuge Tubes</td><td>Fisher</td><td>12-565-268</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lysis Solution</td><td>Qiagen</td><td>158908</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Protein Precipitation Solution</td><td>Qiagen</td><td>158912</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>EZ-BioResearch</td><td>S1003</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher</td><td>04-355-305</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td>Fisher</td><td>BP2473-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>AC194090010</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M) Solution</td><td>Fisher</td><td>03-500-506</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Fisher</td><td>BP166-100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Analog Vortex Mixer</td><td>Fisher</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010</td><td></td></tr></tbody></table>

collection and extraction of saliva dna for next generation sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

כדי לקבוע פרמטרים אופטימליים להפקה DNA סדרה של עקירות DNA מזווגות בוצעה. דגימת רוק אחת פוצלה וכל מנה שנבדקה עם אחד משני ערכים אפשריים עבור משתנה נתון. לפחות שמונה חזרות של כל בדיקה לזווג בוצעו (למשל, דגימת רוק אחת הייתה aliquoted לבדוק חילוץ עם או בלי הדגירה C ° 50 ראשונית)....

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing at JoVE.com

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

collection-and-extraction-of-saliva-dna-for-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Medicine

39.2K Views.  The Research Institute at Nationwide Children's Hospital. DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

Video: Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Metagenomic ניתוח של תחמיץ

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Genetics

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

בחירת גודל האוטומטי ג&#39;ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Environment

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic fragments. Organellar genomes also exist in admixtures within a given cell or tissue type (heteroplasmy), and an abundance of subtypes may change throughout development or when under stress (sub-stoichiometric shifting). Next-generation sequencing (NGS) technologies are required to obtain deeper understanding of organellar genome structure and function. Traditional sequencing studies use several methods to obtain organellar DNA: (1) If a large amount of starting tissue is used, it is homogenized and subjected to differential centrifugation and/or gradient purification. (2) If a smaller amount of tissue is used (i.e., if seeds, material, or space is limited), the same process is performed as in (1), followed by whole-genome amplification to obtain sufficient DNA. (3) Bioinformatics analysis can be used to sequence the total genomic DNA and to parse out organellar reads. All these methods have inherent challenges and tradeoffs. In (1), it may be difficult to obtain such a large amount of starting tissue; in (2), whole-genome amplification could introduce a sequencing bias; and in (3), homology between nuclear and organellar genomes could interfere with assembly and analysis. In plants with large nuclear genomes, it is advantageous to enrich for organellar DNA to reduce sequencing costs and sequence complexity for bioinformatics analyses. Here, we compare a traditional differential centrifugation method with a fourth method, an adapted CpG-methyl pulldown approach, to separate the total genomic DNA into nuclear and organellar fractions. Both methods yield sufficient DNA for NGS, DNA that is highly enriched for organellar sequences, albeit at different ratios in mitochondria and chloroplasts. We present the optimization of these methods for wheat leaf tissue and discuss major advantages and disadvantages of each approach in the context of sample input, protocol ease, and downstream application.

The comparison and optimization of two plant organellar DNA enrichment methods are presented: traditional differential centrifugation and fractionation of the total gDNA based on methylation status. We assess the resulting DNA quantity and quality, demonstrate performance in short-read next-generation sequencing, and discuss the potential for use in long-read single-molecule sequencing.

מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Sampling Human Indigenous Saliva Peptidome Using a Lollipop-Like Ultrafiltration Probe: Simplify and Enhance Peptide Detection for Clinical Mass Spectrometry

Although human saliva proteome and peptidome have been revealed 1-2 they were majorly identified from tryptic digests of saliva proteins. Identification of indigenous peptidome of human saliva without prior digestion with exogenous enzymes becomes imperative, since native peptides in human saliva provide potential values for diagnosing disease, predicting disease progression, and monitoring therapeutic efficacy. Appropriate sampling is a critical step for enhancement of identification of human indigenous saliva peptidome. Traditional methods of sampling human saliva involving centrifugation to remove debris 3-4 may be too time-consuming to be applicable for clinical use. Furthermore, debris removal by centrifugation may be unable to clean most of the infected pathogens and remove the high abundance proteins that often hinder the identification of low abundance peptidome.
Conventional proteomic approaches that primarily utilize two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) gels in conjugation with in-gel digestion are capable of identifying many saliva proteins 5-6. However, this approach is generally not sufficiently sensitive to detect low abundance peptides/proteins. Liquid chromatography-Mass spectrometry (LC-MS) based proteomics is an alternative that can identify proteins without prior 2-DE separation. Although this approach provides higher sensitivity, it generally needs prior sample pre-fractionation 7 and pre-digestion with trypsin, which makes it difficult for clinical use. 
To circumvent the hindrance in mass spectrometry due to sample preparation, we have developed a technique called capillary ultrafiltration (CUF) probes 8-11. Data from our laboratory demonstrated that the CUF probes are capable of capturing proteins in vivo from various microenvironments in animals in a dynamic and minimally invasive manner 8-11. No centrifugation is needed since a negative pressure is created by simply syringe withdrawing during sample collection. The CUF probes combined with LC-MS have successfully identified tryptic-digested proteins 8-11. In this study, we upgraded the ultrafiltration sampling technique by creating a lollipop-like ultrafiltration (LLUF) probe that can easily fit in the human oral cavity. The direct analysis by LC-MS without trypsin digestion showed that human saliva indigenously contains many peptide fragments derived from various proteins. Sampling saliva with LLUF probes avoided centrifugation but effectively removed many larger and high abundance proteins. Our mass spectrometric results illustrated that many low abundance peptides became detectable after filtering out larger proteins with LLUF probes. Detection of low abundance saliva peptides was independent of multiple-step sample separation with chromatography. For clinical application, the LLUF probes incorporated with LC-MS could potentially be used in the future to monitor disease progression from saliva.

Considering saliva sampling for future clinical application, a lollipop-like ultrafiltration (LLUF) probe was fabricated to fit in the human oral cavity. Direct analysis of undigested saliva by NanoLC-LTQ mass spectrometry demonstrated the ability of LLUF probes to remove large proteins and high abundance proteins, and make low-abundant peptides more detectable.

רוק הדגימה האדם Peptidome ילידים באמצעות בדיקה Lollipop-Like Ultrafiltration: פשט ולשפר גילוי פפטיד של ספקטרומטריית מסה קלינית

Although human saliva proteome and peptidome have been revealed 1-2 they were majorly identified from tryptic digests of saliva proteins. Identification ...

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a reliable and robust method for genotyping individuals by Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) analysis in the context of undergraduate laboratory classes. The human D1S80 VNTR locus is used in this protocol as a highly polymorphic marker based on variation in the number of repetitive sequences.
This simple protocol conveys useful information for teachers and the implementation of DNA fingerprinting in practical laboratory classes. In the presented laboratory exercise, DNA extraction followed by PCR amplification is used to determine genetic variation at the D1S80 VNTR locus. Differences in the fragment size of PCR products are visualized by agarose gel electrophoresis. The fragment sizes and repeat numbers are calculated based on a linear regression of the size and migration distance of a DNA size standard.
Following this guide, students should be able to:
&#8226;&#160; Harvest and extract DNA from buccal mucosa epithelial cells 
&#8226;&#160; Perform a PCR experiment and understand the function of various reaction components 
&#8226;&#160; Analyze the amplicons by agarose gel electrophoresis and interpret the results 
&#8226;&#160; Understand the use of VNTRs in DNA fingerprinting and its application in biological sciences

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Here we describe a simple protocol to generate DNA fingerprinting profiles by amplifying the VNTR locus D1S80 from epithelial cell DNA.

יישום של טביעת אצבע DNA באמצעות לוקוס D1S80 בשיעורי מעבדה

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

שימוש בתפוקה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת Microfluidic לפתח Biofilms Multi-מינים שבעל פה

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Bioengineering

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data may include mobile genetic elements, such as plasmids and extrachromosomal phage, that contribute to the dissemination of antimicrobial resistance and further complicate treatment of urinary tract infection (UTI). In addition to providing fine resolution of genome structure, complete, closed genomes allow for the detailed comparative genomics and evolutionary analyses. The generation of complete genomes de novo has long been a challenging task due to limitations of available sequencing technology. Paired-end Next Generation Sequencing (NGS) produces high quality short reads often resulting in accurate but fragmented genome assemblies. On the contrary, Nanopore sequencing provides long reads of lower quality normally leading to error-prone complete assemblies. Such errors may hamper genome-wide association studies or provide misleading variant analysis results. Therefore, hybrid approaches combining both short and long reads have emerged as reliable methods to achieve highly accurate closed bacterial genomes. Reported herein is a comprehensive method for the culture of diverse urinary bacteria, species identification by 16S rRNA gene sequencing, extraction of genomic DNA (gDNA), and generation of short and long reads by NGS and Nanopore platforms, respectively. Additionally, this method describes a bioinformatic pipeline of quality control, assembly, and gene prediction algorithms for the generation of annotated complete genome sequences. Combination of bioinformatic tools enables the selection of high quality read data for hybrid genome assembly and downstream analysis. The streamlined approach for the hybrid de novo genome assembly described in this protocol may be adapted for the use in any culturable bacteria.

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

This protocol details a comprehensive approach for the culturing, sequencing, and de novo hybrid genome assembly of urinary bacteria. It provides a reproducible procedure for the generation of complete, circular genome sequences useful in studying both chromosomal and extrachromosomal genetic elements contributing to urinary colonization, pathogenesis, and antimicrobial resistance dissemination.

הרכבה הגנום ההיברידית דה נובו לייצור גנומים שלמים של חיידקי השתן באמצעות טכנולוגיות רצף קצרות וארוכות

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data ...

Large-Scale SARS-CoV-2 Testing Utilizing Saliva and Transposition Sample Pooling

Identification and isolation of contagious individuals along with quarantine of close contacts, is critical for slowing the spread of COVID-19. Large-scale testing in a surveillance or screening capacity for asymptomatic carriers of COVID-19 provides both data on viral spread and the follow-up ability to rapidly test individuals during suspected outbreaks. The COVID-19 early detection program at Michigan State University has been utilizing large-scale testing in a surveillance or screening capacity since fall of 2020. The methods adapted here take advantage of the reliability, large sample volume, and self-collection benefits of saliva, paired with a cost-effective, reagent conserving two-dimensional pooling scheme. The process was designed to be adaptable to supply shortages, with many components of the kits and the assay easily substituted. The processes outlined for collecting and processing SARS-CoV-2 samples can be adapted to test for future viral pathogens reliably expressed in saliva. By providing this blueprint for universities or other organizations, preparedness plans for future viral outbreaks can be developed.

<meta charset="utf8"></head><body>בדיקת SARS-CoV-2 בקנה מידה גדול תוך שימוש באיגום דגימות רוק וטרנספוזיציה

The protocol is intended to serve as a blueprint for universities and other organizations considering large-scale testing for SARS-CoV-2 or developing preparedness plans for future viral outbreaks.

בדיקת SARS-CoV-2 בקנה מידה גדול תוך שימוש באיגום דגימות רוק וטרנספוזיציה

Identification and isolation of contagious individuals along with quarantine of close contacts, is critical for slowing the spread of COVID-19. ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

שילוב ניתוח של דנ א ב מיצוי Virion גולמי עם הניתוח של RNA של עלים נגועים לגלות הגנום וירוס חדש

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא

Summary

Explore More Videos

Metagenomic ניתוח של תחמיץ

בחירת גודל האוטומטי ג'ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

רוק הדגימה האדם Peptidome ילידים באמצעות בדיקה Lollipop-Like Ultrafiltration: פשט ולשפר גילוי פפטיד של ספקטרומטריית מסה קלינית

יישום של טביעת אצבע DNA באמצעות לוקוס D1S80 בשיעורי מעבדה

שימוש בתפוקה גבוהה

הרכבה הגנום ההיברידית דה נובו לייצור גנומים שלמים של חיידקי השתן באמצעות טכנולוגיות רצף קצרות וארוכות

בדיקת SARS-CoV-2 בקנה מידה גדול תוך שימוש באיגום דגימות רוק וטרנספוזיציה

בדיקת SARS-CoV-2 בקנה מידה גדול תוך שימוש באיגום דגימות רוק וטרנספוזיציה

שילוב ניתוח של דנ א ב מיצוי Virion גולמי עם הניתוח של RNA של עלים נגועים לגלות הגנום וירוס חדש