The authors wish to thank Drs. Sung-wan An and Mike O&#8217;Donnell for practical advice on establishing this assay, Dr. Chih-Jen Cheng for helpful discussions on the use of ion-specific electrodes, and Dr. Chou-Long Huang for his mentorship and support. This work was supported by the National Institutes of Health (K08DK091316 to ARR) and the American Society of Nephrology Gottschalk Award to ARR.

<ol>
	<li>Ramsay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Transport+of+Water+by+the+Malpighian+Tubules+of+the+Stick+Insect,+Dixippus-Morosus+(Orthoptera,+Phasmidae).">Active Transport of Water by the Malpighian Tubules of the Stick Insect, Dixippus-Morosus (Orthoptera, Phasmidae).</a> J Exp Biol. 31, 104-113 (1954).</li><li>Dow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+malpighian+tubules+of+Drosophila+melanogaster:+a+novel+phenotype+for+studies+of+fluid+secretion+and+its+control.">The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control.</a> J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+domains+are+specified+to+single-cell+resolution+in+a+Drosophila+epithelium.">Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 5207-5212 (1997).</li><li>Rosay, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+calcium+signalling+in+a+Drosophila+epithelium.">Cell-type specific calcium signalling in a Drosophila epithelium.</a> J Cell Sci. 110 (15), 1683-1692 (1997).</li><li>Dow, J. T., Davies, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+physiology+and+functional+genomics+of+epithelial+function+in+a+genetic+model+organism.">Integrative physiology and functional genomics of epithelial function in a genetic model organism.</a> Physiol Rev. 83, 687-729 (2003).</li><li>Beyenbach, K. W., Skaer, H., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental,+molecular,+and+transport+biology+of+Malpighian+tubules.">The developmental, molecular, and transport biology of Malpighian tubules.</a> Annu Rev Entomol. 55, 351-374 (2010).</li><li>Donnell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonally+controlled+chloride+movement+across+Drosophila+tubules+is+via+ion+channels+in+stellate+cells.">Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells.</a> Am J Physiol. 274, 1039-1049 (1998).</li><li>Linton, S. M., O'Donnell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+K+:Cl-+cotransport+and+Na+/K+-ATPase+to+basolateral+ion+transport+in+malpighian+tubules+of+Drosophila+melanogaster.">Contributions of K+:Cl- cotransport and Na+/K+-ATPase to basolateral ion transport in malpighian tubules of Drosophila melanogaster.</a> J Exp Biol. 202, 1561-1570 (1999).</li><li>Rheault, M. R., O'Donnell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+epithelial+K(+)+transport+in+Malpighian+tubules+of+Drosophila+melanogaster:+evidence+for+spatial+and+temporal+heterogeneity.">Analysis of epithelial K(+) transport in Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: evidence for spatial and temporal heterogeneity.</a> J Exp Biol. 204, 2289-2299 (2001).</li><li>Donnell, M. J., Dow, J. A., Huesmann, G. R., Tublitz, N. J., Maddrell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separate+control+of+anion+and+cation+transport+in+malpighian+tubules+of+Drosophila+Melanogaster.">Separate control of anion and cation transport in malpighian tubules of Drosophila Melanogaster.</a> J Exp Biol. 199, 1163-1175 (1996).</li><li>Cabrero, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+channels+in+stellate+cells+are+essential+for+uniquely+high+secretion+rates+in+neuropeptide-stimulated+Drosophila+diuresis.">Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 14301-14306 (2014).</li><li>Torrie, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+the+insect+ouabain+paradox.">Resolution of the insect ouabain paradox.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13689-13693 (2004).</li><li>Rodan, A. R., Baum, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+NKCC+Ncc69+is+required+for+normal+renal+tubule+function.">The Drosophila NKCC Ncc69 is required for normal renal tubule function.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303, 883-894 (2012).</li><li>Ianowski, J. P., Christensen, R. J., O'Donnell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na++competes+with+K++in+bumetanide-sensitive+transport+by+Malpighian+tubules+of+Rhodnius+prolixus.">Na+ competes with K+ in bumetanide-sensitive transport by Malpighian tubules of Rhodnius prolixus.</a> J Exp Biol. 207, 3707-3716 (2004).</li><li>Naikkhwah, W., O'Donnell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+stress+alters+fluid+and+ion+transport+by+Malpighian+tubules+of+Drosophila+melanogaster:+evidence+for+phenotypic+plasticity.">Salt stress alters fluid and ion transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: evidence for phenotypic plasticity.</a> J Exp Biol. 214, 3443-3454 (2011).</li><li>Donini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+water+and+ions+by+malpighian+tubules+of+larval+mosquitoes:+effects+of+diuretic+factors,+second+messengers,+and+salinity.">Secretion of water and ions by malpighian tubules of larval mosquitoes: effects of diuretic factors, second messengers, and salinity.</a> Physiol Biochem Zool. 79, 645-655 (2006).</li><li>Maddrell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+by+Malpighian+Tubules+of+Rhodnius+movements+of+Ions+and+Water.">Secretion by Malpighian Tubules of Rhodnius movements of Ions and Water.</a> J Exp Biol. 51, 71-97 (1969).</li><li>Maddrell, S. H., Overton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+sodium+transport+and+fluid+secretion+by+ouabain+in+an+insect+malpighian+tubule.">Stimulation of sodium transport and fluid secretion by ouabain in an insect malpighian tubule.</a> J Exp Biol. 137, 265-276 (1988).</li><li>Williams, J. C., Beyenbach, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+secretagogues+on+Na+and+K+secretion+in+the+Malpighian+tubules+of+Aedes+Aegypti+(L).">Differential effects of secretagogues on Na and K secretion in the Malpighian tubules of Aedes Aegypti (L).</a> J Comp Physiol. 149, 511-517 (1983).</li><li>Maddrell, S. H., O'Donnell, M. J., Caffrey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+haemolymph+potassium+activity+during+initiation+and+maintenance+of+diuresis+in+fed+Rhodnius+prolixus.">The regulation of haemolymph potassium activity during initiation and maintenance of diuresis in fed Rhodnius prolixus.</a> J Exp Biol. 177, 273-285 (1993).</li><li>Messerli, M. A., Kurtz, I., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+optimized+Na++and+Cl-+liquid+membranes+for+use+with+extracellular,+self-referencing+microelectrodes.">Characterization of optimized Na+ and Cl- liquid membranes for use with extracellular, self-referencing microelectrodes.</a> Anal Bioanal Chem. 390, 1355-1359 (2008).</li><li>Ianowski, J. P., O'Donnell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basolateral+ion+transport+mechanisms+during+fluid+secretion+by+Drosophila+Malpighian+tubules:+Na++recycling,+Na+:K+:2Cl-+cotransport+and+Cl-+conductance.">Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance.</a> J Exp Biol. 207, 2599-2609 (2004).</li><li>Neufeld, D. S., Leader, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+characteristics+of+ion+secretion+in+malpighian+tubules+of+the+New+Zealand+alpine+weta+(Hemideina+maori).">Electrochemical characteristics of ion secretion in malpighian tubules of the New Zealand alpine weta (Hemideina maori).</a> J Insect Physiol. 44, 39-48 (1997).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. , (1997).</li><li>Jayakannan, M., Babourina, O., Rengel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+measurements+of+Na++fluxes+in+plants+using+calixarene-based+microelectrodes.">Improved measurements of Na+ fluxes in plants using calixarene-based microelectrodes.</a> J Plant Physiol. 168, 1045-1051 (2011).</li><li>Wu, Y., Schellinger, J. N., Huang, C. L., Rodan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypotonicity+Stimulates+Potassium+Flux+through+the+WNK-SPAK/OSR1+Kinase+Cascade+and+the+Ncc69+Sodium-Potassium-2-Chloride+Cotransporter+in+the+Drosophila+Renal+Tubule.">Hypotonicity Stimulates Potassium Flux through the WNK-SPAK/OSR1 Kinase Cascade and the Ncc69 Sodium-Potassium-2-Chloride Cotransporter in the Drosophila Renal Tubule.</a> J Biol Chem. 289, 26131-26142 (2014).</li><li>Blumenthal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+tyramine+signaling+by+osmolality+in+an+insect+secretory+epithelium.">Modulation of tyramine signaling by osmolality in an insect secretory epithelium.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, 1261-1267 (2005).</li><li>Dow, J. A., Maddrell, S. H., Davies, S. A., Skaer, N. J., Kaiser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+the+nitric+oxide-cGMP+signaling+pathway:+the+control+of+epithelial+function+in+Drosophila.">A novel role for the nitric oxide-cGMP signaling pathway: the control of epithelial function in Drosophila.</a> Am J Physiol. 266, 1716-1719 (1994).</li><li>Dube, K., McDonald, D. G., O'Donnell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transport+by+isolated+anterior+and+posterior+Malpighian+tubules+of+Drosophila+melanogaster:+roles+of+sequestration+and+secretion.">Calcium transport by isolated anterior and posterior Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: roles of sequestration and secretion.</a> J Insect Physiol. 46, 1449-1460 (2000).</li><li>Efetova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separate+roles+of+PKA+and+EPAC+in+renal+function+unraveled+by+the+optogenetic+control+of+cAMP+levels+in+vivo.">Separate roles of PKA and EPAC in renal function unraveled by the optogenetic control of cAMP levels in vivo.</a> J Cell Sci. 126, 778-788 (2013).</li><li>Rheault, M. R., O'Donnell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+cation+transport+by+Malpighian+tubules+of+Drosophila+melanogaster:+application+of+two+novel+electrophysiological+methods.">Organic cation transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: application of two novel electrophysiological methods.</a> J Exp Biol. 207, 2173-2184 (2004).</li><li>Donnell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Too+much+of+a+good+thing:+how+insects+cope+with+excess+ions+or+toxins+in+the+diet.">Too much of a good thing: how insects cope with excess ions or toxins in the diet.</a> J Exp Biol. 212, 363-372 (2009).</li><li>Cheng, C. J., Truong, T., Baum, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney-specific+WNK1+inhibits+sodium+reabsorption+in+the+cortical+thick+ascending+limb.">Kidney-specific WNK1 inhibits sodium reabsorption in the cortical thick ascending limb.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 303, 667-673 (2012).</li><li>Cheng, C. J., Yoon, J., Baum, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STE20/SPS1-related+Proline/alanine-rich+Kinase+(SPAK)+is+Critical+for+Sodium+Reabsorption+in+Isolated+Perfused+Thick+Ascending+Limb.">STE20/SPS1-related Proline/alanine-rich Kinase (SPAK) is Critical for Sodium Reabsorption in Isolated Perfused Thick Ascending Limb.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השימוש של assay ראמזי, יחד עם אלקטרודות יון ספציפי, מאפשר המדידה של שיעורי הפרשת נוזל והנתיבים יון בMalpighian tubules חרקים מבודדים (כליות). ניתן assayed עשרים או יותר tubules בזמן, המאפשר תפוקה גבוהה יותר בהשוואה לassay של פרט בtubules המבחנה microperfused. בנוסף, אלקטרודות יון ספציפי תאפשר קביעת ריכוזי יון בתוך הנוזל המופרש באתר, הגבלת שגיאות שעלולות להיות הציגו בהעברת הכמויות הקטנות של נוזל למנגנון שני. צעדים קריטיים בפרוטוקול כוללים הבטחה שtubules הם גזורים ללא דמי שכירות או דמעות (אשר יגרמו לנוזל להיות מופרש מהדמעה, ולא סוף החתך של השופכן), ולהבטיח כי ISE עובד היטב על ידי קביעת השיפוע שלה לפני לתחילת הניסוי. אפילו עם ניתוחים זהירים, זה לא יוצא דופן עבור מזדמן tubules להיכשל להפריש (עד ~ 10% מצינוריותגזור), אבל אם שיעור גבוה של צינוריות לא להפריש זה עשוי להיות מסיבות ביולוגיות (כלומר., שיעורי הפרשה נמוכים מאוד בתנאים מסוימים). חסרונות מסוימים שעלולות להוביל לISE לא עובד טוב כוללים: ionophore דולף החוצה (שיכול להיות בגלל שבירת קצה האלקטרודה או silanization לא מספק), או הקדמה של בועות אוויר לתוך הקצה. ניתן לקביעת בעיות אלה על ידי הדמיה של האלקטרודה תחת מיקרוסקופ מתחם ובדרך כלל דורשות מילוי ISE חדש עם ionophore לפני שתמשיך. בנוסף, ISE עשוי לפעול היטב במשך כמה ימים, או שבועות אפילו, אבל סופו של דבר להיכשל, שוב מחייב בנייה של ISE חדש. זה גם קריטי שצלחת assay היא שטפה ביסודיות בסוף הניסוי, כי מלחים שיורית ישנו את ההרכב היוני והאוסמוטי של תמיסת מלח הים בניסויים הבאים. מניסיוננו, Na + ISE מתואר בפרוטוקול זה הוא lesזה יציב יותר מאשר K + ISE, לעתים קרובות מציג הידרדרות של מדרונו במהלך הניסוי. ואכן, Jayakannan et al. תאר Na + ISE משופר המבוסס על אותו ionophore עם סלקטיביות ויציבות טובות יותר. הקוקטייל שלהם כלל 3.5% 4 -butylcalix טרט [4] tetraethylester חומצת arene-tetraacetic, 95.9% אתר octyl 2-nitrophenyl, וtetrakis 0.6% אשלגן (4 chlorophenyl-) borate 26. ברגע שהנסיין נוח ביצוע assay זה, יכולים להיות הציג תמורות רבות כדי לחקור את הביולוגיה הבסיסית של תחבורת יון אפיתל. לדוגמא, צינוריות של גנוטיפים שונים ניתן לבחון כדי לקבוע את תפקידו של ערוץ טרנספורטר או יון ספציפי בתחבורה נוזל והיון transepithelial 14, או של מסלולי איתות תאיים או תאיים המסדירים מובילים או ערוצי 14,27 אלה. הרכב הרחצה אגל יכול להיות שונה כדי להסתכלתפקיד של הרכיבים הספציפיים שלו, כגון יונים, גלוקוז או חומצות אמינו 9, או osmolarity 27,28. או, hemolymph עצמו מתקבל מבעלי החיים שגדלו בתנאים שונים ניתן להשתמש במקום של הים מלוח 16. תרופות, הורמונים (או שליחיהם שני) או פפטידים ניתן להוסיף כדי לברר השפעותיהם 2,9,14,23,29. בפרוטוקול הנוכחי, והנתיבים נוזל ויון במגזר העיקרי נבחנים, מאז המגזר הראשוני אינו מפריש 2 נוזל, והמגזר הנמוך הוא מחוץ לירידת הרחצה. עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי לבחון את הפעילות של המגזרים הראשוניים או נמוכים 30. כתבים מהונדסים, כגון transgene חישת סידן aequorin 5, או pH- וחישת כלוריד transgene ChlopHensor 12, יכול להרשות למתאם של ריכוזי יון תאיים עם שטף transepithelial. באופן דומה, Efetova et. מניפולציה אל. הוכיחה תא ספציפי של רמות cAMP באמצעות oשליטת ptogenetic של cyclase adenylyl photoactive, מדגימה תופעות ההפרש של המחנה בstellate ותאים עיקריים 31. בעוד הפרוטוקול הנוכחי בtubules Malpighian של תסיסנית melanogaster המבוגר התמקד, הטכניקות המשמשות יושמו בחרקים אחרים, כולל prolixus Rhodnius 21, 24 מאורי Hemideina, ומיני יתושים מרובים 17, כמו גם על תסיסנית זחל קשיות 16. באופן דומה, יונים אחרים מלבד Na + K + ו, כגון H +, Ca 2 + או tetraethylammonium ניתן assayed 30,32, כמו גם רעלים כגון 33 סליצילט. לבסוף, טכניקת אלקטרודה יון ספציפי יכולה לשמש גם למדידת ריכוזי יון בtubules היונקים microperfused, מייתרת את צורך יוני רדיואקטיבי 34,35. לסיכום, שימוש ברמזים כאומר עם אלקטרודות יון ספציפי מאפשר מדידה של נוזלי transepithelial ויון והנתיבים מתסיסנית מבודדת melanogaster tubules כליות. יחד עם הכלים גנטיים החזקים תסיסנית זמינים, מנגנונים מולקולריים של תחבורת יון אפיתל אפשר לבאר.

<html> תחבורת יון אפיתל כליות בבסיס iono- האורגניזם וויסות האוסמוטי. אבובית דרוזופילה melanogaster Malpighian (כליות) מציעה הזדמנות שאין כמותו כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של תחבורת יון אפיתל. זאת בשל השילוב של הגנטיקה החזקה של דרוזופילה, יחד עם הנגישות של tubules הכליות שלה למחקר פיסיולוגי. Assay ראמזי, על שמו של החוקר שהיה חלוץ טכניקת 1, מודד שיעורי הפרשת נוזל מצינוריות Malpighian מבודדות, והוקם בשנת 1994 על ידי תסיסנית דאו ועמיתים 2. זה סלל את הדרך למחקרים נוספים באמצעות תסיסנית כלים גנטיים, כגון מערכת GAL4-כטב&quot;מ 3,4, להגדיר מסלולי איתות תא ספציפי המסדירים את הפרשת נוזלים. דוגמא כוללת איתות סידן בתגובה להורמון פפטיד 5, בקרב רבים אחרים 6,7. ve_content &quot;&gt; שילוב של טכניקות גנטיות ומחקר פיסיולוגי קלאסי הוכיח כי דור שתן בזבוב מתרחש באמצעות ההפרשה של נוזל כלוריד-עשיר אשלגן מהמגזר העיקרי של אבובית. זו מתרחשת באמצעות הפרשת transepithelial המקבילה של קטיונים, בעיקר K + אלא גם Na +, דרך התא העיקרי, וCl -. ההפרשה דרך תא stellate 8-12 היכולת למדוד בנפרד והנתיבים transepithelial K + וNa + מאפשרת אפיון מפורט יותר של מנגנוני תחבורה מאשר המדידה של הפרשת נוזל יש לבד. לדוגמא, בtubules תסיסנית unstimulated, + Na / K + -ATPase מעכב ouabain אין כל השפעה על הפרשת נוזל 2, גם כאשר ספיגתו לתוך תאים עיקריים היא מעוכבת על ידי taurocholate מעכב טרנספורטר אניון האורגני 13. עם זאת, לינטון ו אודונל הראה כי ouabain depolarizesפוטנציאל הממברנה basolateral, ומגביר Na + שטף 9. כפי שניתן לראות בנציגי התוצאות, אנו משוכפלים ממצאים אלה, והראו כי K + שטף הוא במקביל ירד 14; שטף Na + המוגבר וירידת K + שטף יש השפעות מנוגדות על הפרשת נוזל, וכתוצאה מכך אין שינוי נטו בהפרשה. לפיכך, יש שתי החלטות ל&quot; פרדוקס ouabain, &quot;כלומר, ההתבוננות הראשונית שouabain אין כל השפעה על הפרשת נוזלים באבובית תסיסנית:. ראשונה, בtubules המגורה, ההשפעה של ouabain על הפרשת נוזל אינה נראית לעין עקב הספיגה שלה על ידי טרנספורטר אניון האורגני 13; ושנייה, בtubules unstimulated, ouabain יש השפעות מנוגדות על transepithelial Na + K + ושטף, וכתוצאה מכך אין שינוי נטו בהפרשת נוזל (ראה תוצאות ונ&quot;צ נציג. 9). לכן, התפקיד העיקרי של + Na / K + -ATPASE בtubules unstimulated הוא להוריד תאיים ריכוז Na + ליצור שיפוע ריכוז נוח לNa + -coupled תהליכי הובלה על פני קרום basolateral. ואכן, על ידי מדידה בנפרד Na + K + ונתיבים, שהוכחנו כי tubules חסר cotransporter נתרן, אשלגן-2-כלוריד זבוב (NKCC) ירד K + שטף transepithelial, ללא ירידה נוספת לאחר תוספת ouabain, ולא חלו שינוי בtransepithelial Na + שטף 14. ממצאים אלה נתמכים מסקנתנו כי Na + כניסה לתא דרך NKCC ממוחזרת דרך Na + / K + -ATPase. בדוגמא אחרת, Ianowski נצפה et al. כי הורדת K אמבטיה + ריכוז מ -10 מ&quot;מ ועד 6 מ&quot;מ ירד K transepithelial + שטף וtransepithelial המוגבר שטף Na + בצינוריות מprolixus Rhodnius, ללא שינוי נטו בהפרשת נוזל <sup&gt; 15. אפקטי ההפרש בשטף Na + K + ושטף על פני tubules זחל גם נצפו בtubules דרוזופילה בתגובה לדיאטות מלח שונה 16 ובשני מיני יתושים בתגובה לגידול מליחות 17. האתגר הגדול ביותר במדידת שטף יון transepithelial בהכנת assay רמזי הוא קביעת ריכוזי יון בתוך הנוזל המופרש. אתגר זה כבר נפגש עם פתרונות שונים, כולל photometery להבה 18, שימוש ביונים רדיואקטיביים 19, וגל אלקטרון הבדיקה ספקטרוסקופיה נפיצה 20. טכניקות אלה דורשות העברה של ירידת הנוזל המופרשת למכשיר למדידת ריכוזי יון. מאז את נפח הנוזל המופרש על ידי אבובית תסיסנית unstimulated הוא קטן, בדרך כלל ~ 0.5 NL / דקה, זה מציב אתגר טכני וגם מציגה שגיאה אם חלק מהנוזל המופרש הואאיבד על העברה. לעומת זאת, השימוש באלקטרודות יון ספציפי מאפשרת המדידה של פעילות יון (שממנו ניתן לחשב ריכוז יון) באתרו. הפרוטוקול הנוכחי הותאם מזה בשימוש על ידי Maddrell ועמיתים למדידת K transepithelial + שטף על פני אבובית Rhodnius באמצעות valinomycin כK + ionophore 21, ומתאר גם את השימוש ב-butylcalix 4 טרט [4] חומצת arene-tetraacetic Na מבוסס אסתר tetraethyl + אלקטרודה יון ספציפי -specific המאופיינת Messerli et. אל. 22. אלקטרודות יון ספציפיות יש גם שימשו למדידת ריכוזי יון בנוזל המופרש על ידי צינוריות Malpighian בassay רמזי ב9,23 מבוגרים ו -16 זחל תסיסנית melanogaster, ניו זילנד Alpine Weta (Hemideina מאורי) 24 וביתושים 17. כאן, אנו מתארים בפירוט את השימוש ברמזים כאומר למדוד שיעורי הפרשת נוזל בtubules Malpighian מדרוזופילה melanogaster, כמו גם שימוש באלקטרודות יון ספציפי כדי לקבוע את הריכוזים של K + וNa + בתוך הנוזל המופרש ולכן החישוב של נתיבי יון transepithelial. סקירה של assay מסופקת באיור 1. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53144/53144fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי של קשיות Malpighian וAssay רמזי עם שימוש ביון ספציפי אלקטרודות למדידת ריכוזי יון. נתון זה ממחיש את ההתקנה לassay רמזי. (א) לכל זבוב ארבעה tubules, זוג הצינוריות קדמית וזוג הצינוריות אחורית, לצוף שבחלל הבטן המוקף hemolymph. בכל זוג, שתי הצינוריות להצטרף בשופכן, אשר לאחר מכן מרוקן את השתן בצומת של midgut וhindguלא. Tubules הם הסתיים עיוור. שתן נוצר על ידי המגזר העיקרי מפרישי הנוזל (באדום), וזורם לכיוון השופכן והחוצה אל הבטן. לאחר נתיחה, זוג אבובית הוא ניתק מהבטן על ידי חוצה את השופכן. (ב) זוג הצינוריות מועבר לאחר מכן לטיפה של ים מלוח בתוך היטב של צלחת assay. אחד משתי הצינוריות, המכונה כאן &quot;אבובית העוגן,&quot; עטוף סביב סיכת מתכת והוא אינרטי. אבובית האחרות היא אבובית הסתרתו. הקטע הראשוני (שאינו מפריש נוזל) והקטע העיקרי של אבובית מפרישות להישאר בתוך הטיפה של ים מלוח. יונים ומהלך מים מתמיסת מלח הים ולתוך לום אבובית של המגזר העיקרי, ולאחר מכן לנוע לכיוון השופכן, כפי שהיו קורים בvivo. הקטע התחתון (הכחולה) הוא מחוץ למלוח רחצה ולכן אדיש. מאז שופכן הוא לחתוך, הנוזל המופרש מתגלה כטיפה מסוף החתך של השופכן. Tהוא מופרש טיפת נוזל מגדילה לאורך הזמן כהפרשה ממשיכה, וקוטרה נמדד באמצעות מיקרומטר עיני. שכבה של שמן מינרלים מונעת אידוי של הנוזל המופרש. אלקטרודות ספציפיות ההתייחסות והיון למדוד את ריכוז היון של הנוזל המופרש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53144/53144fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/</td>
			<td>May be purchased from multiple distributors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>Fisher 08-757-100A</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades #1</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td>Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 30G x 1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305106</td>
			<td>Use appropriate sharps precautions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins, black anodized, 0.15 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with ocular micrometer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td>Specific brand is not important; this is given as an example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick</td>
			<td>Hobby shop</td>
			<td></td>
			<td>Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers)</td>
			<td>Hobby shop</td>
			<td></td>
			<td>Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>30-0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>30-0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid, 70%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>438073</td>
			<td>CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cimarec 7 in x 7 in hotplate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11675911Q</td>
			<td>Specific brand is not important; caution when heated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectophore dichlorodimethylsilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>40136-1ML</td>
			<td>CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-step vertical pipet puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td>Other pipet pullers can be used; this is given as an example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-748E</td>
			<td>Specific brand is not important; only one dish needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-821-852</td>
			<td>May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S161-500</td>
			<td>Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>World Precision Instruments MicroFil, 34G</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-821-914</td>
			<td>May be available from other distributors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe with luer lock</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td>May be available from other distributors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe with luer lock</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309657</td>
			<td>May be available from other distributors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-30600-02</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Locking Connector</td>
			<td>4 Medical Solutions</td>
			<td>ADC 9873-10</td>
			<td>Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-179-110</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14171208</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectophore potassium ionophore I, cocktail B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>99373</td>
			<td>CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectophore sodium ionophore X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71747</td>
			<td>Sodium ionphore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>73732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selectophore sodium tetraphenylborate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21720024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High impedance electrometer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD223a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder 1 mm with 45&#176; body, vented, with handle</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators, pair</td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
			<td>Various brands/models will work; this is an example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Technical Manufacturing Corporation</td>
			<td>81-334-03</td>
			<td>This is an example; any Faraday cage will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single gooseneck fiberoptic light</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mineral oil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP-2629</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, Dumont #5 with Biologie tip</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>May be available from other distributors.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the ramsay assay to measure fluid secretion and ion flux rates in the drosophila melanogaster malpighian tubule

אפנון של תחבורת יון אפיתל כליות מאפשר אורגניזמים לשמור על הומאוסטזיס יוני והאוסמוטי בפרצוף של משתנה תנאים חיצוניים. אבובית דרוזופילה melanogaster Malpighian (כליות) מציעה הזדמנות שאין כמותו כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של תחבורת יון אפיתל, בשל הגנטיקה החזקה של האורגניזם הזה ואת הנגישות של tubules הכליות שלה למחקר פיסיולוגי. כאן, אנו מתארים את השימוש של assay רמזי למדידת שיעורי הפרשת נוזל מtubules הכליות לטוס מבודד, עם השימוש באלקטרודות יון ספציפי למדידת ריכוזי נתרן ואשלגן בנוזל המופרש. assay זה מאפשר לימוד והנתיבים נוזל transepithelial ויון של ~ 20 tubules בזמן, ללא הצורך להעביר את הנוזל המופרש למנגנון נפרד למדידת ריכוזי יון. מבחינה גנטית ניתן לנתח tubules השונה כדי להעריך את התפקיד של גנים ספציפיים בתהליכי הובלה. בנוסף, במלוח athing יכול להיות שונה כדי לבחון את ההשפעות של מאפייניו הכימיים, או תרופות או הורמונים הוסיפו. לסיכום, טכניקה זו מאפשרת האפיון המולקולרי של מנגנונים בסיסיים של תחבורת אפיתל יון באבובית דרוזופילה, כמו גם הסדרת מנגנוני תחבורה אלה.

איורים 7 ו -8 להפגין כי שימוש בassay רמזי עם אלקטרודות יון ספציפי למדידת ריכוזי K + וNa + יכול להבחין K גנטי ופרמקולוגית נפרד + והנתיבים Na +, מידע שאינו נתפס על ידי מדידת שיעורי הפרשת נוזל לבד. איור 7 מראה כי ירידה בהפרשת נוזלים בצינוריות מזבובים נושאים מוטציה null הומוזיגוטים בNKCC הוא מונע על ידי ירידה בK + שטף במוטציות (איור 7 א), ואילו Na + השטף לא השתנה (איור 7). איור 8 מראה ש+ / K + -ATPase המעכב, ouabain, יש השפעות שונות על כל אחד משלושת הפרמטרים שנמדדו Na: בtubules wild-type, שיעור הפרשת נוזל הוא ללא שינוי (איור 8 א ו8B), Na + שטף מוגבר (איור 8 א ), ו- K + שטף הוא דהמקומט (איור 8 ב). יתר על כן, יש ouabain אין כל השפעה על K transepithelial + שטף בtubules NKCC null המוטציה (איור 8 ב). יחד, נתונים אלה מצביעים על כך ש+ / + -ATPase K Na מספק את הכוח המניע לK + ספיג דרך NKCC, בעוד + Na ממוחזר דרך Na + / K + -ATPase 14. בין 13 ו -18 tubules נותח בכל גנוטיפ / מצב; הבדלים שנצפו היו מובהקים סטטיסטיים עם AP &lt;0.01 (או פחות) על ידי מבחן t מזווג, שני זנב של הסטודנטים. מאז קלות ניתן לנתח ~ 15-20 tubules בניסוי של יום אחד, התוצאות מוצגות כאן מייצגות ~ 10 ימים של ניסויים. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/53144/53144fig7.jpg" /> איור 7. נוזלים הפרשת דרג וTransepithelial K <stRong&gt; + השטף הם מתגבר בקשיות נשיאת ריק מוטצית הומוזיגוטים בNKCC, בעוד Na + השטף הוא ללא שינוי. שיעור הפרשת נוזלים (/ דקות / אבובית NL) וK + שטף (pmol / דקות / אבובית) נמדדו ב() tubules מזבובי שליטה (wBerlin) או מזבובים נושאים מוטציה null הומוזיגוטים בNKCC הזבוב (w; Ncc69 R2 / Ncc69 R2). n = 18 tubules / גנוטיפ. שיעור הפרשת נוזלים (/ דקות / אבובית NL) (ב) ושטף Na + (pmol / דקות / אבובית) נמדדו מזבובי שליטה (wBerlin, n = 13 tubules) או מזבובים נושאים מוטציה null הומוזיגוטים בNKCC הזבוב ( w; Ncc69 R2 / Ncc69 R2, n = 14 tubules). ערכים המוצגים הם שגיאה סטנדרטית ± ​​ממוצע של הממוצע (SEM). NS, לא משמעותי; ** P &lt;0.01;*** P &lt;0.001; ****, P &lt;0.0001. נתון זה הותאם מרודן ואח. אל. 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53144/53144fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/53144/53144fig8.jpg" /> Na + / + -ATPase K איור 8. ממחזר Na + כניסה דרך NKCC. שיעור הפרשת נוזלים (/ דקות / אבובית NL) ושטף Na + (pmol / דקות / אבובית) (א) נמדדו בצינוריות מזבובי שליטה (WBerlin) בהעדר (n = 13 tubules) או הנוכחות (n = 15 tubules) של 100 מיקרומטר ouabain, מעכב של Na + / K + -ATPase. שיעור הפרשת נוזלים (/ דקות / אבובית NL) ו- K (ב &#39;) + </sup&gt; שטף (pmol / דקות / אבובית) נמדד בtubules גזור מזבובי שליטה (wBerlin) בהעדר (n = 17 tubules) או נוכחות (n = 17 tubules) של 100 מיקרומטר ouabain. K + שטף נמדד גם בtubules null NKCC בהעדר או הנוכחות של ouabain (w; Ncc69 R2 / Ncc69 R2, n = 16-17 tubules / מצב). הערכים המוצגים הם ממוצעים ± SEM. NS, לא משמעותי; ** P &lt;0.01; *** P &lt;0.001. נתון זה הותאם מרודן ואח. אל. 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53144/53144fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> מלוח תסיסנית </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ל1 ליטר: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> לשקול את 3.6 גלוקוז גרם ומניח לתוך כוס; שיתוף סופיncentration = 20 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> לאחר מכן להוסיף: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> רְכִיב </td><td> נפח (מיליליטר) </td><td colspan="2"> ריכוז סופי (מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> ~ 800 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2.5 M NaCl </td><td> 47 </td><td> 117.5 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> 2 </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 8.5 </td><td> 8.5 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M NaHCO 3 </td><td> 10.2 </td><td> 10.2 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M HEPES </td><td> 15 </td><td> 15 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M לאא 2 PO 4 </td><td> 4.3 </td><td> 4.3 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מערבבים, להתאים את ה- pH 7.0 </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> להוסיף H 2 O לנפח סופי של 1 ליטר </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> סנן לעקר; להימנע מעוקר (גלוקוז יהיה caramelize) </td></tr><tr><td> חנות ב 4 מעלות צלזיוס </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> בטל אם ראיות של התפתחות חיידקים או פטרייתי </td><td></td></tr></tbody></table> טבלת 1. ביצוע תסיסנית מלוח. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> המדיום של שניידר </td><td></td></tr><tr><td> רְכִיב </td><td> ריכוז (מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> גליצין </td><td> 3.33 </td></tr><tr><td> L-ארגינין </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> חומצת L-אספרטית </td><td> 3.01 </td></tr><tr><td> L-ציסטאין </td><td> .496 </td></tr><tr><td> L-ציסטין </td><td> 0.417 </td></tr><tr><td> L-חומצה גלוטמית </td><td> 5.44 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> 12.33 </td></tr><tr><td> L-היסטידין </td><td> 2.58 </td></tr><tr><td> L-isoleucine </td><td> 1.15 </td></tr><tr><td> L-לאוצין </td><td> 1.15 </td></tr><tr><td> הידרוכלוריד L ליזין </td><td> 9.02 </td></tr><tr><td> L-מתיונין </td><td> 5.37 </td></tr><tr><td> L-פנילאלנין </td><td> .909 </td></tr><tr><td> L-פרולין </td><td> 14.78 </td></tr><tr><td> L-סרין </td><td> 2.38 </td></tr><tr><td> L-תראונין </td><td> 2.94 </td></tr><tr><td> L- טריפטופן </td><td> 0.49 </td></tr><tr><td> L-טירוזין </td><td> 2.76 </td></tr><tr><td> L-ולין </td><td> 2.56 </td></tr><tr><td> β-אלאנין </td><td> 5.62 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 5.41 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 15.06 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 21.33 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3.31 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 36.21 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 4.76 </td></tr><tr><td> Na 2 4 HPO </td><td> 4.94 </td></tr><tr><td> חומצת α-ketoglutaric </td><td> 1.37 </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> 11.11 </td></tr><tr><td> חומצת Fumaric </td><td> .862 </td></tr><tr><td> חומצת מאלית </td><td> .746 </td></tr><tr><td> חומצת succinic </td><td> .847 </td></tr><tr><td> trehalose </td><td> 5.85 </td></tr><tr><td> yeastolate </td><td> 2,000 מ&quot;ג / ליטר </td></tr></tbody></table> טבלה 2. הרכב בינוני של שניידר. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> מִרֹאשׁ </td><td colspan="2"> שֶׁלְאַחַר </td><td> הַפסָקָה </td><td> מדרון / עשירון </td></tr><tr><td> מ&quot;מ</td><td> mV </td><td> מ&quot;מ </td><td> mV </td><td> 15-150 (מראש) </td><td> 52.8 </td></tr><tr><td> 15 </td><td> -28.4 </td><td> 15 </td><td> -29.4 </td><td> 15-150 (פוסט) </td><td> 54.4 </td></tr><tr><td> 75 </td><td> 9.1 </td><td> 75 </td><td> 9.4 </td><td> 75-150 (מראש) </td><td> 51 </td></tr><tr><td> 150 </td><td> 24.4 </td><td> 150 </td><td> 25 </td><td> 75-150 (פוסט) </td><td> 52 </td></tr><tr><td> 200 </td><td> 30.6 </td><td> 200 </td><td> 31.9 </td><td> 150 - 200 (מראש) </td><td> 49.6 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 150 - 200 (פוסט) </td><td> 55.2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> מְמוּצָע </td><td> 52.5 </td></tr></tbody></table> טבלת 3. כיול של K </stronז&gt; + ISE K + ISE מכויל בפתרונות המכילים 15, 75, 150 ו -200 מ&quot;מ KCl לפני ואחרי המדידה של נוזל מופרש ניסיוני.; דוגמא למדידות בפועל מוצגת בטבלה זו. חישוב של שינוי המדרון / עשירון בK + הריכוז בא לידי ביטוי. ל15-150 מרווח mV, מדרון / העשירון = mV לירידה של 150 מ&quot;מ כיול - mV לירידת כיול 15 מ&quot;מ. ל75 - המרווח 150, ההבדל מחולק ב -0.3 [יומן (150/75)]. ל150 - 200 המרווח, ההבדל מחולק על ידי 0.125 [יומן (200/150)]. שישה מדרונות (שלושה מראש הניסוי, שלושה שלאחר ניסוי) הם ממוצעים יחד כדי לקבל מדרון / עשירון הממוצע. טבלה זו הותאמה מרודן ואח. אל. 14

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule at JoVE.com

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של assay רמזי למדידת שיעורי הפרשת נוזל מצינוריות Malpighian (כליות) מבודדות מmelanogaster תסיסנית. בנוסף, השימוש באלקטרודות יון ספציפי למדידת ריכוזי נתרן ואשלגן בנוזל המופרש, המאפשר חישוב של שטף יון transepithelial, מתואר.

שימוש של assay רמזי כדי למדוד את הפרשת נוזלים ויון שטף מחירים ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; אבובית Malpighian

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

use-ramsay-assay-to-measure-fluid-secretion-ion-flux-rates-drosophila

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

11.7K Views.  University of Texas Southwestern Medical Center.  פרוטוקול זה מתאר את השימוש של assay רמזי למדידת שיעורי הפרשת נוזל מצינוריות Malpighian (כליות) מבודדות מmelanogaster תסיסנית. בנוסף, השימוש באלקטרודות יון ספציפי למדידת ריכוזי נתרן ואשלגן בנוזל המופרש, המאפשר חישוב של שטף יון transepithelial, מתואר. 

Video: Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

מבחני photobleaching (FRAP &amp; FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

מדידה של תוחלת חיים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

PH כימות של תאיים אופטי בדרוזופילה melanogaster צנורית Malpighian Epithelia עם pH מקודד פלורסנט גנטית מחוון

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic infections, there has been a recent increase of interest in the mechanisms of gut immunocompetence to pathogens, which require methods to orally infect flies. Here we present a protocol to orally expose individual flies to an opportunistic bacterial pathogen (Pseudomonas aeruginosa) and a natural bacterial pathogen of D. melanogaster (Pseudomonas entomophila). The goal of this protocol is to provide a robust method to expose male and female flies to these pathogens. We provide representative results showing survival phenotypes, microbe loads, and bacterial shedding, which is relevant for the study of heterogeneity in pathogen transmission. Finally, we confirm that Dcy mutants (lacking the protective peritrophic matrix in the gut epithelium) and Relish mutants (lacking a functional immune deficiency (IMD) pathway), show increased susceptibility to bacterial oral infection. This protocol, therefore, describes a robust method to infect flies using the oral route of infection, which can be extended to the study of a variety genetic and environmental sources of variation in gut infection outcomes and bacterial transmission.

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

This protocol describes methods to orally expose and infect the fruit fly Drosophila melanogaster with bacterial pathogens, and to measure the number of infectious bacteria shed following gut infection. We further describe the effect of immune mutants on fly survival following oral bacterial infection.

זיהום חיידקי הפה ו Shedding ב דרוזופילה melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...