The authors would like to acknowledge Stanford Department of Orthopaedic Surgery and Stanford Coulter Translational Seed Grant for funding. J.H.L. would like to thank National Science Foundation Graduate Fellowship and DARE Doctoral Fellowship for support.

Tüm deneyler Stanford Üniversitesi İnsan deneklerin esaslara uygun olarak yapılır ve Kurumsal Değerlendirme Kurulu protokolü onaylandı. 1. Eklem Kondrosit İzolasyonu <ol><li> Total diz protezi sırasında atılan doku kıkırdak edinin ve daha önce 8 açıklandığı gibi teşrih. </li><li> Görme pürüzsüz yüzeyler için kıkırdak örneklerinin medial veya lateral femoral kondilleri seçin ve subkondral kemik etkilemeden 4-5 mm kıkırdak biyopsi kaldırmak için bir neşter ile kıkırdak yüzeyinde kesi yapmak. </li><li> Arıtılmış kollajenaz ile O / N tedavi ile doku enzimatik ayrışma ile hücre dışı matris kondrositler izole edin. 37 ° C &#39;de, kondrosit büyüme ortamı kollajenaz II (125 U / ml) ve kollajenaz IV (160 U / ml) 1: 1&#39;lik kullanın. </li><li> Ertesi gün, 70 ile ayrışmış hücreleri ihtiva eden sindirilir doku filtremm boyut Naylon örgü gözenek. 5 dakika boyunca 600 x g&#39;de DMEM / F12 ve santrifüj 20 ml ile iki kez yıkayın. </li><li> % 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM / F12 içinde yeniden süspansiye, 25 ug / ml askorbat, 2 mM L-glutamin, antimikrobik maddeler, aşağıdaki 1 x 10 6 hücre / 60 mm kültür çanağı yoğunluğunda izole kondrositler Plate (100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 0.25 ug / ml fungizon). Önceki biomimetic hidrojeller kapsülleme 37 ° C&#39;de plakaları tutun ve yüksek yoğunluklu bir tek tabaka olarak birincil kondrosit kültürleri korumak. </li></ol> 2. Biyomimetik Hidrojel Fabrikasyon Not: Bu yöntem sağlar poli (etilen glikol diakrilat) (PEGDA, MW 5.000 g / mol), DPBS kondroitin sülfat-metakrilat (CS-MA) ihtiva eden bir biomimetik hidrojel sentezi. Foto-başlatıcı eklenmesi fotoaktif çapraz bağlanmasını sağlar. Nihai hidrojel bileşimi% 7 tartmak içeriyort / hacim (a / h) PEGDA bölgesinin% 3 CS-MS w / v, ve ışık başlatan a / h% 0.05. <ol><li> Metakrilat grupları ile CS polimerin işlevselleştirilmesiyle CS-MA sentezlemek. <ol><li> MES 1,952 g deiyonize su, 200 ml NaCl 5,84 g (dihidroksi 2 O) eritilmesi ile 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic asit (MES) ve 0.5 M sodyum klorür (NaCl) tamponlu çözeltisi hazırlayın. Tamponlu çözelti içinde kondroitin sülfat, sodyum tuzu, 5 g çözündürülür. </li><li> (: EDC = 1: 2 NHS mol oranı) 0,532 g (4,62 mmol) N-hidroksisüksinimid (NHS) ve 1,771 g (9,24 mmol) 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) -karbodiimid hidroklorür (EDC) ilave 5 dakika boyunca çözeltisi ve bir karıştırma. </li><li> Çözeltisine ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında reaksiyon sıcaklığı (: 2: 1: EDC: AEMA = 1 NHS molar oranı) 0,765 g (4,62 mmol) 2-aminoetil metakrilat (AEMA) ekleyin. </li><li> Diyaliz tüpüne (12-14 kDa&#39;lık bir MWCO) kullanılarak, 4 gün boyunca iyonu giderilmiş suya karşı diyaliz (diH 2 O) karışımın saflaştınlır. </li><li> P Filtre0.22 um&#39;lik bir filtreden urified çözeltisi ve kurutucu ve vakum O / N çözeltisi içeren açık tüpleri. Tüm tüpleri ışıktan korunmasını sağlamak. Nem ve ışıktan korunan -20 ° C &#39;de erimiş polimeri saklayın. </li></ol></li></ol> 3. Hücre Encapsulation <ol><li> (Hücre yüklü 3D hidrojeller yumrukluyor için) PCR film ve silindirik çubuklar Otoklav ve UV ışığı altında doku kültürü kaputu 0,2 um filtrelenmiş% 70 etanol dalma ısmarlama silindirik jel kalıp sterilize edin. </li><li> Hava kabarcıkları veya sızıntıları önlemek için boşluklar olmadan otoklavlanmış PCR film ile jel kalıbın dibine kapatılmalıdır. Steril 150 mm plaka muhafaza ediniz. </li><li> Önceki biomimetic hidrojel hücre kapsülleme günlük, kollajenaz II O / N tedavi ve kollajenaz IV çözümü ile yüksek yoğunluklu kondrosit tek tabaka ayrıştırmaları. Kollajenaz VI, her kondrosit büyüme medya için kollajenaz II için 125 U / ml ve 160 U / ml kullanın37 ° C&#39;de ilave edildi. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp almak ve ilave,% 5 ağırlık / hacim (ağırlık / hacim), poli (etilen glikol diakrilat) (PEGDA, molekül ağırlığı = 5000 g / mol),% 3 w / v kondroitin sülfat-metakrilat (CS-MA) ve DPBS h ışık başlatan /% 0.05 w. Çözüm karıştırmak ve bir kenara tutmak için tüp Vortex. Işıktan tüp koruyun. </li><li> , 50 ml&#39;lik bir Falcon tüpü içine ayrışmış hücreleri toplamak 5 dakika boyunca 460 x g&#39;de santrifüj sayısı ve. Aspire tüm hücreler tüp ortam 15 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir yoğunlukta hücreler yeniden askıya almak için, yukarıda karışık jel maddesi ekleyin. Hava kaçınarak oluşumunu kabarcıklar ise 30 kez iyice karıştırın. </li><li> Pipet 72 özel yapılmış silindirik jel kalıbına hücre hidrojel süspansiyonunun ya da tek başına hidrojel ul ve 5 dakika için 3 mW / m 2 UV ışığı (365 nm dalga boyu) maruz kalma ile jelleşme neden. Hiçbir hücre içeriği ile bazı hidrojel çözüm hazırlayın. Gelecekteki biyokimyasal ve mekanik test için negatif kontrol olarak bu yapıları kullanın. MeasuUV yoğunluğu metre ile UV ışığın yoğunluğuna yeniden. Yoğunluğunu ayarlamak için, UV ışık kaynağı ve jelleşme sırasında hidrojel iskele arasındaki mesafeyi değiştirin. NOT: hidrojel CS içerdiğinden, aselüler katkısı sadece hücresel GAG temsil hücre yüklü hidrojellerin biyokimyasal GAG içeriğinden çıkarılır. </li><li> Kapalı kolay kabuğu için filmi kesmek için bir neşter kullanın ve dikkatlice çıkarın. Silindirik çubuklar yardımıyla, polimerleşmemiş jel ve gevşek hücreler yıkayın steril DPBS 5 ml ile bir 6 yuvalı plaka içine jel üzerinden itin. </li><li> Kültür, her oyuğa kondrosit büyüme ortamı 1,5 ml içeren 24 gözlü levhalar içine, hücre yüklü hidrojeller. Kuyuya yıkanmış hidrojeller aktarmak için tek kullanımlık spatula kullanın. </li><li> Bir canlılık / Sitotoksisite kiti kullanılarak, canlı cansız boyama 24 saat sonrası kapsülleme hücre canlılığını değerlendirmek. Kültür taze kondrosit Gro değişen 3-6 hafta süreyle hücre yüklü hidrojeller ve boş hidrojeller2 günde analizler için hasat öncesi medya wth. </li></ol> 4. RNA Ekstraksiyon ve Gen İfadesi Analizleri <ol><li> Dikkatle medya aspire ve hücre-Ladin yanı sıra boş kontrolü hidrojeller steril PBS 1X koydu. </li><li> Steril bir spatula yardımı ile, temiz bir 1.5 mi Eppendorf tüpüne her hidrojel transferi ve her tüpe Tri-reaktif madde 250 ul ilave edin. RNA izole etmek için üreticinin talimatlarına uyun. </li><li> RNA izolasyonu ve miktar kullanımı her örnekten bunun 1 mcg ve sonra High Capacity cDNA Ters Transkripsiyon Kit kullanılarak cDNA içine ters transkripsiyonu gerçekleştirin. </li><li> Nicel PCR ilgi genlerin ifadesinin incelenmesi için TaqMan Gen İfade Diziler kullanın. GAPDH dahili gen ifadesi düzeylerini normale. </li><li> PCR, aşağıdaki koşullar için bir 10 ardından urasil DNA glikosilaz önceki amplikonları inaktive etmek için 50 ° C&#39;de 2 dakika inkübasyon yer alır60, 95 ° C&#39;de inkübasyon dakika Taq polimerazı aktive etmek için. Daha sonra 95 ° C de 15 sn meydana gelen PCR&#39;nin devre döngüsü gerçekleştirmek ve 60 ° C&#39;de 1 dak. </li></ol> 5. Biyokimyasal analizler <ol><li> Her hücre hidrojel yapıları için DNA ve aşağıdaki gibi sülfatlı glikozaminoglikan (sGAG) üretimini ölçmek. </li><li> Dikkatle medya aspire ve hücre-Ladin yanı sıra boş kontrolü hidrojeller steril PBS 1X koydu. Boş bir tüp tartılır ve kağıt mendil üzerinde kurutma sonra içine hidrojel koymak ve hidrojellerin ağırlığını veya ıslak ağırlığı kaydedin. </li><li> Enzimatik sindirimi için ayrı bir 1.5 mi Eppendorf tüp -20 ° C &#39;de, her bir hidrojel dondurun ve daha sonra (GAG) (DNA) Picogreen deneyi ve Dimetil-Metilen mavisi analizi çalıştırmak için sindirilmiş ürünün bir kısım kullanın. </li><li> Hidrojeller enzimatik sindirimi için papainase çözeltisi hazırlayın. <ol><li> İlk Sodyum fosfata 7.1 g dışarı tartarak PBE tamponu hazırlamake dibazik (Na 2 HPO 4) ve Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu (EDTA-Na2) 1.6 g. , DH 2 O 500 ml çözülür pH 6,5&#39;e ayarlanır ve 0.22 mm&#39;lik bir filtreden filtre saflaştırılmış çözeltisi. </li><li> PBE tamponu, 20 ml L-sistein 0,035 g çözündürülür. Çözüm ve steril papain enzimi 100 ul Filtre. </li></ol></li><li> Hazır deneyleri gerçekleştirmek için zaman, -20 ° C ila tüpleri alıp dondurulmuş hidrojellere hazır papain çözüm 300 ul ekleyin. Bir havanda jel Crush ve motor tokmak ile iyice karıştırın. </li><li> Ek papain solüsyonu ile 500 ul hacim kazandırın. Kontrol jeller için aynı prosedürü uygulayın. 16 st 3,9, 60 ° C&#39;de inkübe edin. Sindirilmiş hidrojel ihtiva eden çözelti, dolayısıyla DNA ve GAG ​​ölçümü için kullanılabilir. Üreticinin pr aşağıdaki standart olarak Lambda faj DNA ile Picogreen analizi kullanılarak DNA içeriği ölçünotocol. </li><li> 1,9-dimetilmetilen mavisi (DMMB) standart 10 olarak köpekbalığı kondroitin sülfat ile boya bağlama testi kullanılarak sülfatlı-GAG içeriği ölçmek. İlgili ıslak ağırlık GAG miktarını bölerek GAG içeriği belirler. </li></ol> 6. Mekanik Test <ol><li> 10 N yük hücresi ile donatılmış bir Instron 5944 test sistemi kullanılarak serbest basınç testleri gerçekleştirin. <ol><li> In vitro kültür istenen gün sonra, hücre-hidrojel iskele ve aselüler kontrol hidrojeller sıkıştırma testi gerçekleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında PBS banyosu içinde örnekleri daldırın ve yükleme koşulları altında kıkırdak dokunun yaşadığı fizyolojik suşu itibaren 15,% 11,12 maksimum suşuna 1% streyn / sn bir hızda sıkıştırılması% 10-20 olduğu rapor edilmiştir 13,14. </li></ol></li><li> Üçüncü mertebeden polinom denklem kullanılarak gerilme eğrileri ve eğri uyum vs stres oluşturun. Compr belirleme% 15 suş değerlerinde eğri fit denklemden essive teğet modülü. </li></ol>

<ol>
	<li>Roberts, S., Menage, J., Sandell, L. J., Evans, E. H., Richardson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+study+of+collagen+types+I+and+II+and+procollagen+IIA+in+human+cartilage+repair+tissue+following+autologous+chondrocyte+implantation.">Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation.</a> Knee. 16, 398-404 (2009).</li><li>Smeriglio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Potential+of+Juvenile+and+Adult+Human+Articular+Chondrocytes+for+Cartilage+Tissue+Formation+in+Three-Dimensional+Biomimetic+Hydrogels.">Comparative Potential of Juvenile and Adult Human Articular Chondrocytes for Cartilage Tissue Formation in Three-Dimensional Biomimetic Hydrogels.</a> Tissue engineering. Part A. , (2014).</li><li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels.">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Scientific reports. 3, 3553 (2013).</li><li>Taipale, J., Keski-Oja, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+in+the+extracellular+matrix.">Growth factors in the extracellular matrix.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11, 51-59 (1997).</li><li>Varghese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulfate+based+niches+for+chondrogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Chondroitin sulfate based niches for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Matrix Biol. 27, 12-21 (2008).</li><li>Park, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+matrix+stiffness+on+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+in+response+to+TGF-beta.">The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-beta.</a> Biomaterials. 32, 3921-3930 (2011).</li><li>Wang, T., Lai, J. H., Han, L. H., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stromal+Cells+in+Combinatorial+Hydrogels+Containing+Cartilage+Matrix+Proteins+with+Decoupled+Mechanical+Stiffness.">Chondrogenic Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells in Combinatorial Hydrogels Containing Cartilage Matrix Proteins with Decoupled Mechanical Stiffness.</a> Tissue engineering. Part A. , (2014).</li><li>Smith, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intermittent+hydrostatic+pressure+and+BMP-2+on+osteoarthritic+human+chondrocyte+metabolism+in+vitro.">Effects of intermittent hydrostatic pressure and BMP-2 on osteoarthritic human chondrocyte metabolism in vitro.</a> J Orthop Res. 29, 361-368 (2011).</li><li>Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Kimura, J. H., Hunziker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+in+agarose+culture+synthesize+a+mechanically+functional+extracellular+matrix.">Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix.</a> J Orthop Res. 10, 745-758 (1992).</li><li>Farndale, R. W., Buttle, D. J., Barrett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+quantitation+and+discrimination+of+sulphated+glycosaminoglycans+by+use+of+dimethylmethylene+blue.">Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue.</a> Biochim Biophys Acta. 883, 173-177 (1986).</li><li>Lai, J. H., Levenston, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meniscus+and+cartilage+exhibit+distinct+intra-tissue+strain+distributions+under+unconfined+compression.">Meniscus and cartilage exhibit distinct intra-tissue strain distributions under unconfined compression.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 18, 1291-1299 (2010).</li><li>Li, L. P., Buschmann, M. D., Shirazi-Adl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-rate+dependent+stiffness+of+articular+cartilage+in+unconfined+compression.">Strain-rate dependent stiffness of articular cartilage in unconfined compression.</a> Journal of biomechanical engineering. 125, 161-168 (2003).</li><li>Armstrong, C. G., Bahrani, A. S., Gardner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+measurement+of+articular+cartilage+deformations+in+the+intact+human+hip+joint+under+load.">In vitro measurement of articular cartilage deformations in the intact human hip joint under load.</a> The Journal of bone and joint surgery. American. 61, 744-755 (1979).</li><li>Macirowski, T., Tepic, S., Mann, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+stresses+in+the+human+hip+joint.">Cartilage stresses in the human hip joint.</a> Journal of biomechanical engineering. 116, 10-18 (1994).</li><li>Benya, P. D., Shaffer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+chondrocytes+reexpress+the+differentiated+collagen+phenotype+when+cultured+in+agarose+gels.">Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels.</a> Cell. 30, 215-224 (1982).</li><li>Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage:+tissue+design+and+chondrocyte-matrix+interactions.">Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions.</a> Instructional course lectures. 47, 477-486 (1998).</li><li>Wang, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+chondroitin+sulphate+for+cartilage+tissue-biomaterial+integration.">Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration.</a> Nat Mater. 6, 385-392 (2007).</li><li>Simson, J. A., Strehin, I. A., Allen, B. W., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bonding+and+fusion+of+meniscus+fibrocartilage+using+a+novel+chondroitin+sulfate+bone+marrow+tissue+adhesive.">Bonding and fusion of meniscus fibrocartilage using a novel chondroitin sulfate bone marrow tissue adhesive.</a> Tissue engineering. Part A. 19, 1843-1851 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokolde bildirildiği gibi, 3D hidrojeller genellikle tek tabakalı kültürler 15 ile karşılaştı fibrocartilage hücrelerine hücre dediferansiyasyon süreci kaçınarak, kültürde kondrosit fenotipi muhafaza edebiliyoruz. Ayrıca, hidrojel yapısının chondrocytes- uzun süreli kültürleri yaş ve hastalık ile ilişkili içsel hücre özelliklerini korumaktadır elverişli bir ortam ortaya koymuştur. 3B biomimetik hidrojel kullanılması birçok avantaj vardır. İlk olarak, kondroitin sülfat dahil (CS), eklem kıkırdağının içinde bulunan başlıca bir komponent, kondroitinaz salgılayarak hidrojel matrisi bozan ve ekstra hücresel matris 5, 16 yeni sentezlenmiş kıkırdak bırakmaya hücreleri sağlar. Buna ek olarak, CS gösterilmiştir artritik eklem anti-inflamatuar özelliklere sahip. Biomimetik hidrojel kıkırdak tamir hücre dağıtımı için bir iskele malzemesi olarak kullanılabilir, ve kimyasal olarak modifiye edilebilirDaha iyi doku biyomalzeme entegrasyon 17,18 kolaylaştırmak için. PEG-CS hidrojellerin kullanımı, uzun süreli kondrositlerin kültürleri ve biyokimyasal ve mekanik özelliklerinin değerlendirilmesine olanak verir. İşte biz bu platformu kıkırdak mühendisliği için en uygun hücre tipini tanımlamak amacıyla farklılaştırılmış kondrosit çeşitli kaynaklardan karşılaştırmalı analizler için yararlı olabilir nasıl gösterir. İlginçtir, hidrojeller kapsüllü kondrositlere kendi içsel yeteneklerine göre canlı kalır ve çoğalır. Hidrojel bileşimi destekleri, aslında, sağlıklı genç ve erişkin kondrositlerin büyümesi Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi. Açıklanan hidrojel bileşimi ve yapısı da kıkırdak doku formasyonunu teşvik glikozaminoglikan ile değerlendirilen fonksiyonel hücre dışı matris birikimi (GAG ile gösterildiği gibi ) ölçümü. Buluşun bir başka avantajı, kondrosit hidrojel yapıları olanYeni oluşan kıkırdak dokusunun mekanik özellikleri için değerlendirilebilir. Serbest basınç testi karşılaştırma için aselüler hidrojel yapılmalıdır unutmayın. Hidrojeller, aslında, bağlı CS parçalarının sertliği için temel bir sertliğe sahiptir. (Bir gerilme oranı / s% 1 at)% 5-20 serbest basınç gerilme yükleme koşulları altında kıkırdak dokusu yaşadığı fizyolojik zorlanma beri kıkırdak dokusunun 11,12 mekanik testler için uygulanabilir 10-20 olduğu rapor edilmiştir % 13,14. Mekanik test hücre yüklü ve hücresel olmayan iki hidrojellerin tepkisi, kültür son nokta değerlendirilmiştir. Tarif edilen örnekte, OA kıkırdak ihtiva eden konstruktların düşük katılıkta aksine, yetişkin ve juvenil kondrositlerin ihtiva eden konstruktların benzer bir sertliğe gözlenen, yukarıda. Hücre-hidrojel yapısının bu tür mekanik özellikleri fonksiyonel özelliklerinin değerlendirilmesine olanakHücre olgunlaşma yeteneği derinlemesine analizini veren oluşturulan doku. Sonuç olarak, kıkırdak doku üretmek için farklı bir kondrosit nüfusun potansiyel çalışma 3D biomimetik hidrojellerin kullanımı yaygın olarak uygulanabilir. Burada tarif edilen in vitro çalışmaların yanısıra hücre-yüklü yapıları in vivo nakli fizyolojik bağlamda hücre olgunlaşmasını ve rejeneratif potansiyel çalışma tasavvur edilebilir. Ek biomimetik faktörlerle hidrojel platformun bundan başka değişiklikleri de, kondrosit çoğalmasını ve olgunlaşmasını optimize etmek için tasavvur edilebilir.

With its limited self-repair potential, human articular cartilage undergoes frequent irreversible damages. Extensive efforts are currently focused on the development of efficient cell-based approaches for treatment of articular cartilage injuries. The success of these cell-based therapies is highly dependent on the selection of an optimal cell source and the maintenance of its regenerative potential. Chondrocytes are a common cell source for cartilage repair, but they are limited in supply and can de-differentiate during in vitro expansion in 2D monolayer culture thereby limiting their generation of hyaline cartilage 1. 
The aim of this protocol is to establish a 3-dimensional hydrogel platform for an in vitro comparative study of human chondrocytes from different ages and disease state. Unlike conventional two-dimensional (2D) culture, three-dimensional (3D) hydrogels allow chondrocytes to maintain their morphology and phenotype and provides a physiologically relevant environment enabling chondrocytes to produce cartilage tissue 2,3. In addition to providing a 3D physical structure for chondrocyte culture, hydrogels mimic the function of native cartilage extracellular matrix (ECM). Specifically, the inclusion of chondroitin sulfate methacrylate provides a potential reservoir for secreted paracrine factors 4 and enables cell-mediated degradation and matrix turnover 5. Although many 3D hydrogel culture systems have been utilized widely in various studies including agarose and alginate gels, we have used a biomimetic 3D culture system that has some distinct advantages for chondrocyte culture. Chondroitin sulfate (CS) is an abundant component in articular cartilage and the PEG-CS hydrogels have been shown to maintain and even enhance chondrogenic phenotype and facilitate cell-mediated matrix degradation and turnover 2,5. In addition, the mechanical properties of the hydrogel scaffold can be easily modulated by changing concentration of PEG and hence can be utilized to further enhance the regeneration potential of chondrocytes or a related cell type 6,7. PEG/CSMA is also biocompatible and hence has the potential for a direct clinical application in cartilage defects for example. The limitation for this system is its complexity and the use of photopolymerization that can potentially affect cell viability as compared to simpler systems like agarose, however the advantages for the chondrocyte culture outweigh the potential limitations.
The 3D hydrogel culture is compatible with conventional assay for evaluation of cell phenotype (gene expression, protein immunostaining) and functional outcome (quantification of cartilage matrix production, mechanical testing). This favorable 3D environment was tested to compare the tissue regeneration potential of human chondrocytes from three different aged populations in long-term 3D cultures. 
The outcomes were evaluated via both phenotypic and functional assays. Juvenile, adult and OA chondrocytes showed differential responses in the 3D biomimetic hydrogel culture. After 3 and 6 weeks, chondrogenic gene expression was upregulated in juvenile and adult chondrocytes but was downregulated in OA chondrocytes. Deposition of cartilage tissue components including aggrecan, type II collagen, and glycosaminoglycan (GAG) was high for juvenile and adult chondrocytes but not for OA chondrocytes. The compressive moduli of the resulting cartilage constructs also exhibited similar trends. In conclusion, both juvenile and adult chondrocytes exhibited chondrogenic and cartilage matrix disposition up to 6 weeks of 3D culture in hydrogels. In contrast, osteoarthritic chondrocytes revealed a loss of cartilage phenotype and minimal ability to generate robust cartilage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>juvenile chondrocytes (Clonetics&#8482; Normal Human Chondrocyte Cell System )</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adult chondrocytes (Clonetics&#8482; Normal Human Chondrocyte Cell System)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(ethylene glycol diacrylate)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>ACRL-PEG-ACRL-1000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-morpholinoethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photoinitiator</td>
			<td>Irgacure&#160;</td>
			<td align="right">2959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chondroitin sulfate sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-aminoethyl methacrylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing</td>
			<td>Spectrum Laboratories&#160;</td>
			<td align="right">132700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 4</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>HyClone, Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SH3002301&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>live/dead assay</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L3224">L3224</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT&#8482; PicoGreen&#174; dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P11496">P11496</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,9-dimethylmethylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">341088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light equipment - XX-15LW Bench Lamp, 365nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0042-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instron 5944 testing system&#160;</td>
			<td>Instron Corporation</td>
			<td>E5940</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d hydrogel scaffolds for articular chondrocyte culture and cartilage generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

PEG ve CS kısımları (Şekil 1) içeren biyoaktif hidrojeller insan mafsal kondrositleri 2,3,5,7 kültür ve olgunlaşması için ideal bir platform oluşturmaktadır. Farklı yaşlarda ve hastalık durumlarından Kondrositler tarif edilen yöntem ile kültürlendi ve fenotipi, gen ekspresyonu ve oluşturulan kıkırdak dokusunun biyokimyasal ve mekanik özellikleri için analiz edilebilir. Üç kondrosit örnekleri juvenile- 6 ay, bireylerde erişkin 34 yaş ve osteoarthritic- 74 yaşında, 3D biomimetik hidrojeller kültür 3 hafta sonra hasat edilmiştir. Gen ekspresyonu, normal kondrosit, çocuk ve yetişkin hem analizleri kondrosit genleri Col2a1 ve Col6a1 ekspresyonunda bir artış göstermiştir. Col6a1 (Şekil 2) ekspresyonunu sürdürmek uygun bir biomimetik ortamda kültürlenen olmasına rağmen kondrojenik fenotipinin kaybı gösterirken Aksine, hastalıklı kondrositler Col2a1 dramatik bir azalma olduğunu gösterdi. CS-PEG hidrojeller de kondrositler çoğalmaya için dinamik bir ortam olarak hizmet PEG ve CS önceden var olan matris sindirimi ve hücre etrafındaki ve hücre dışı matris olgun kıkırdak dokusunun başlıca bileşenleri bırakır. In vitro kültür 3 hafta sonra, kondrosit genişlemesi, bu özellikler göz önüne alındığında Picogreen boyası ile DNA miktarının ölçülmesi ile tahmin edilebilir. Hücreler üç grup karşılaştırmalı analizi OA kondrositler kültür 1 gün ile karşılaştırıldığında dramatik bir düşüş sergiledi ise çocuk ve yetişkin nüfusun hücre yoğunluğu değişmeden olduğunu göstermektedir. DNA içeriğinin kaybı aynı zamanda uzun dönemli kültür (Şekil 3) sırasında mümkün hücre ölümünü destek veren kondrositler OA için değil gözlenmiştir. Salgılanmış matris kültürlerin 3 hafta sonra bitiş noktası aşamasında DMMB boya bağlama deneyi ile sülfatlanmış-GAG içeriği olarak belirlendi. GAG içeriği recor olarak hidrojel yaş ağırlık normalize edilmektedirded enzimatik sindirim ve aselüler katkı önce çıkarılır. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, kondrositler 3D hidrojeller kültür 3 hafta boyunca GAG benzer bir önemli miktarda biriken. Fiziksel iskele varlığı serbest basınç deneyleri 2,3 ile numunelerin biyomekanik özelliklerinin değerlendirilmesine olanak verir. Hücresel olmayan hidrojeller basınç modüllerden bir azalma olur ise, hücreye yüklü yapılar Kültürde 3 hafta (Şekil 4) daha sonra sıkıştırma modülünü muhafaza. Fenotipik, burada açıklanan biyokimyasal ve biyomekanik analizler değerlendirilmesi ve mühendislik kıkırdak için farklı kondrosit popülasyonlarının potansiyelini anlamak için, bu nedenle yararlıdır. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig1.jpg" /> 3D kondrosit cul 1. PEG-CS biomimetic hidrojeller ŞekilTure. Kondrositler poli (etilen glikol diakrilat) (PEGDA) ve kondroitin sülfat-metakrilat (CS-MA) ve ısmarlama silindirik jel kalıbına dökülmüş ihtiva eden bir karışım içinde tekrar süspanse edilir. UV ışınlarına maruz sonra, jeller kalıplardan toplanır ve hücre canlılığı, canlı cansız boyanma 24 saat sonrası kapsülleme değerlendirilir katılaştı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53085/53085fig2.jpg" /> Şekil 3D biomimetik hidrojeller kültürlenmiş insan kondrositlerde kondrojenik genlerin 2. ifadesi. 3B biomimetik hidrojeller kültür 3 hafta sonra genç, yetişkin ve OA kondrositler tarafından kıkırdak belirteçleri Col2a1 ve Col6a1 nicel gen ekspresyonu. Değerler gün 1. Hata b gen ifade düzeyine normalize edilmişars ortalama ± SD temsil etmektedir. p *, &lt;iki kuyruklu Student t testi ile tespit edildiği üzere 0.05. Smeriglio ark modifiye. 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53085/53085fig3.jpg" /> 3D biomimetic Hidrojellerde kültürlü insan kondrositlerde Şekil 3. DNA içeriği. 3D biomimetic hidrojellerin kültür 3 hafta sonra çocuk, yetişkin ve OA kondrositlerinde Picogreen testi ile DNA miktar tayini. Değerler gün 1&#39;de DNA düzeyinde normalize <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig3large.jpg" target="_blank">edilir, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53085/53085fig4.jpg" /> &lt;br /&gt; Şekil 4. GAG içerik ölçümü ve 1. günde ve 3D biomimetic hidrojeller kültür 3 hafta sonra insan kondrosit serbest basınç testi. 1. günde kondrositlerde ve kültür 3 hafta sonra DMMB deneyi ile (A) GAG miktar 3D biomimetic hidrojeller. Değerler ağırlığı (ww) ıslak normalize ve ug / g olarak ifade edilmiştir. 1. günde ve 3D biomimetic hidrojeller kültür 3 hafta sonra asellüler ve hücre yüklü hidrojellerin (B) Basınç modülü (kPa). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig4large.jpg" target="_blank">Görüntülemek için tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonu.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation at JoVE.com

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

Eklem Kondrosit Kültür ve Kıkırdak Üretimi için 3D hidrojel iskeleleri

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

3d-hydrogel-scaffolds-for-articular-chondrocyte-culture-cartilage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.8K Görüntüleme.  Stanford University. Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes. 