The authors would like to acknowledge Stanford Department of Orthopaedic Surgery and Stanford Coulter Translational Seed Grant for funding. J.H.L. would like to thank National Science Foundation Graduate Fellowship and DARE Doctoral Fellowship for support.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות של נבדקי סטנפורד אדם האוניברסיטה ואישרו פרוטוקול Institutional Review Board. 1. בידוד Articular הכונדרוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג סחוס מהרקמה שהושלכה במהלך החלפת מפרק הברך ולנתח כפי שתואר לעיל 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחינה ויזואלית לבחור condyles הירך המדיאלי או לרוחב של דגימות סחוס למשטחים חלקים ולעשות חתך על פני השטח של הסחוס באמצעות אזמל כדי להסיר 4-5 ביופסיות סחוס מ&quot;מ מבלי להשפיע על עצם subchondral. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד כונדרוציטים מהמטריצה ​​תאית על ידי ניתוק האנזימטית של הרקמה עם O טיפול / N עם collagenase המטוהר. השתמש 1: 1 יחס של Collagenase השני (125 U / ml) וCollagenase IV (160 U / ml) בתקשורת צמיחה הכונדרוציטים על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לסנן את הרקמה מתעכל המכיל את התאים ניתקו דרך 70מ&quot;מ נקבובית רשת ניילון גודל. לשטוף פעמיים עם 20 מיליליטר של DMEM / F12 וצנטריפוגות ב 600 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט כונדרוציטים המבודדים בצפיפות של צלחת תרבות 1 x 10 6 תאים / 60 מ&quot;מ הבא מחדש השעיה בDMEM / F12 בתוספת 10% העוברי בסרום שור (FBS), 25 מיקרוגרם / מיליליטר ascorbate, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, אנטיביוטיקה (100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו 0.25 מיקרוגרם / fungizone מיליליטר). שמור את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס ולשמור על התרבויות הכונדרוציטים העיקריות כmonolayer צפיפות גבוהה לפני אנקפסולציה בהידרוג&#39;ל biomimetic. </li></ol> ייצור 2. Biomimetic Hydrogel הערה: שיטה זו מאפשרת את הסינתזה של הידרוג&#39;ל biomimetic המכיל פולי (diacrylate אתילן גליקול) (PEGDA, גרם MW 5000 / שומה), סולפט-methacrylate כונדרואיטין (CS-MA) בDPBS. התוספת של photoinitiator מאפשרת crosslinking photoactivated. הרכב הידרוג&#39;ל הסופי מכיל 7% לשקולt / נפח (w / v) של PEGDA, 3% w / v של CS-MA, ושל 0.05% w / v של photoinitiator. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז CS-MA ידי functionalizing פולימר CS עם קבוצות methacrylate. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון שנאגרו של 50 מ&quot;מ חומצה 2-morpholinoethanesulfonic (MES) ו0.5 M נתרן כלורי (NaCl) על ידי המסת 1.952 גרם של MES ו5.84 גרם של NaCl ב200 מיליליטר של מים ללא יונים (DiH 2 O). לפזר 5 גרם של מלח נתרן כונדרואיטין סולפט בפתרון שנאגרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף .532 גרם (4.62 mmol) N-hydroxysuccinimide (NHS) ו1.771 גרם (9.24 mmol) 1-אתיל-3 (3-dimethylaminopropyl) hydrochloride -carbodiimide (EDC) (יחס טוחנת של NHS: EDC = 1: 2) ל הפתרון ומערבבים במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף .765 גרם (4.62 mmol) methacrylate 2-aminoethyl (AEMA) (יחס טוחנת של NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) לפתרון ולשמור על התגובה ב RT למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את התערובת על ידי דיאליזה נגד מים ללא יונים (diH 2 O) במשך 4 ימים באמצעות צינורות דיאליזה (12-14 kDa MWCO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את pפתרון urified דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ולמקם את הצינורות הפתוחים המכילים את הפתרון בO הייבוש והוואקום / N. ודא שכל הצינורות מוגנים מפני אור. אחסן את הפולימר המומס ב -20 ° C המוגנים מפני אור ולחות. </li></ol></li></ol> Encapsulation 3. הסלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי מוטות סרט וגלילי PCR (על חבטות את הידרוג 3D תא-לאדן) ולעקר את תבנית ג&#39;ל הגלילית מחוייט על ידי טבילה ב0.2 מיקרומטר אתנול 70% מסוננים במכסת מנוע בתרבית רקמה תחת אור UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את תחתית תבנית ג&#39;ל עם סרט PCR autoclaved ללא בועות אוויר או פערים כדי למנוע הדלפות. שמור את זה בצלחת 150 מ&quot;מ סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני אנקפסולציה התא בהידרוג&#39;ל biomimetic, לנתק את monolayer הכונדרוציטים בצפיפות גבוהה עם O טיפול / N בCollagenase השני ופתרון Collagenase IV. השתמש 125 U / ml לCollagenase השני ו -160 U / ml לCollagenase VI כל בצמיחה הכונדרוציטים תקשורתעל 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח צינור 50 מ&quot;ל ולהוסיף 5% במשקל / נפח (w / v) (diacrylate אתילן גליקול) פולי (PEGDA, MW = g 5000 / שומה), 3% w / סולפט-methacrylate נ &#39;כונדרואיטין (CS-MA), ו 0.05% w / v photoinitiator בDPBS. מערבולת הצינור לערבב את הפתרון ולשמור אותו בצד. להגן על הצינור מהאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים ניתקו בצינור פלקון 50 מיליליטר, ולספור צנטריפוגות ב 460 XG במשך 5 דקות. לשאוב את כל התקשורת מצינור התאים ולהוסיף חומר ג&#39;ל המעורב לעיל כדי מחדש להשעות תאים בצפיפות של 15 × 10 6 תאים / מיליליטר. מערבבים אותו 30 פעמים ביסודיות, תוך הימנעות היווצרות בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 72 μl של ההשעיה התא-הידרוג&#39;ל או הידרוג&#39;ל לבד לתוך תבנית ג&#39;ל הגלילי מחוייט ולהשרות gelation באמצעות חשיפה לאור UV (365 ננומטר אורך גל) בשעה 3 mW / m 2 למשך 5 דקות. הכן כמה פתרון הידרוג&#39;ל ללא תוכן סלולארי. השתמש במבנים אלה כפקדים שליליים לבדיקה ביוכימית ומכאנית העתיד. Measuמחדש את עוצמת אור UV עם מד עוצמת קרינת UV. כדי להתאים את עוצמת, לשנות את המרחק בין מקור אור UV ופיגום הידרוג&#39;ל במהלך gelation. הערה: מאחר הידרוג&#39;ל מכיל CS, תרומת acellular יורדת מתוכן GAG ביוכימיים של הידרוג&#39;ל התא-לאדן לייצג GAG הסלולרי בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזמל כדי לחתוך את הסרט לקליפה קלה והסר אותו בזהירות. בעזרת המוטות גליליות, לדחוף את הג&#39;ל לתוך צלחת גם 6 עם 5 מיליליטר של DPBS סטרילי כדי לשטוף את הג&#39;ל unpolymerized ותאים רופפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות הידרוג התא-לאדן ב -24 צלחות גם מכילות 1.5 מיליליטר של תקשורת צמיחה הכונדרוציטים לכל אחד. השתמש במרית חד פעמית להעביר את הידרוג שטף לתוך הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את כדאיויות תא על ידי צביעת 24 הודעה אנקפסולציה-שעות מתות החי באמצעות ערכת הכדאיות / cytotoxity. תרבות הידרוג התא-לאדן והידרוג הריק במשך 3-6 שבועות משתנה לGro הכונדרוציטים הטריwth תקשורת כל 2 ימים לפני קציר לניתוחים. </li></ol> 4. ניתוח ביטוי RNA חילוץ וג&#39;ין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב התקשורת ולשים סטרילי PBS 1X בתא-לאדן, כמו גם את הידרוג השליטה הריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית סטרילי, להעביר את כל הידרוג&#39;ל לצינור Eppendorf נקי 1.5 מיליליטר ולהוסיף 250 μl של Tri-מגיב על צינור אחד. עקוב אחר ההוראות של היצרן לבודד RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בידוד RNA וכימות שימוש 1 מיקרוגרם שלו מכל מדגם ולבצע שעתוק הפוך לcDNA באמצעות הקיבולת גבוהה cDNA הפוך תמלול ערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לPCR כמו להשתמש מערכי ביטוי גני TaqMan לבחינת הביטוי של גני עניין שלך. לנרמל את רמות ביטוי גנים פנימיים לGAPDH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתנאי PCR כולל דגירה 2 דקות ב 50 מעלות צלזיוס כדי להשבית amplicons הקודמת עם glycosylase אורציל-דנ&quot;א, ואחריו 1060; דקות דגירה על 95 מעלות צלזיוס כדי להפעיל את פולימראז תקי. ואז לבצע מחזורים ארבעים של PCR, בהיקף של 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, ודקות 1 ב 60 ° C. </li></ol> 5. ניתוח ביוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל מבני תא-הידרוג&#39;ל לכמת DNA וייצור glycosaminoglycan הגופריתי (sGAG) כדלקמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב התקשורת ולשים סטרילי PBS 1X בתא-לאדן, כמו גם את הידרוג השליטה הריק. לשקול צינור ריק ולשים בתוך הידרוג&#39;ל לאחר סופג את זה על נייר ולרשום את המשקל או המשקל רטוב של הידרוג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא כל הידרוג&#39;ל ב -20 ° C בצינור 1.5 מיליליטר נפרד eppendorf לעיכול אנזימטי ולאחר מכן להשתמש aliquot של המוצר מתעכל לרוץ assay PicoGreen (לDNA) וassay הכחול דימתיל-מתילן (לGAG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון papainase לעיכול אנזימטי של הידרוג&#39;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשון להכין את חיץ PBE על ידי שקילה מתוך 7.1 גרם של נתרן phosphatdibasic דואר (Na 2 4 HPO) ו -1.6 גרם של מלח disodium חומצת Ethylenediaminetetraacetic (EDTA-Na 2). ממיסים בכ -500 מיליליטר של DH 2 O, להתאים את ה- pH 6.5 ולסנן את הפתרון המטוהר דרך מסנן 0.22 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.035 גרם של L-ציסטאין ב 20 מיליליטר של חיץ PBE. סנן את הפתרון ושל אנזים פפאין סטרילי 100 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוכן לבצע את מבחני, לקחת את הצינורות מ-20 ° C ולהוסיף 300 μl של פתרון פפאין מוכן הידרוג הקפוא. למחוץ את הג&#39;ל עם מכתש ועלי ולערבב אותו היטב עם העלי המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את הנפח 500 μl עם פתרון פפאין נוסף. בצע את אותו ההליך לג&#39;לי השליטה. לדגור על 60 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות 3,9. התמיסה המכילה הידרוג&#39;ל מתעכל ולכן יכולה לשמש לדנ&quot;א וכימות GAG. מדוד את תוכן ה- DNA באמצעות assay PicoGreen עם DNA הפאג מבדה כסטנדרט הבא יחסי הציבור של היצרןotocol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את התוכן הגופריתי-GAG באמצעות כחול 1.9-dimethylmethylene (DMMB) assay מחייב צבע עם כונדרואיטין סולפט הכריש כמו 10 סטנדרטיים. לקבוע את תוכן GAG על ידי חלוקת הסך של GAG למשקל הרטוב המקביל. </li></ol> 6. מכאני בדיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בדיקות דחיסת unconfined באמצעות מערכת בדיקת Instron 5944 מצוידות בתא מטען 10 N. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הימים הרצויים של תרבות במבחנה, לבצע את בדיקת הדחיסה על פיגום התא-הידרוג&#39;ל והידרוג שליטת acellular. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הדגימות באמבט PBS ב RT ולדחוס בשיעור של 1% מתח / sec למתח מרבי של 15% מאז 11,12 המתח הפיזיולוגי חווה ברקמת סחוס בתנאי טעינה כבר דיווח להיות 10-20% 13,14. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור מתח לעומת עקומות מתח וכושר עקום באמצעות משוואת פולינום סדר שלישי. לקבוע comprמודול משיק essive ממשוואת הכושר העקום בערכי מתח של 15%. </li></ol>

<ol>
	<li>Roberts, S., Menage, J., Sandell, L. J., Evans, E. H., Richardson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+study+of+collagen+types+I+and+II+and+procollagen+IIA+in+human+cartilage+repair+tissue+following+autologous+chondrocyte+implantation.">Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation.</a> Knee. 16, 398-404 (2009).</li><li>Smeriglio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Potential+of+Juvenile+and+Adult+Human+Articular+Chondrocytes+for+Cartilage+Tissue+Formation+in+Three-Dimensional+Biomimetic+Hydrogels.">Comparative Potential of Juvenile and Adult Human Articular Chondrocytes for Cartilage Tissue Formation in Three-Dimensional Biomimetic Hydrogels.</a> Tissue engineering. Part A. , (2014).</li><li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels.">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Scientific reports. 3, 3553 (2013).</li><li>Taipale, J., Keski-Oja, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+in+the+extracellular+matrix.">Growth factors in the extracellular matrix.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11, 51-59 (1997).</li><li>Varghese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulfate+based+niches+for+chondrogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Chondroitin sulfate based niches for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Matrix Biol. 27, 12-21 (2008).</li><li>Park, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+matrix+stiffness+on+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+in+response+to+TGF-beta.">The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-beta.</a> Biomaterials. 32, 3921-3930 (2011).</li><li>Wang, T., Lai, J. H., Han, L. H., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stromal+Cells+in+Combinatorial+Hydrogels+Containing+Cartilage+Matrix+Proteins+with+Decoupled+Mechanical+Stiffness.">Chondrogenic Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells in Combinatorial Hydrogels Containing Cartilage Matrix Proteins with Decoupled Mechanical Stiffness.</a> Tissue engineering. Part A. , (2014).</li><li>Smith, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intermittent+hydrostatic+pressure+and+BMP-2+on+osteoarthritic+human+chondrocyte+metabolism+in+vitro.">Effects of intermittent hydrostatic pressure and BMP-2 on osteoarthritic human chondrocyte metabolism in vitro.</a> J Orthop Res. 29, 361-368 (2011).</li><li>Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Kimura, J. H., Hunziker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+in+agarose+culture+synthesize+a+mechanically+functional+extracellular+matrix.">Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix.</a> J Orthop Res. 10, 745-758 (1992).</li><li>Farndale, R. W., Buttle, D. J., Barrett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+quantitation+and+discrimination+of+sulphated+glycosaminoglycans+by+use+of+dimethylmethylene+blue.">Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue.</a> Biochim Biophys Acta. 883, 173-177 (1986).</li><li>Lai, J. H., Levenston, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meniscus+and+cartilage+exhibit+distinct+intra-tissue+strain+distributions+under+unconfined+compression.">Meniscus and cartilage exhibit distinct intra-tissue strain distributions under unconfined compression.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 18, 1291-1299 (2010).</li><li>Li, L. P., Buschmann, M. D., Shirazi-Adl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-rate+dependent+stiffness+of+articular+cartilage+in+unconfined+compression.">Strain-rate dependent stiffness of articular cartilage in unconfined compression.</a> Journal of biomechanical engineering. 125, 161-168 (2003).</li><li>Armstrong, C. G., Bahrani, A. S., Gardner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+measurement+of+articular+cartilage+deformations+in+the+intact+human+hip+joint+under+load.">In vitro measurement of articular cartilage deformations in the intact human hip joint under load.</a> The Journal of bone and joint surgery. American. 61, 744-755 (1979).</li><li>Macirowski, T., Tepic, S., Mann, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+stresses+in+the+human+hip+joint.">Cartilage stresses in the human hip joint.</a> Journal of biomechanical engineering. 116, 10-18 (1994).</li><li>Benya, P. D., Shaffer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+chondrocytes+reexpress+the+differentiated+collagen+phenotype+when+cultured+in+agarose+gels.">Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels.</a> Cell. 30, 215-224 (1982).</li><li>Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage:+tissue+design+and+chondrocyte-matrix+interactions.">Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions.</a> Instructional course lectures. 47, 477-486 (1998).</li><li>Wang, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+chondroitin+sulphate+for+cartilage+tissue-biomaterial+integration.">Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration.</a> Nat Mater. 6, 385-392 (2007).</li><li>Simson, J. A., Strehin, I. A., Allen, B. W., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bonding+and+fusion+of+meniscus+fibrocartilage+using+a+novel+chondroitin+sulfate+bone+marrow+tissue+adhesive.">Bonding and fusion of meniscus fibrocartilage using a novel chondroitin sulfate bone marrow tissue adhesive.</a> Tissue engineering. Part A. 19, 1843-1851 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כפי שדווח בפרוטוקול זה, הידרוג 3D הם מסוגלים לשמור על הפנוטיפ הכונדרוציטים בתרבות, הימנעות התהליך של dedifferentiation תא לתאי fibrocartilage נתקלו בדרך כלל בתרבויות monolayer 15. יתר על כן, תרבויות לטווח ארוך של מבנה הידרוג&#39;ל chondrocytes- חשפו סביבה נוחה השומרת על תכונות תא הפנימיות הקשורים לגיל ומחלה. השימוש בהידרוג&#39;ל biomimetic 3D יש מספר יתרונות. ראשית, הכללתו של כונדרואיטין סולפט (CS), מרכיב עיקרי שנמצא בסחוס במפרק, מאפשר לתאים לבזות את מטריצת הידרוג&#39;ל על ידי הפרשת chondroitinase ונשכב סחוס מסונתז חדש נוספת הסלולר מטריצה ​​5, 16. בנוסף, CS הוכח יש תכונות אנטי דלקתיות במפרק דלקת פרקים. גם הידרוג&#39;ל biomimetic עשוי לשמש כחומר פיגומים למסירת תא בתיקון סחוס, ועשוי להיות שינוי כימיכדי להקל 17,18 שילוב רקמות ביולוגי טוב יותר. השימוש בהידרוג PEG-CS מאפשר טווח ארוך תרבויות של כונדרוציטים וההערכה של נכסים ביוכימיים ומכאניים. כאן אנו מראים כיצד פלטפורמה זו יכולה להיות שימושית עבור הניתוחים ההשוואתיים של מקורות שונים של כונדרוציטים מובחנים כדי להגדיר את סוג התא האופטימלי להנדסת סחוס. מעניין לציין, כונדרוציטים במארז בהידרוג&#39;ל להישאר קיימא ולהתרבות על פי היכולות הפנימיות שלהם. תומך הרכב הידרוג&#39;ל, למעשה, הצמיחה של כונדרוציטים לנוער ומבוגרים בריאים, כפי שמוצגת באיור 2. הרכב והמבנה של הידרוג&#39;ל תאר גם מקדמים היווצרות רקמת סחוס כפי שצוין על ידי התצהיר של מטריקס תפקודי הוערך על ידי glycosaminoglycan (GAG כימות). יתרון נוסף הוא שהמבנים הכונדרוציטים-הידרוג&#39;לניתן להעריך לתכונות מכאניות של רקמת הסחוס החדש שנוצרה. שים לב שבדיקת דחיסת unconfined צריכה להתבצע על הידרוג&#39;ל acellular להשוואה. הידרוג&#39;ל, למעשה, יש לי נוקשות פנימיות בשל הקשיחות של moieties CS. זן unconfined דחיסה של 5-20% (בשיעור של 1% מתח / ים) יכול להיות מיושם לבדיקה המכנית של רקמת סחוס 11,12 מאז את המתח הפיזיולוגי חווה ברקמת סחוס בתנאי טעינה כבר דיווח להיות 10-20 % 13,14. התגובה של הידרוג&#39;ל שני התאים-לאדן וacellular לבדיקות מכאניות הוערכה בסוף נקודות התרבות. בדוגמא שתוארה לעיל צפינו קשיחות דומה של המבנים המכילים כונדרוציטים מבוגרים ונוער בניגוד לקשיחות הנמוכה של המבנים המכילים כונדרוציטים OA. תכונות מכאניות כזה של מבנה התא-הידרוג&#39;ל מאפשרות ההערכה של המאפיינים הפונקציונליים שלרקמה שנוצרה נותנת ניתוח מעמיק של יכולת התבגרות תא. לסיכום, השימוש בהידרוג&#39;ל biomimetic 3D כדי לחקור את הפוטנציאל של אוכלוסייה הכונדרוציטים שונה כדי ליצור רקמת סחוס יכול להיות מיושם באופן נרחב. מלבד המחקרים במבחנה המתוארים כאן, השתלת in vivo של מבני התא-לאדן יכולה להיות שחזתה ללמוד התבגרות תא ופוטנציאל התחדשות בהקשר הפיזיולוגי. שינויים נוספים של פלטפורמת הידרוג&#39;ל עם גורמי biomimetic נוספים יכולים להיות גם חזה כדי לייעל התפשטות הכונדרוציטים והתבגרות.

With its limited self-repair potential, human articular cartilage undergoes frequent irreversible damages. Extensive efforts are currently focused on the development of efficient cell-based approaches for treatment of articular cartilage injuries. The success of these cell-based therapies is highly dependent on the selection of an optimal cell source and the maintenance of its regenerative potential. Chondrocytes are a common cell source for cartilage repair, but they are limited in supply and can de-differentiate during in vitro expansion in 2D monolayer culture thereby limiting their generation of hyaline cartilage 1. 
The aim of this protocol is to establish a 3-dimensional hydrogel platform for an in vitro comparative study of human chondrocytes from different ages and disease state. Unlike conventional two-dimensional (2D) culture, three-dimensional (3D) hydrogels allow chondrocytes to maintain their morphology and phenotype and provides a physiologically relevant environment enabling chondrocytes to produce cartilage tissue 2,3. In addition to providing a 3D physical structure for chondrocyte culture, hydrogels mimic the function of native cartilage extracellular matrix (ECM). Specifically, the inclusion of chondroitin sulfate methacrylate provides a potential reservoir for secreted paracrine factors 4 and enables cell-mediated degradation and matrix turnover 5. Although many 3D hydrogel culture systems have been utilized widely in various studies including agarose and alginate gels, we have used a biomimetic 3D culture system that has some distinct advantages for chondrocyte culture. Chondroitin sulfate (CS) is an abundant component in articular cartilage and the PEG-CS hydrogels have been shown to maintain and even enhance chondrogenic phenotype and facilitate cell-mediated matrix degradation and turnover 2,5. In addition, the mechanical properties of the hydrogel scaffold can be easily modulated by changing concentration of PEG and hence can be utilized to further enhance the regeneration potential of chondrocytes or a related cell type 6,7. PEG/CSMA is also biocompatible and hence has the potential for a direct clinical application in cartilage defects for example. The limitation for this system is its complexity and the use of photopolymerization that can potentially affect cell viability as compared to simpler systems like agarose, however the advantages for the chondrocyte culture outweigh the potential limitations.
The 3D hydrogel culture is compatible with conventional assay for evaluation of cell phenotype (gene expression, protein immunostaining) and functional outcome (quantification of cartilage matrix production, mechanical testing). This favorable 3D environment was tested to compare the tissue regeneration potential of human chondrocytes from three different aged populations in long-term 3D cultures. 
The outcomes were evaluated via both phenotypic and functional assays. Juvenile, adult and OA chondrocytes showed differential responses in the 3D biomimetic hydrogel culture. After 3 and 6 weeks, chondrogenic gene expression was upregulated in juvenile and adult chondrocytes but was downregulated in OA chondrocytes. Deposition of cartilage tissue components including aggrecan, type II collagen, and glycosaminoglycan (GAG) was high for juvenile and adult chondrocytes but not for OA chondrocytes. The compressive moduli of the resulting cartilage constructs also exhibited similar trends. In conclusion, both juvenile and adult chondrocytes exhibited chondrogenic and cartilage matrix disposition up to 6 weeks of 3D culture in hydrogels. In contrast, osteoarthritic chondrocytes revealed a loss of cartilage phenotype and minimal ability to generate robust cartilage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>juvenile chondrocytes (Clonetics&#8482; Normal Human Chondrocyte Cell System )</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adult chondrocytes (Clonetics&#8482; Normal Human Chondrocyte Cell System)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(ethylene glycol diacrylate)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>ACRL-PEG-ACRL-1000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-morpholinoethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photoinitiator</td>
			<td>Irgacure&#160;</td>
			<td align="right">2959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chondroitin sulfate sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-aminoethyl methacrylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing</td>
			<td>Spectrum Laboratories&#160;</td>
			<td align="right">132700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 4</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>HyClone, Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SH3002301&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>live/dead assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L3224">L3224</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT&#8482; PicoGreen&#174; dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P11496">P11496</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,9-dimethylmethylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">341088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light equipment - XX-15LW Bench Lamp, 365nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0042-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instron 5944 testing system&#160;</td>
			<td>Instron Corporation</td>
			<td>E5940</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d hydrogel scaffolds for articular chondrocyte culture and cartilage generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

הידרוג ביו המכיל PEG וmoieties CS (איור 1) מייצג פלטפורמה אידיאלית לתרבות והתבגרות של 2,3,5,7 כונדרוציטים במפרק אנושיים. כונדרוציטים מגילים שונים ומצבי מחלה יכולים להיות מתורבת בשיטה שתוארה ונותחו לפנוטיפ, ביטוי גנים שלהם ומאפיינים ביוכימיים ומכאניים של רקמת הסחוס שנוצרה. שלוש דגימות הכונדרוציטים, juvenile- 6 חודשים, למבוגר 34 שנים וosteoarthritic- 74 שנים, נקצרו לאחר 3 שבועות של התרבות בהידרוג&#39;ל biomimetic 3D. ביטוי גני מנתח של כונדרוציטים רגילים, שניהם צעירים ומבוגר, הראה עלייה בביטוי של גנים הכונדרוציטים Col2a1 וCol6a1. להיפך, כונדרוציטים חולים הראו ירידה דרמטית בCol2a1 תוך שמירה על הביטוי של Col6a1 (איור 2) מראה הפסד של פנוטיפ chondrogenic למרות היותו מתורבת בסביבת biomimetic חיובית. גם הידרוג CS-PEG לשמש כסביבה דינמית לכונדרוציטים להתרבות, לעכל את המטריצה ​​קיימת מראש של PEG וCS ולהפקיד מטריצת pericellular והתאית שלהם, המרכיבים העיקריים של רקמת הסחוס הבוגרת. בהתחשב ביכולות אלה, הרחבה הכונדרוציטים לאחר 3 שבועות של תרבות במבחנה יכולות להיות מוערכות על ידי כימות של ה- DNA עם צבע PicoGreen. ניתוח השוואתי של שלוש הקבוצות של תאים מראה כי צפיפות התאים של אוכלוסיות לנוער ומבוגרים הייתה ללא שינוי ואילו כונדרוציטים OA הציגו ירידה דרמטית בהשוואה ליום 1 של התרבות. אובדן תוכן DNA נצפה גם עבור OA אבל לא כונדרוציטים אחרים המצביעים על מוות של תאים אפשריים במהלך התרבות לטווח הארוך (איור 3). המטריצה ​​המופרשת הייתה לכמת כתוכן הגופריתי-GAG ידי assay מחייב צבע DMMB בשלב נקודת סיום לאחר 3 שבועות של תרבויות. תוכן GAG מנורמל על ידי המשקל הרטוב של הידרוג&#39;ל כrecorded לפני עיכול אנזימטי ותרומת acellular מופחת. כפי שניתן לראות באיור 4, כונדרוציטים הופקדו סכום משמעותי דומה של GAG במהלך 3 שבועות של התרבות בהידרוג 3D. נוכחותו של פיגום פיזי מאפשרת ההערכה של נכסים ביו-מכאניים של הדגימות באמצעות 2,3 בדיקות דחיסת unconfined. בעוד הידרוג acellular לעבור ירידה בmoduli הדחיסה, בונה תאים העמוסים נשמרה moduli הדחיסה לאחר 3 שבועות בתרבות (איור 4). פנוטיפי, ניתוחים ביוכימיים וביו-מכאניים שתוארו כאן הם אפוא שימושי להערכה והבנת הפוטנציאל של אוכלוסיות שונות להכונדרוציטים סחוס הנדסה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig1.jpg" /> איור 1. הידרוג biomimetic PEG-CS לרחוב ללא הכונדרוציטים 3Dture. כונדרוציטים הם resuspended בתערובת המכילה פולי (diacrylate אתילן גליקול) (PEGDA) וסולפט-methacrylate כונדרואיטין (CS-MA) ויציקה לתוך תבנית ג&#39;ל הגלילית מחוייט. לאחר חשיפה לקרינת UV, הגדילו את ג&#39;לי נאספים מהתבניות וכדאיויות תא מוערכת על ידי צביעה המתה חי פוסט-אנקפסולציה 24 שעות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig2.jpg" /> איור 2. ביטוי של גני chondrogenic בכונדרוציטים אנושיים בתרבית הידרוג biomimetic 3D. ביטוי גני כמותי של סמני סחוס Col2a1 וCol6a1 ידי כונדרוציטים לנוער, למבוגרים וOA לאחר 3 שבועות של התרבות בהידרוג&#39;ל biomimetic 3D. ערכים הם מנורמלים לרמת ביטוי גן ביום ב 1. שגיאהערס מייצג ממוצע ± SD. * P &lt;0.05, כפי שנקבע על ידי מבחן t סטודנטים שני זנב. שונה מSmeriglio et al. 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig3.jpg" /> תוכן איור 3. DNA בכונדרוציטים אנושיים בתרבית הידרוג biomimetic 3D. כימות DNA על ידי assay PicoGreen בכונדרוציטים לנוער, למבוגרים וOA לאחר 3 שבועות של התרבות בהידרוג&#39;ל biomimetic 3D. ערכים הם מנורמלים לרמת ה- DNA ביום 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig4.jpg" /> &lt;br /&gt; איור תוכן מדידת 4. GAG ובדיקת דחיסת unconfined של כונדרוציטים אנושיים ביום 1 ולאחר 3 שבועות של התרבות בהידרוג&#39;ל biomimetic 3D. () כימות GAG ידי assay DMMB בכונדרוציטים ביום 1 ולאחר 3 שבועות של תרבות ב הידרוג biomimetic 3D. ערכים הם מנורמלים להרטיב משקל (ww) והביעו כמיקרוגרם / g. (ב) מודולוס לחיצה (kPa) של הידרוג&#39;ל acellular ותא-לאדן ביום 1 ולאחר 3 שבועות של התרבות בהידרוג&#39;ל biomimetic 3D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation at JoVE.com

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D Hydrogel פיגומים למפרקים הכונדרוציטים תרבות וסחוס דור

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

3d-hydrogel-scaffolds-for-articular-chondrocyte-culture-cartilage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.8K Views.  Stanford University. Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes. 

Video: 3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

הכנת 3D הפיברין פיגומים יישומים סלולריים גזע תרבות

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and cell-matrix interactions. Due to this complexity, recapitulation of lung development in vitro to promote differentiation of stem cells to lung epithelial cells has been challenging. In this protocol, decellularized lung scaffolds are used to mimic the 3-dimensional environment of the lung and generate stem cell-derived airway epithelial cells. Mouse embryonic stem cell are first differentiated to the endoderm lineage using an embryoid body (EB) culture method with activin A. Endoderm cells are then seeded onto decellularized scaffolds and cultured at air-liquid interface for up to 21 days. This technique promotes differentiation of seeded cells to functional airway epithelial cells (ciliated cells, club cells, and basal cells) without additional growth factor supplementation. This culture setup is defined, serum-free, inexpensive, and reproducible. Although there is limited contamination from non-lung endoderm lineages in culture, this protocol only generates airway epithelial populations and does not give rise to alveolar epithelial cells. Airway epithelia generated with this protocol can be used to study cell-matrix interactions during lung organogenesis and for disease modeling or drug-discovery platforms of airway-related pathologies such as cystic fibrosis.

This protocol efficiently directs mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm to mature airway epithelial cells. This differentiation technique uses 3-dimensional decellularized lung scaffolds to direct lung lineage specification, in a defined, serum-free culture setting.

דור של אפיתל דרכי נשימת עכבר נגזרות ESC תאי שימוש decellularized פיגומי ריאות

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

ניסויי ו אלמנטים סופיים פרוטוקול לחקר התחבורה של מומסים ניטראליים והואשמו ברחבי Articular סחוס

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting של הסחוס, תחליפי רקמת העור ניצול פסיבים הרומן ערבוב טכניקה יחידה עבור Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread chondrocyte death, potentially leading to irreversible breakdown of the joint and the onset of osteoarthritis. Additionally, maintenance of chondrocyte viability is important in osteochondral graft procedures for optimal surgical outcomes. We present a method to assess the spatial extent of cell injury/death on the articular surface of intact murine synovial joints after application of controlled mechanical loads or impacts. This method can be used in comparative studies to investigate the effects of different mechanical loading regimens, different environmental conditions or genetic manipulations, as well as different stages of cartilage degeneration on short- and/or long-term vulnerability of in situ articular chondrocytes. The goal of the protocol introduced in the manuscript is to assess the spatial extent of cell injury/death on the articular surface of murine synovial joints. Importantly, this method enables testing on fully intact cartilage without compromising native boundary conditions. Moreover, it allows for real-time visualization of vitally stained articular chondrocytes and single image-based analysis of cell injury induced by application of controlled static and impact loading regimens. Our representative results demonstrate that in healthy cartilage explants, the spatial extent of cell injury depends sensitively on load magnitude and impact intensity. Our method can be easily adapted to investigate the effects of different mechanical loading regimens, different environmental conditions or different genetic manipulations on the mechanical vulnerability of in situ articular chondrocytes.

We present a method to assess the spatial extent of cell injury/death on the articular surface of intact murine joints after application of controlled mechanical loads or impacts. This method can be used to investigate how osteoarthritis, genetic factors and/or different loading regimens affect the vulnerability of in situ chondrocytes.

ויזואליזציה בזמן אמת וניתוח Chondrocyte לפציעה בגלל העמסה מכנית ב Explants הסחוס מאתר באופן מלא ללא פגע

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage research has focused on the development of regenerative scaffolds. This article describes the development of scaffolds that are completely derived from natural cartilage extracellular matrix, coming from an equine donor. Potential applications of the scaffolds include producing allografts for cartilage repair, serving as a scaffold for osteochondral tissue engineering, and providing in vitro models to study tissue formation. By decellularizing the tissue, the donor cells are removed, but many of the natural bioactive cues are thought to be retained. The main advantage of using such a natural scaffold in comparison to a synthetically produced scaffold is that no further functionalization of polymers is required to drive osteochondral tissue regeneration. The cartilage-derived matrix scaffolds can be used for bone and cartilage tissue regeneration in both in vivo and in vitro settings.

Decellularized cartilage-derived scaffolds can be used as a scaffold to guide cartilage repair and as a means to regenerate osteochondral tissue. This paper describes the decellularization process in detail and provides suggestions to use these scaffolds in in vitro settings.

ייצור של מטריקס הסחוס, נגזר Decellularized פיגומים

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with controlled pore structure and mechanical properties. Cellulose nanocrystals (CNCs, 69.62 wt%) based hydrogel ink with matrix (sodium alginate and gelatin) was developed and 3D printed into scaffolds with uniform and gradient pore structure (110-1,100 &#181;m). The scaffolds showed compression modulus in the range of 0.20-0.45 MPa when tested in simulated in vivo conditions (in distilled water at 37 &#176;C). The pore sizes and the compression modulus of the 3D scaffolds matched with the requirements needed for cartilage regeneration applications. This work demonstrates that the consistency of the ink can be controlled by the concentration of the precursors and porosity can be controlled by the 3D printing process and both of these factors in return defines the mechanical properties of the 3D printed porous hydrogel scaffold. This process method can therefore be used to fabricate structurally and compositionally customized scaffolds according to the specific needs of patients.&#160;

The three critical steps of this protocol are i) developing the right composition and consistency of the cellulose hydrogel ink, ii) 3D printing of scaffolds into various pore structures with good shape fidelity and dimensions and iii) demonstration of the mechanical properties in simulated body conditions for cartilage regeneration.

3D מודפס נקבובי תאית Nanocomposite הידרוג פיגומים

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...