עבודה זו נתמכה על ידי החברה המלכותית URF מענק UF051616, בריטניה המועצה האירופית למחקר STG מענק 243,261 ל BS. עבודה ב MZ המעבדה נתמך גם על ידי המכון לרפואה של קליפורניה הרגנרציה מענק RB1-01417.

1. אבי עצבית בתא בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח מוחות שלמים מ-E14 16 עכברים ומכניסים בינוני DMEM/F12 קר הבסיס. הסר את כל קרום המוח מתחת למיקרוסקופ אנטומית המוח להעביר לתוך צלחת פטרי 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מלקחיים עדינים כדי לנתק באופן מכני המוח לרסיסים רקמות ולהעבירם צינור 15 מ&quot;ל, ואז סרכזת דגימות בסל&quot;ד 800 דקות 3 כדי להסיר שאריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DMEM/F12 bFGF המכיל ו EGF ו triturate עם פיפטה 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת התא לקבל השעיה תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הצלחת לתוך צלוחיות ב 2-5 x 10 4 תאים למ&quot;ל, ולאחר מכן לבצע בינוני מלא לשנות כל 3 ימים ומעבר התאים כל 6 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי לפחות 5 קטעים, תקציר neurospheres לתאים בודדים באמצעות טריפסין ו EDTA ולגדול על חדרי electrotactic poly-D-lysine/laminin-coated (מוכן כמפורט להלן ב 2). השתמש בינוני הולך וגדל המכיל N2, תוספת,bFGF ו EGF כל הזמן כדי לשמור על המאפיינים של NPCs. </li></ol> 2. הכנת החדר electrotactic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 22 x 11 מ&quot;מ רצועות של זכוכית על ידי חלוקת autoclaved 22 x 22 מ&quot;מ עובי מס &#39;1 coverslips במחצית באמצעות עט היהלומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת זכוכית חינם עומד גם ממדים פנימיים 22 x 10 מ&quot;מ על ידי הדבקה 4 יחד אנכי עומד 22 x 11 מ&quot;מ עם רצועות שומן ואקום גבוה סיליקון. אפשר בארות לחלוטין יבשים להקשות לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לצרף שני 22 x 11 מ&quot;מ זכוכית רצועות, מקבילים זה לזה שעזב פער של 10 מ&quot;מ, על בסיס הצלחת התרבות 100 מ&quot;מ באמצעות גריז סיליקון. לאטום את האזור שבין רצועות אלה על ידי הנחת 22 x 22 מ&quot;מ מכסה תלוש בסוף כל המצורפת בתחתית צלחת עם שמן משלושה צדדים, אבל לא כל כך קרוב למרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכוס מוכן היטב בשלב 2.2 על העטיפה מחליק כך הקירות הפנימיים ליצור מקום מוקף עבור זריעהאת התאים על גבי החלק התחתון של הצלחת. מים הוכחה כל המפרקים עם שמן סיליקון. מעיל זה אזור מוגבל ברצף עם פולי-D-ליזין ואז laminin: להוסיף 1 מ&quot;ל פולי-D-ליזין לחדר ולהשאיר 5 דקות כדי לאפשר פולי-D-ליזין להיקשר בתחתית הצלחת, לשטוף את החדר עם סטרילית PBS פעמיים, ואז לדלל laminin ב סטרילית PBS להניב 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ולהשתמש בו כדי לכסות את תחתית הצלחת. השאירו בטמפרטורת החדר במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, תאים הקציר ולהכין 1 מ&quot;ל של תרחיף המכיל 1 x 104 תאים. הסר laminin מכוס טוב, זה מאפשר לאוורר יבש לחלוטין, ולהחליף עם 1 מ&quot;ל של תרחיף תאים. מניחים את צלחת בחממה על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 4 שעות כדי לאפשר המצורף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאים confluent מספיק להסיר את כל אמצעי מן החדר. מוציאים בזהירות את הכוס היטב. להקים גג מעל התאים על ידי הצמדת בקפידה, עם שמן סיליקון, autoclaved 22 x 22 מ&quot;מ זכוכית coverslipגישור בין שתי 22 x 11 מ&quot;מ רצועות. לכסות את התאים עם כמה טיפות של המדיום, כדי למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור מאגר בינוני בודד בכל צד של החדר על ידי יצירת שני האטומים למים מחסומים סיליקון גריז הפועלים מקצה אחד של מאכל ועד קצהו, על גג החדר. למלא את החדר עם מדיום חדש, על מנת להבטיח זרימה דרך מהמאגר 1 בינוני לאחר. להחזיר את התבשיל כדי בחממה במשך 12 שעות כדי לאפשר התאוששות התא. </li></ol> 3. היישום של שדה חשמלי לתא electrotactic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המכסה כדי לכסות את המנה באמצעות קידוח שני חורים, אחד ממוקם מעל כל המאגר של החדר ההגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את כל אמצעי בתא עם המדיום תרבות המכיל 25 מ&quot;מ חיץ HEPES ולהעביר את המנה למערכת טמפרטורה מבוקרת הדמיה. להגדיר את הפרמטרים של הניסוי מעידה, זמן רב בעמדה ההקלטה. יישר את החדר כך הקתודה לבין האנודה הםעל ימין ועל שמאל, בהתאמה, על מנת להבטיח כי וקטור EF פועל בצורה אופקית לראות את המיקרוסקופ והקליט במערכת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו שתי כוסות עם הפתרון של שטיינברג (58 mM NaCl, KCl mM 0.67, 0.44 mM Ca (NO 3) 2 0.4 H 2 0, 1.3 mM MgSO 4 0.7 H 2 0 ו 4.6 mM Trizma בסיס, pH 7.4). חבר כוס נפרדת למאגר אחד בינוני באמצעות מוכנות מראש גשרים זכוכית (צינורות זכוכית ~~~HEAD=NNS 13 ס&quot;מ ארוכים ~ 3 מ&quot;מ קוטר, והתכופף לצורת פרסה על ידי חימום להבה בונזן), מלאים 2% (w / v) Steinberg&#39;s-אגר פתרון, עובר דרך החורים במכסה. להשלים את מעגל חשמלי על ידי הנחת Ag / AgCl אלקטרודות המחוברות לספק כוח DC לתוך הכוס כל פתרון של שטיינברג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת חיוג המתח החשמלי בספק הכוח 0 ולעבור הלאה. למדוד את המתח על פני החדר electrotactic בזמן מפנה את החיוג מתח, באמצעות מד מתח, ולהתאים בהתאם לדרישות הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל זמן לשגות הקלטה. לבצע שינוי בינוני להתאים מחדש את המתח, כנדרש, כל שעה. בינוני טרי, תרופות, או חומרים כימיים ניתן להוסיף את מאגרי כנדרש. כאשר מבצעים שינוי בינוני, שתי אפשרויות ניתן לראות להלן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשרות מס &#39;1 - כדי להשהות את ההקלטה זמן לשגות באופן זמני, להסיר בזהירות גשרים זכוכית מחדר להימנע מביך מכסה כיסוי, השתמש עיקור פיפטה פסטר בעדינות להחליף את כל בינוני עם בינוני טרי לשים את הגשרים זכוכית בחזרה, ואז לחדש את ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשרות מס &#39;2 - לחילופין, בהתאמה אישית המכסה מכסה עם 4 חורים (2 ממוקם מעל כל המאגר של החדר הגירה) יכול לשמש גם לצורך שינוי בינוני. שניים חיבור גשרים זכוכית, השניים האחרים לשינוי בינוני. אפשרות 2 מאפשר הקלטה רציפה ללא הפרעות במהלך שינוי בינוני. </li></ol></li></ol> 4. הכנת פרוסת חוט השדרה organotypic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח lumbar מיתרי השדרה מתוך 2 בשבוע C57 BL / 6 עכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים מיתרי השדרה לתוך 500 מיקרומטר חלקים עבים עם המסוק רקמות McIlwain. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות נפרדות תחת מיקרוסקופ אנטומיים בחר פרוסות עם מבנה sagittal / צירית ללא פגע בעמוד השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת פרוסות בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ המכילים 30 Matrigel μl ומניחים אותם קרוב למרכז ככל האפשר ולשמור אותם 5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות עד חלבונים Matrigel עצמית להרכיב לייצר סרט דק המכסה את פני השטח של הפרוסה חוט השדרה. חשוב מאוד לוודא כי Matrigel כבר התאספו לחלוטין, דגירה צלחת פטרי על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות אחר במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4-6 מ&quot;ל DMEM/F-12 בינוני המכיל 25 HEPES mM חיץ% 15-20 העובר סרום עגלים בעדינות רבה כדי למנוע זרימת אמצעי ישירות על גבי פרוסה. להבטיח את הפרוסה לא שקוע לגמרי בכל מדיום, ומשאיר את פני השטח של explants חשוף היטבאת האוויר. שנה בינונית פעמיים בשבוע. </li></ol> 5. הזרקת Hoechst 33342 NPCs שכותרתו לתוך פרוסת חוט השדרה organotypic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את ההשעיה NPC ב 1 × 10 6 תאים / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מראש דגירה ההשעיה תא בינוני עם 5 מיקרומטר Hoechst 33342 למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שפופרת זכוכית כדי microinject נימי 2 μl ההשעיה לתוך פרוסת חוט השדרה אט אט תחת מיקרוסקופ. ודא שפופרת זכוכית נימי עובר matrigel (חלק ורוד מתחת למיקרוסקופ) ולהגיע אל הצד הפנימי של פרוסת חוט השדרה (רקמה אפור תחת מיקרוסקופ), להישאר בתוך פרוסת חוט השדרה לפחות 30 שניות כדי להימנע מהשעיית תא לדרוס. שים את צלחת פטרי שמכילה פרוסת חוט השדרה לתוך אינקובטור (37 ° C 5% CO 2) ולהשאיר אותה במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, החל EF של mV 500 / מ&quot;מ עד פרוסת חוט השדרה המכיל Hoechst 33,342 שכותרתו NPCs בחדר electrotactic (באמצעות השיטות המתוארות3). </li></ol> 6. נציג תוצאות כאשר NPCs נחשפו למגוון של EFS פיזיולוגיים הם הראו נדידת תאים מכוונת מאוד לכיוון הקתודה (איור 1). תצפית זאת נעשתה גם ברמת תא בודד על פרוסת organotypic השדרה מודל כבל vivo לשעבר, חיקוי סביבת 3D בתנאים ב vivo (איור 2). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig1.jpg" /> באיור 1. NPCs להראות הגירה ביים ב EFS. מחשבים הראו הגירה מכוונת מאוד לכיוון הקתודה בעת חשיפה EFS, קווים אדומים וחצים כחולים מייצגים מסלולים ואת כיוון התנועה (תא). B מראה נתיבי הנדידה של NPCs. בר: 50 מיקרומטר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig2.jpg" /> איור 2. NPCs המושתלים להראות הגירה מכוונת הקתודה ב פרוסת חוט השדרה organotypic </strong&gt;. (א) שכותרתו NPCs עם Hoechst 33342 הושתלו פרוסת חוט השדרה organotypic בנקודת המוצא של הטיפול EF. NPCs היגרו directionally לכיוון הקתודה עבור 2.5 שעות, ובשלב הקוטביות EF התהפכה (ב &#39;). שינוי הקוטביות EF מופעלות היפוך חד של electrotaxis לכיוון הקתודה חדש (C). (ד &#39;) תמונה של NPCs המושתלים בתוך פרוסת חוט השדרה בסוף הקלטת זמן לשגות. (ה) שחזור 3D של NPCs המושתלים בתוך פרוסת חוט השדרה. סעיפים סריקה 3D היו 300 מיקרומטר עובי, החל מאמצע ועד למטה של ​​הפרוסה. קווים מקווקווים מציינים את המיקומים היחסיים של אותה אוכלוסיה של התאים המושתלים בראשית, היפוך, ונקודות קצה של הטיפול (EF - C, בהתאמה). ראשי החצים מצביעים על אוכלוסייה דומה של Hoechst 33342 NPCs המסומנים. בר: 50 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+with+electric+potential.">Wound healing with electric potential.</a> N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).</li><li>McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+cell+behavior+electrically:+current+views+and+future+potential.">Controlling cell behavior electrically: current views and future potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).</li><li>Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+and+persistent+electrical+currents+enter+the+transected+lamprey+spinal+cord.">Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord.</a> PNAS. 77, 1209-1209 (1980).</li><li>Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillating+field+stimulation+for+complete+spinal+cord+injury+in+humans:+a+phase+1+trial.">Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial.</a> J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).</li><li>Zhao, M., Song, B., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-gamma+and+PTEN.">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN.</a> Nature. 442, 457-457 (2006).</li><li>Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+applied+electric+fields+guide+migration+of+hippocampal+neurons.">Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons.</a> J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).</li><li>Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct-current+electrical+field+guides+neuronal+stem&#47;progenitor+cell+migration.">Direct-current electrical field guides neuronal stem&#47;progenitor cell migration.</a> Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).</li><li>Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors.">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice:+significance+for+cell+transplantation+therapy.">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li><li>Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice:+significance+for+cell+transplantation+therapy.">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li><li>Song, B., Gu, Y., Pu, j. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo.">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

הפרוטוקולים בהם אנו משתמשים מתבססים על מחקרים קודמים 5,11. התנאים הנוכחיים באמצעות שיטות אלה, תרבות יציבה חשמלי יכול להישמר תוך יישום EF באמצעות גשרים אגר, הפתרון של שטיינברג, ו Ag / AgCl, אלקטרודות לתאי או פרוסות בתרבית תאים electrotactic אישית מעוצבת של ממדים סטנדרטיים ומ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> FGF-בסיסי אנושי רקומביננטי </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td><td> 20 ng / mL </td></tr><tr><td> EGF רקומביננטי אנושי </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0311 </td><td> 20 ng / mL </td></tr><tr><td> N2-מוסף (100x) נוזלי </td><td> Invitrogen </td><td> 02048 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 בינוני (גלוקוז גבוהות) </td><td> Invitrogen </td><td> 31330-095 </td><td></td></tr><tr><td> פולי-D-ליזין </td><td> Millipore </td><td> A-003-E </td><td></td></tr><tr><td> טבעי העכבר Laminin </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> גורם הגדילה הפחית ממברנה מרתף מטריקס (Matrigel) </td><td> BD Biosciences </TD&gt; <td> 354230 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES חיץ </td><td> Gibco </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> McIlwain המסוק רקמות </td><td> Mickle המעבדה להנדסת Co בע&quot;מ </td><td> TC752-PD </td><td></td></tr><tr><td> Dow Corning גבוהה ואקום סיליקון גריז </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273554 </td><td></td></tr></tbody></table>

electric field-controlled directed migration of neural progenitor cells in 2d and 3d environments

שדות חשמליים אנדוגני (EPS) להתרחש באופן טבעי in vivo ו לשחק תפקיד קריטי במהלך התפתחות רקמות / איברים והתחדשות, כולל זה של 1,2 מערכת העצבים המרכזית. EFS אנדוגניים אלו מופקים על ידי רגולציה הסלולר התחבורה יונית בשילוב עם ההתנגדות החשמלית של תאים ורקמות. זה כבר דווח כי אפלייד EF הטיפול יכול לקדם תיקון התפקודי של פגיעות בעמוד השדרה אצל בעלי חיים ובני אדם 3,4. בפרט, EF מכוונת נדידת תאים הודגמה במגוון רחב של סוגי תאים 5,6, כולל ובתאים עצביים (NPCs) 7,8. יישום ישיר (DC) EFS הנוכחי אינו טכניקה זמין בדרך כלל ברוב המעבדות. תיארנו פרוטוקולים מפורטים עבור היישום של EFS DC ל תאים בתרביות רקמה בעבר 5,11. כאן אנו מציגים הפגנה וידאו של שיטות סטנדרטיות מבוסס על כוח שדה מחושב להקים 2Dד סביבות 3D עבור NPCs, ולחקור התגובות הסלולר לגירוי EF בצמיחה בשני תנאים בודדים תא 2 ד, ו פרוסה organotypic חוט השדרה ב-3D. Cordslice השדרה הוא רקמה הנמען האידיאלי ללימוד NPC לשעבר ב vivo התנהגויות, לאחר השתלה, כי הארגון רקמות cytoarchitectonic נשמר גם בתוך התרבויות הללו 9,10. בנוסף, מודל זה vivo לשעבר גם מאפשר הליכים כי הם לא ריאלי מבחינה טכנית לעקוב אחר תאים in vivo באמצעות זמן לשגות הקלטה ברמת תא בודד. חשוב באופן קריטי על מנת להעריך התנהגויות סלולריים בסביבה לא רק 2D, אלא גם במצב organotypic 3D אשר mimicks בסביבה vivo. מערכת זו תאפשר ברזולוציה גבוהה הדמיה באמצעות זכוכית המבוססים על מאכלים כיסוי ברקמות או איברים עם התרבות מעקב 3D של נדידת תאים אחת במבחנה לשעבר vivo והוא יכול להיות שלב ביניים לפני שעבר אל ב vivo פרדיגמות.

Watch this Scientific Journal Video about Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments at JoVE.com

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

פרוטוקול זה מדגים שיטות להקים סביבות 2 ד ו 3D ב אישית מעוצבת חדרי electrotactic, אשר יכולים לעקוב אחר תאים<em&gt; In vivo / לשעבר vivo</em&gt; באמצעות זמן לשגות הקלטה ברמת תא בודד, על מנת לחקור galvanotaxis / electrotaxis ותגובות סלולריים אחרים לכוון הנוכחי (DC) שדות חשמליים (EPS).

שדה חשמלי מבוקר בימוי הגירה של ובתאים עצביות בסביבות 2 ד ו 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

electric-field-controlled-directed-migration-neural-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.6K Views.  Cardiff University. פרוטוקול זה מדגים שיטות להקים סביבות 2 ד ו 3D ב אישית מעוצבת חדרי electrotactic, אשר יכולים לעקוב אחר תאים In vivo / לשעבר vivo באמצעות זמן לשגות הקלטה ברמת תא בודד, על מנת לחקור galvanotaxis / electrotaxis ותגובות סלולריים אחרים לכוון הנוכחי (DC) שדות חשמליים (EPS).

Video: Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

טיפוח האדם ובתאים עצבית ב Hydrogel עצמית להרכבת 3 מימדי פפטיד

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

עור 2D and 3D שיפור<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלים שימוש להצטופפות מולקולארית

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor cells have to cross anatomical barriers to invade and migrate through the surrounding tissue in order to reach blood or lymphatic vessels. This requires the interaction between cells and the extracellular matrix (ECM). At the cellular level, many cells, including the majority of cancer cells, are able to form invadosomes, which are F-actin-based structures capable of degrading ECM. Invadosomes are protrusive actin structures that recruit and activate matrix metalloproteinases (MMPs). The molecular composition, density, organization, and stiffness of the ECM are crucial in regulating invadosome formation and activation. In vitro, a gelatin assay is the standard assay used to observe and quantify invadosome degradation activity. However, gelatin, which is denatured collagen I, is not a physiological matrix element. A novel assay using type I collagen fibrils was developed and used to demonstrate that this physiological matrix is a potent inducer of invadosomes. Invadosomes that form along the collagen fibrils are known as linear invadosomes due to their linear organization on the fibers. Moreover, molecular analysis of linear invadosomes showed that the discoidin domain receptor 1 (DDR1) is the receptor involved in their formation. These data clearly demonstrate the importance of using a physiologically relevant matrix in order to understand the complex interactions between cells and the ECM.

This protocol describes how to prepare a 2D mixed matrix, consisting of gelatin and collagen I, and a 3D collagen I plug to study linear invadosomes. These protocols allow for the study of linear invadosome formation, matrix degradation activity, and the invasion capabilities of primary cells and cancer cell lines.

2D ו 3D מטריצות לחקר Invadosome לינארי גיבוש ופעילות

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

שיפור תרבויות הידרוג 3D של תאי גליה העיקרי עבור במבחנה דוגמנות של Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

מניפולציה של תאי גזע עצביים יחיד ונוירונים בפרוסות מוח באמצעות Microinjection רובוטי

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...

Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell culture system that was used for a long-term cell differentiation study using microscopy. The microfluidic system consists of the following major components: an optically transparent electrotactic chip, a transparent indium-tin-oxide (ITO) heater, a culture media-filling pump, an electrical power supply, a high-frequency power amplifier, an EF multiplexer, a programmable X-Y-Z motorized stage, and an inverted phase-contrast microscope equipped with a digital camera. The microfluidic system is beneficial in simplifying the overall experimental setup and, in turn, the reagent and sample consumption. This work involves the differentiation of neural stem and progenitor cells (NPCs) induced by direct current (DC) pulse stimulation. In the stem cell maintenance medium, the mouse NPCs (mNPCs) differentiated into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes after the DC pulse stimulation. The results suggest that simple DC pulse treatment could control the fate of mNPCs and could be used to develop therapeutic strategies for nervous system disorders. The system can be used for cell culture in multiple channels, for long-term EF stimulation, for cell morphological observation, and for automatic time-lapse image acquisition. This microfluidic system not only shortens the required experimental time, but also increases the accuracy of control on the microenvironment.

In this study, we present a protocol for the differentiation of neural stem and progenitor cells (NPCs) solely induced by direct current (DC) pulse stimulation in a microfluidic system.

בידול תאי קודמן עצבי הנגרמת על ידי שדה חשמלי בהתקנים מיקרופלואידיים

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

התקני שדה חשמליים ומגנטיים לגירוי רקמות ביולוגיות

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...