נתמך על ידי CA051008 P30 מענקי NIH וT32 CA009686 (ATR).

1. דור של Spheroids <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה תא בודד לתליית תרבויות ירידה בניתוק תרביות תאי הסרטן חסיד של ~ מפגש 70% באמצעות PBS לשטוף אחרי חשיפה ל0.05% פתרון טריפסין- EDTA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את פתרון טריפסין עם תקשורת ותרבות תא ולספור את התאים באמצעות aliquot של ההשעיה התא. הערה: תקשורת תרבות תא הספציפית יהיה תלויה בשורת התאים נבדקות. עקוב המלצות תקשורת ATCC, שבו התקשורת ותרבות תא היא בדרך כלל DMEM + 10% FBS. ניתן למצוא מידע נוסף בלוח חומרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע דילול כדי לאפשר לזריעה של 500-1,000 תאים לכל 20 ירידת μl של תקשורת בתרבות התא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש צלחת 10 סנטימטרים ולהוסיף 5 מיליליטר של PBS סטרילי לתחתית. הערה: שלב זה מגן על תליית טיפות מאידוי. עלות נמוכה יותר מנות &quot;בקטריולוגית כיתה&quot; ניתן להשתמש במקום של מנות כיתה תרבית תאים, תאים לא יהיו המשךלפעול משטח התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipet רב ערוצית להעביר 20 טיפות μl של ההשעיה התא המדולל למשטח הפנימי של המכסה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 40 טיפות (5 שורות של טיפות 8) על המכסה של צלחת 10 סנטימטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המכסה ומניחים על גבי צלחת התרבות. דגירה תרבויות ירידה התלויה על 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות כדי ליצור spheroids. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המכסה באופן בטוח, עדיין בשליטה. הערה: היפוך המכסה מהר מדי או איטי מדי עלולה לגרום לטיפין להעביר. שורות תאים מסוימות עשויות ליצור spheroids ב 48 שעות או פחות, בעוד שאחרים עשויים לדרוש יותר מ -72 שעות כדי לייצר אגרגטים קומפקטיים. </li></ol></li></ol> 2. הטבעה של Spheroids לתוך 3D מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של חומרי קרום צמיחה מופחת גורם מרתף על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני הטבעת spheroids. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלית: בארות שכבה עם ECM מראש כדי למנוע אינטראקציה אליפטית פוטנציאלית עם cultu הרקמהמחדש על פני שטח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 μl Pipet של ECM לכל גם בצלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את הצלחת על מנת להבטיח שECM מכסה את פני השטח היטב כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות ECM העודף עם pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת עד הבארות יבשות: 3 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את spheroids על ידי הטיית המכסה של צלחת תרבית רקמה ואיגום התקשורת. העבר את התקשורת עם spheroids לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר 10 דקות לspheroids להתיישב בחלק התחתון של צינור microcentrifuge. Spheroids צריך להיות גלוי לפי העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שילוב של חומרי קרום במרתף 100 μl עם של (4 ° C) הקר 100 μl להקליד אני קולגן בצינור מראש צונן נפרד. שמור את התערובת על 4 מעלות צלזיוס, כדי למנוע או ג&#39;ל לחיזוק בטרם עת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעצות pipet מראש צונן אם העברת נפחים קטנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתת טיפול כאשרערבוב סוג חומרי קרום במרתף וקולגן אני למנוע היווצרות בועת אוויר. הערה: בועות אוויר עלולות לעכב הדמיה מאוחר יותר בפרוטוקול אם הם השתרשו בג&#39;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב spheroids מהחלק התחתון 40 μl של צינור microcentrifuge, ולשלב עם חומרי קרום במרתף / הסוג אני קולגן תערובת. להיות זהיר כדי למנוע היווצרות בועת אוויר כאשר ערבוב. הערה: התמיסה המכילה חומרי קרום במרתף 100 μl, 100 סוג קולגן μl אני, ו -40 μl של spheroids ניצור מספיק חומר ל4 תרבויות 3D עצמאיות. זה יכול להיות מדורגים למעלה או למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 40 טיפות μl של התערובת צמיגה למרכזים של בארות בצלחת 24 גם. לשמור על רמת הצלחת כדי למנוע את התערובת מפועל לצד השני של הבאר. הערה: עמודה אחת על הצלחת 24 גם - 4 בארות - מומלצת לכל מצב להיבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת intחממת OA 37 ° C ולהשאיר ללא הפרעה במשך 30 דקות. תרבות 3D תהיה פלמר בתקופה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט להטביע את תרבויות 3D ב 1 מיליליטר של תקשורת בתרבות התא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהמדיה היא חמה בעת הוספתו לבארות לקדם פילמור ג&#39;ל נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב קריטי: בעדינות להוסיף מדיה לתרבויות 3D. Pipetting התקשורת מהר מדי לתוך הבארות יכול להוביל לניתוק של תרבויות 3D ממשטח תרבית רקמה. </li></ol></li></ol> 3. ניטור וניתוח ספרואיד פלישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלישת תמונה מspheroids לתוך מטריצת 3D מקיפה בנקודתי הזמן החליטו על ידי החוקר. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה עם העדשה האובייקטיבית 20x. הערה: נקודות זמן אידיאלית תהיה שונות בהתאם לקו התא נבדק. שורות תאים יותר פולשנית תתחיל יציאתם מspheroids זמן קצר לאחר ציפוי, ולכן, לקחת תמונה ראשוניתים בתוך כמה שעות לאחר ציפוי. בדרך כלל, תצלומים שצולמו בשעה 0 (לאחר ציפוי), 24 שעות, 48 שעות ו. פלישה בדרך כלל מסכמת 24 עד 48 שעות לאחר ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת יכולת פולשנית באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כמו התמונה ג &#39; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח פלישה כמרחק תא מקצה אליפטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי לצייר ישר לסמן את הרדיוס ו / או מרחק מקסימאלי פולשנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;נתח&quot; בתפריט העליון, ולאחר מכן לחץ על &quot;מדוד&quot; כדי להציג את מדידת האורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח פלישה כאזור פולשנית הכולל מחוץ לאליפטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי ציור Freehand להתחקות הגבול של אליפטית ו / או האזור פולשנית כולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;נתח&quot; בתפריט העליון, ולאחר מכן לחץ על &quot;מדוד&quot; כדי להציג את מדידת השטח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוסף כמו כלים מנהל ROI ליצור מדידות לערימה של תמונות. </li></ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).</li><li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions.">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J Vis Exp. 51, (2011).</li><li>Del Duca, ., Werbowetski, D., T, ., Del Maestro, R., F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+preparation+from+hanging+drops:+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion.">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> J Vis Exp. 88, (2014).</li><li>Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+matrix+metalloproteinase-9+(MMP-9)+via+a+converging+plasmin/stromelysin-1+cascade+enhances+tumor+cell+invasion.">Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion.</a> J Bio Chem. 274 (19), .</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+Basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li><li>Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+integrin+&#945;6&#946;1+in+metastatic+breast+carcinoma+cells+assessed+by+expression+of+a+dominant-negative+receptor.">Function of the integrin &#945;6&#946;1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor.</a> Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), (2010).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cot&#233;, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), (2006).</li><li>Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4 (1), (2006).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).</li><li>Brenner, W., Gro&#223;, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Th&#252;roff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+inhibition+of+renal+cancer+cell+invasion+mediated+by+fibronectin,+collagen+IV+and+laminin.">Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin.</a> Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).</li><li>Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+promotes+motility+in+human+breast+cancer+cells+regardless+of+their+E-cadherin+expression.">N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression.</a> J Cell Biol. 147 (3), .</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), (2013).</li><li>Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+I+but+not+Matrigel+matrices+provide+an+MMP-dependent+barrier+to+ovarian+cancer+cell+penetration.">Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration.</a> BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+ductal+elongation+and+myoepithelial+migration+are+regulated+by+the+composition+of+the+extracellular+matrix.">Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix.</a> J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).</li><li>Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+circulating+metastatic+cells+produced+in+orthotopic+but+not+ectopic+prostate+cancer+models.">Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models.</a> Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

מחקר זה העריך את הביצועים של פנל של שורות תאי הסרטן בassay אליפטית פלישה (טבלה 1). בדרך כלל, אנו מוצאים כי היווצרות אליפטית מוגברת בשורות התאים יותר למראה אפיתל, שבו נוכחותו של צמתים תאי תאים מקדמת את הקמתה של ארכיטקטורה כמו-אליפטית. קווים ידועים תא שעברו מעבר אפ?...

הוא קבע כי תנועתיות של תאים הסרטניים היא חזויה של פוטנציאל גרורתי, בהתחשב בעובדה שהתנהגות כזו מאפשרת פלישה דרך הקרום במרתף והכניסה למערכת דם 1. רוב המחקר על תנועתיות התמקד בדרך בה התאים מתנהגים בסביבה דו-ממדית (2D), אם כי זה הופך להיות מוכר באופן נרחב שהתנועה של תאים במטריצה ​​תלת-ממדי (3D) הוא נציג נוסף של איך אותם תאים יהיו ממש להתנהג בvivo 2. מערכות תרבות 3D משמשות יותר ויותר ללמוד התנהגויות סלולריות הנעות בין מורפולוגיה תא, לקינטיקה צמיחה ורגישות לסמים 3. הרצון לפקח על פלישת תאים סרטנית בהקשר של סביבת 3D הוביל לסינתזה של טכניקות הוקמו בעבר מעורב הדור של אגרגטים 3D תא (spheroids) באמצעות שיטת הטיפה התלויה תרבות 4, ואחרי הטבעת spheroids אלה לתאיים 3D מטריקס (ECM) מורכב מחומרי קולגן וקרום במרתף 5. שיטה זו נועדה לשפר את ביצועי טכניקות הוקמו בעבר אלה על ידי מתן גישה יעילה שיכול להיות מנוצלת בקלות להשוות פלישה תחת מגוון רחב של תנאי ניסוי. דרכים מסורתיות יותר להעריך תנועתיות תא במבחנה הן assay-פצע השריטה וassay transwell 6. Assay לשעבר מתאר תנועתיות תא בהגדרת 2D, ולכן אינו תלוי של מגוון רחב של תכונות קריטיות לפלישת in vivo, למשל פעילות פרוטאז 7. Assay transwell יכול פלישת תא מודל טוב יותר כאשר מוסיף גם הם מצופים עם מצעי ECM אבל, רק פרמטר אחד, כלומר את המראה של תאים על פני השטח הקרום ההפוך נמדד, וניואנסים רבים של פלישת תא לכן אינם ניתנים לצפייה בקלות. בניגוד לשיטות אלה, assay פלישת אליפטית תאים הסרטניים (איור 1 &lt;/ Strong&gt;) מאפשר לניטור בזמן אמת של פלישת תא בהגדרה שהיא לא רק מבחינה פיזיולוגית רלוונטי, אלא גם מאפשר תכונות חשובות תא קו ספציפי להיות דמיינו, כגון תא בודד מול קולקטיבי הגירה 8. שיטה זו גם מאפשרת יתרונות על פני מבחני צמיחת תרבות 3D סטנדרטיים. הדור של אגרגטים סלולריים באמצעות שיטת הטיפה התלויה בתחילה מגביל תנועת תא, כך שתאים יהיו תמריצים לפלוש לאחר אילוץ זה יוסר. יתר על כן, ברגע שהאילוץ שהרים, היציאה תא תמשיך בכיוון אחיד, כי אז יכול להיות ונרשמת בנוחות. חומרי ECM הפופולריים ביותר המשמשים למבחני spheroids תא סרטני הם Matrigel וסוג אני קולגן, שבו כל אחד ממרכיבים אלה יש תפקידים חשובים ומובהק בהשפעה על התנהגות גרורתי. Matrigel הוא תערובת של חלבונים מופרשים מיוצרים על ידי תאי סרקומה Engelbreth-הולם נחיל עכבר, והוא מועשר בbasemeחלבוני קרום NT כגון laminin, entactin, וקולגן IV סוג 9. מסיבה זו Matrigel נקרא מעתה ואילך ל&quot; חומרי קרום במרתף. &quot;חומרי קרום במרתף אלה מספקים ligands החיוני נחוץ לintegrin הידבקות במהלך פלישת תאים סרטני 10 בנוסף לחלבונים רבים אחרים שמפעילים מגוון רחב של השפעות על התנהגות תא 11. לשם השוואה, הסוג אני קולגן, מוכן בדרך כלל ממעכלים חומצה של גידים ומבני collagenous צפופים אחרים 12, הוא חומר מטריצה ​​הרבה יותר פשוט, המשמש כמרכיב מבני עיקרי של רקמות חיבור רקמות וסטרומה תמיכה ואיברי הגוף. הוכח שהמאפיינים הפיזיים של קולגן יכולים לווסת מספר התכונות של תנועתיות תא; לדוגמא, את היישור של סיבי קולגן בממשק הגידול-סטרומה מאפשר לתאי סרטן להגר לאחר מכן לאורך סיבים שבהם פולשים לתוך סטרומה 13. בassay שהוצג כאן, שניהם הסוג אני קולגן וחומרי קרום במרתף משמשים ככלים ללמוד אינטראקציות התא-סטרומה סרטן 3D. ההשפעה של עיכוב או גירוי של מסלולים השולטים פלישה ניתן לנטר אחרי התאים כבר מוטבעים במטריצת 3D. ניתן pretreated תאים במהלך צמיחה בטיפי התלייה או על העברה לתרבות 3D, תלוי אם יידרש טיפול ממושך לווסת פלישה. לטיפולים קצרים יותר, מומלץ כי התרופה להיות מעורבבת עם ההשעיה אליפטית לאחר איסוף, כמו גם התקשורת שמקיפה את תרבויות 3D, כדי להקל על חשיפה לסמים נאותה לתאים. לאחר מכן, ניתן ונכללו תאי סטרומה רגילים או גידולים הקשורים עם חומר המטריצה ​​להעריך את תפקידם בויסות פלישת תאים סרטניים, או כדי לקבוע כיצד השפעות איתות התנהגות תא אוטוקריני וautocrine. רעיון זה הוצג במחקר שבו coculture של colעל סרטן ותאי האנדותל בטיפות תלויות הוביל לרשת כלי דם בתוך spheroids 14. לבסוף, ניתן גם לשנות את מרכיבי ECM, כמו הפלישה של תאי הסרטן מושפעת מצעים שונים 15. כך השיטה המובאת להלן תספק מסגרת להערכת פלישת תאים סרטניים תחת מגוון רחב של תנאים. באופן כללי נמצא כי לא כל שורות התאים ייצרו spheroids בטיפין התלויות ושורות תאי אפיתל מראה בדרך כלל יוצרות כדורים רגילים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-treated Dishes</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well TC-treated Plates</td>
			<td>NEST Biotechnlology</td>
			<td>702001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX-71 Inverted Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3d setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

באמצעות assay פלישת אליפטית (איור 1), בהרכב של שורות תאי סרטן נבדק ליכולת שלהם ליצור spheroids, כמו גם לסכום של יציאה תא הציג לאחר השתלה במטריצת 3D המורכב מחומרי מרתף קרום והסוג אני קולגן (טבלה 1). תוצאות אלו מראות כי לא שורת תאי סרטן בכל תיצור spheroids הבנוי היטב, ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting at JoVE.com

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

a-cancer-cell-spheroid-assay-to-assess-invasion-in-a-3d-setting

Research

JoVE Journal

Medicine

32.2K Views.  Georgetown University. This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored. 

Video: A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

טכניקה מבוסס למדוד את הפלישה של monolayer תא האנדותל על ידי תאים סרטניים חשמל התנגדות בזמן אמת

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

ב Assay עמילות חוץ גופית mesothelial כי מודלים השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

השתנה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלישת Assay כדי לקבוע את התפקיד הפוטנציאלי של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה בפלישת תאי הסרטן המתווך

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

הערכה של קובץ מצורף סרטן השחלות אליפטית ופלישה של תאי mesothelial בזמן אמת

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

להתמקד גיבוש: Assay מבוסס תאים כדי לקבוע את הפוטנציאל שבעור של ג&#39;ין

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

חליטות עורק הראשי לpharmacokinetic וpharmacodynamic ניתוח של taxanes בעכברים

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...