הפרוטוקול שלנו משמעותי מכיוון שהוא מאפשר יצירת מחלות בהידרוג'לים הדומים מאוד לאופי רקמת הסחוס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לייצר מחלות בהידרוג'לים עם פעילות ביולוגית ניכרת במבנה מרחבי, אימונוגניות נמוכה ותפקוד תעשייתי ביולוגי. כדי להתחיל, קוצצים את הסחוס שנאסף באמצעות אזמל לחתיכות בגודל של מילימטר מעוקב אחד עד שניים.
בצינור צנטריפוגה של 50 מ"מ, שוקעים 20 גרם של הסחוס הטחון ב -20 מיליליטר של חיץ טריס-הידרוכלוריד היפוטוני. מניחים את הצינור על 80 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות, ולאחר מכן בתנור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות. מערבלים את צינור הצנטריפוגה למשך 30 שניות ב-1000 סל"ד.
לאחר מכן סננו את הסחוס נטול התאים באמצעות מסננת פלסטיק המונחת על צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. שטפו את הסחוס שלוש פעמים עם PBS סטרילי לפני איסופו. הוסיפו 10 מיליליטר של תמיסת טריפסין לסחוס שנאסף ודגרו עליו על שייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, החליפו את הטריפסין כל ארבע שעות.
לאחר סינון המתלים, לשטוף את הסחוס טריפסיני עם חיץ hypertonic. לאחר שימור הסחוס, מוסיפים 10 מיליליטר של תמיסת נוקלאז ומניחים אותו על שייקר בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר שטיפה עם PBS סטרילי, להוסיף תמיסת Tris-hydrochloride היפרטונית לסחוס ולהניח אותו על שייקר כפי שהודגם.
לאחר השטיפה עם PBS סטרילי, לטבול את הרקמה בתמיסת 1% Triton X-100 למשך 24 שעות. לאחר הסרת Triton X-100, שטפו את הסחוס נטול התאים במים מזוקקים במשך שלושה ימים, והחליפו את המים כל 12 שעות. לאחר שלושה ימים, מוסיפים תמיסת חומצה פראצטית לסחוס ומשרים אותה למשך ארבע שעות.
לאחר שנשטף עם PBS, לאסוף את הסחוס באמצעות מסננת פלסטיק כפי שהודגם בעבר. בעזרת חנקן נוזלי, להכין אבקת סחוס decellularized. מוסיפים 80 מיליליטר של 0.5 חומצה אצטית מולרית ו-20 מיליגרם פפסין לשני גרם אבקת סחוס, ומעכלים את התערובת במשך 24 שעות בחום של 37 מעלות.
לאחר העיכול, צנטריפוגו את המתלה ב 400 G במשך 10 דקות ולאסוף את supernatant, אשר נקרא עכשיו פתרון DC-ECM לאחסון פתרון DC-ECM, להוסיף מיליליטר אחד של הפתרון לכל באר של צלחת שש בארות ומניחים אותו בליופיליזר. לאחר ייבוש התמיסה בהקפאה, העבירו אותה לצינור צנטריפוגה. ליצירת הידרוג'ל, יש להמיס 20 מיליגרם של תמיסת DC-ECM מיובשת בהקפאה במיליליטר אחד של מים מזוקקים סטריליים.
לאחר ערבוב, להוסיף מיליגרם אחד של ויטמין B2 לתמיסת DC-ECM. לאחר הדגירה, להקרין אותו עם אור UV במשך שלוש דקות. הוסיפו את החיץ GTL ופרוטאינאז K ל-20 מיליגרם אבקת סחוס DC-ECM, וערבבו היטב באמצעות תנודות מערבולת.
להמסה מלאה של הסחוס, דוגרים על התערובת בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר מערבולת, להוסיף 200 מיקרוליטר של GTL חיץ ואחריו אתנול נטול מים. לאחר המערבולת, צנטריפוגו את הדגימה ב 6000 G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן לאסוף ולכמת את הדנ"א כפי שמתואר בכתב היד. לניתוח קולגן, יש להחמיץ, חמישה מיליגרם אבקת DC-ECM בחומצה הידרוכלורית בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן נטרלו אותו עם חמישה מיליליטר של שישה תמיסת נתרן הידרוקסיד מולרית.
חשב את תכולת ההידרוקסיפרולין של הדגימה המנוטרלת באמצעות ספיגה של 570 ננומטר כנגד תקן הידרוקסיפרולין. הוסף 500 מיקרוליטר של מגיב A ל 200 מיליגרם של אבקת DC-ECM לאחר ערבוב. לדגור על הדגימה בארבע מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
לאחר צנטריפוגה, לאסוף 50 מיקרוליטר של פתרון הדגימה ולהוסיף 50 מיקרוליטר של מגיב B, ואחריו מגיב C.לאחר הדגירה של הדגימה במשך 10 דקות, להוסיף 750 מיקרוליטר של מגיב D לדגור במשך 30 דקות בחושך. לאחר הצנטריפוגה, מוסיפים מיקרוליטר אחד של מגיב E לגלולה ומערבבים היטב לפני הצנטריפוגה. לאחר מכן נתק את הדגימה לפני מדידת תוכן GAG.
בסחוס DC-ECM שהוכן, תכולת ה- DNA בוטלה באופן משמעותי. עם זאת, תכולת הקולגן והגליקאנו נשמרה בהשוואה לסחוס הטבעי. ניתוח SEM ו- TEM הדגים את מבנה העל של DC-ECM מוכן.
ההידרוג'ל המוכן בצינור ההפוך לא זרם לתחתית, ובכך הדגים ג'לציה. יתר על כן, בהשוואה לתמיסת DC-ECM בלבד, תוספת של ויטמין B2 הפחיתה את זמן הג'לציה עקב ההצלבה המושרה במהלך היווצרות הידרוג'ל DC-ECM. צמיגות ההידרוג'ל DC-ECM הייתה גבוהה יותר צמיגות התמיסה וקצבי גזירה מוגברים הפחיתו את צמיגות התמיסה.
יתר על כן, מודולוס האחסון הגבוה של תמיסת DC-ECM והידרוג'ל הצביע על כך שלשניהם יש תכונות ג'ל ולא נוזלי. ניתוח SEM הראה כי גודל הנקבוביות של תמיסת DC-ECM ירד משמעותית בצורת הידרוג'ל לאחר crosslinking וייבוש בהקפאה. הפרוטוקול כולל שילוב של שיבוש פיזיקלי וכימי ועיכול אנזימטי לסילוק חומר תאי תוך שמירה על המבנה והשיחה של ה-ECM.
