ריאות הגידול תא גיוס Assay

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הגידול על המנגנונים המולקולריים של גרורות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי גיוס של תאים סרטניים בתוך איבר מרוחק ניתן לכמת. התחל על ידי שימוש ריאגנט דיסוציאציה תאים שאינם אנזימטיים כדי להסיר חלבון פלואורסצנטי מבטא קרצינומה ריאות לואיס, או LLC, תאים ממכל התרבות שלהם על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.

העבר את פתרון התא וכתוצאה מכך לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר לפני צנטריפוגה, צנטריפוגה לשטוף את כדורי פעמיים בחמישה מיליליטר של PBS לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, מסננים את התאים דרך מסננת תאי נקבוביות של 40 מיקרומטר, ומדללים את ההשעיה לריכוז של פי 10 לששת התאים למיליליטר. ואז לטעון את התאים לתוך מזרק אחד מיליליטר מצויד מחט 29-מד, ולהזריק 100 microliters של תאים לתוך וריד הזנב של כל שמונה עד 10 שבועות, C57-שחור-6, עכבר זכר.

בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, השתמש במספריים כדי להסיר את העור מפני השטח הגחוניים של כל עכבר, וחתוך את הצלעות והסרעפת כדי לחשוף את חלל בית החזה. השתמש מחט עירוי מכונף 25-מד צינורות כדי לשטוף 15 מיליליטר של PBS דרך החדר הימני, ולהסיר את הלב ואת התימוס. אוחז את קנה הנשימה עם מלכודות, למשוך למעלה, לנתח את רקמות החיבור סביב קנה הנשימה, כדי לקצור את הריאות.

ואז לשטוף את הריאות PBS, ולנתק אונה אחת להדמיה של התאים הפלואורסצנטיים במקום תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לעכל את רקמת הריאה, ראשית קוביות האונה caudal עם מספריים, ולמקם את חתיכות הריאה במזרק 10 מיליליטר. סגור את המזרק עם הבוכנה, ושואפ חמישה מיליליטר של פתרון עיכול לתוך המזרק, הזזת הבוכנה פנימה ומחוץ לפיר המזרק עד רקמת הריאה מופץ לאורך כל הפתרון.

מחלקים את תרחיף הריאה לצינור 50 מיליליטר, ולעכל את הרקמה על שייקר הדדי במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 150 סל"ד. בסוף הדגירה, triturate הרקמה הנותרת עד תאי הריאה מפוזרים לחלוטין, ולהחזיר את הצינור שייקר במשך 30 דקות נוספות. לאחר מכן לסנן את התאים דרך מסננת נקבוביות 40 מיקרומטר, ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.

כדי לנתח את תאי הריאה המבודדים על ידי ציטומטריית זרימה, להשתמש שוב את גלולה בשני מיליליטר של חיץ תמוגה תא דם אדום במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. ואז צנטריפוגה גלולה פעמיים בחמישה מיליליטר של PBS טרי בתוספת 1% אלבומין סרום בקר לכל לשטוף. לאחר הצנטריפוגה השנייה, יש למצות את גלולת הכדור במיליליטר אחד של PBS טרי בתוספת BSA, ולסנן את התאים באמצעות מסננת נקבוביות חדשה של 40 מיקרומטר לכימות תאי הגידול על ידי ציטומטריית זרימה.

הריאות מציגות תאים רבים GFP-LLC שעתיים לאחר ההזרקה, עם הרוב המכריע של התאים נעלמים מן הריאות בתוך 24 שעות. שים לב שיש לא לכלול בספירת התאים כתמים פלואורסצנטיים שזוהו בתוך המסנן האדום. כדי לאשר את מספר GFP-LLC בריאות, אחת האונות יכולה לשמש לניתוח ציטומטרי זרימה כפי שהודגם.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי הליך סעיף קפוא היא שיטה מדויקת יותר להתבוננות במיקום המדויק של תאים סרטניים.