D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.

במחקר זה, נקבה בוגרת (6-8 שבועות) C57Bl / 6 עכברים היו בשימוש. עכברים שוכנו וגדלו בהתאם להנחיות של ביבר אוניברסיטת גנט. נהלי כל החיה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים המוסדיים ואתיקה. 1. הכנת תאי mononuclear (MNCs) מטחול העכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר במורד גב על הלוח לנתח ולתקן האחורי ורגליים קדמיות עם סיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את העור-פני השטח עם 70% אתנול / H (כרך / כרך) 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העור לאורך קו האמצע הבטן לבית החזה ולחשוף את הטחול באמצעות מכשירי ניתוח סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמירה רקמות שומן מסביב, למקם את הטחול לתוך צלחת 24 היטב המכילה 1 מיליליטר 1x ופר פוספט (PBS) ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הטחול באמצעות אזמל סטרילי ולהעביר את החתיכות לתוך מסנן ניילון 70 מיקרומטר ממוקם בתוך אמבטיה 50 מיליליטרדואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בבוכנת מזרק 2 מיליליטר, בעדינות מועך את חתיכות הטחול דרך מסננת התא ולשטוף עם 5 מיליליטר 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 3 מיליליטר של Ficoll-Paque לצינור 15 מיליליטר וכיסוי בינוני שיפוע צפיפות עם ההשעיה הסלולרית 5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 400 XG במשך 20 דקות ב RT ללא בלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר הביניים לצינור 15 מיליליטר טרי, להוסיף 10 מיליליטר הקר 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 2 מיליליטר 1x PBS המכיל 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA) וחומצת 1 מ&quot;מ ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (חיץ FACS). העברה 10 μl של ההשעיה תא צינור קטן, לערבב עם 10 μl של 0.4% </li></ol> 2. העשרה, באיתור ובטיהור של תאי העכבר iNKT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העשרה של לימפוציטים הטחול עכבר CD5positive (CD5 +). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) כתם 10 5 תאים עם FITC- מצומדות אנטי-CD5 (4 μl של 01:30 דילול / 10 6 תאים)למשך 30 דקות ב 4 ° C בחושך, לשטוף עם 200 μl FACS חיץ וגלול ב500 μl חיץ FACS. הכן פתרון עובד 20 מיקרומטר של 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ב 1x PBS, להוסיף 1 μl 10 5 תאים בחיץ FACS ולדגור על RT במשך 5 דקות. לרכוש 10 4 תאים מועשרים מראש על cytometer את הזרימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש FCS-H וFCS-W, אלקטרוני שער על תאי lo FSC-W להוציא כפילויות תא ואגרגטים (איור 1 א). אז + תאים אלקטרוניים שער החוצה DAPI (מתים) בתוך FSC-W lo האוכלוסייה (איור 1), ולהשתמש SSC-וFCS-כדי לבחור את אוכלוסיית הלימפוציטים אלקטרוני לפי גודל (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתאים בתוך שער הלימפוציטים, העלילה SSC-מול CD5 ואלקטרוני לימפוציטים השער CD5 + כפי שמוצג באיור 1D. לרכוש את יתרת המדגם מראש המועשר בcytometer את הזרימה. </li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ספירת תאים עד 10 7 תאים לכל 90 μl במאגר FACS ולהוסיף microbeads אנטי-CD5 10 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, לשטוף פעם אחת עם 4 FACS מיליליטר חיץ וגלול ב500 μl חיץ FACS קר. להעשיר לCD5 ימפוציטים + באמצעות הפרדת תא מגנטית (MACS) עמודות על פי המלצות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי) כתם 10 5 תאים עם אנטי-CD5 FITC- מצומדות (4 μl של 01:30 דילול / 10 6 תאים) וDAPI כמו ב2.1.1. לרכוש 10 4 ימפוציטים מועשרים בcytometer הזרימה ולוודא שהשערים האלקטרוניים שנוצרו ב2.1.1. בחר CD5 ימפוציטים + בשבריר הסלולרי המועשר. לרכוש 10 5 תאים על cytometer הזרימה ולנתח את אחוז CD5 + לימפוציטים הנוכחיים בשבריר המועשר כפי שמוצג באיור 1E - H. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי ובידוד של ce iNKT עכברLLS ידי FACS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend + לימפוציטים CD5 מועשרים בריכוז של כ 10 6 תאים לכל 20 μl במאגר FACS המכיל אנטי-CD16 / CD32 (4 μl של 1:50 דילול / 10 6 תאים) וαGalCer PE-מצומדות / tetramer CD1d (1 מיקרוגרם / 10 6 תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 30 דקות ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נוגדני עכבר (בז) אנטי-CD3ε V500 (4 μl של 1:20 דילול / 10 6 תאים), E450 אנטי-CD19 (4 μl של 1:50 דילול / 10 6 תאים) ואנטי-CD8α E450 (4 μl של 01:50 דילול / 10 6 תאים) במאגר FACS, להוסיף לCD5 + לימפוציטים דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם FACS חיץ 1 מיליליטר על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס וגלולות ב 4 מיליליטר חיץ FACS בריכוז סופי של 10 7 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את התאים דרך מסננת תא 30 מיקרומטר ולמקם את התאים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את cytometer הזרימה לתא מיון לפי המלצות היצרן 14,15. הערה: כיול של cytometer זרימה למיון תא דורש אימון ויכול להתבצע על ידי מפעיל מנוסה, או טכנאי מיומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של פתרון עובד 20 מיקרומטר של DAPI לכל 10 6 תאים ולדגור על RT במשך 5 דקות. לרכוש כ 10 + 4 לימפוציטים CD5 מועשרים בcytometer את הזרימה. אלקטרוני שער על תאי lo FSC-W להוציא כפילויות תא ואגרגטים (איור 2 א). אז באופן אלקטרוני את שער DAPI + CD8 + CD19 + תאים (ערוץ מזבלה) בתוך FSC-W lo האוכלוסייה (איור 2), ולהשתמש SSC-וFCS-מנת לבחור באופן אלקטרוני לימפוציטים (איור 2 ג) כפי שמתואר ב2.1.1.1 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילת αGalCer / CD1d tetramer ידי CD3ε ואלקטרוני השער αGalCer / CD1dתאי tetramer + CD3ε + iNKT כפי שמוצג באיור 2 ד. לרכוש לא יותר מ 2 x 10 5 CD5 + לימפוציטים מועשרים כדי לקבוע את אחוז αGalCer / tetramer CD1d + CD3ε + iNKT תאים הנמצאים בחלק הסלולרי המועשר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשערים האלקטרוניים שנוצרו ב2.2.7., תאי מין αGalCer / tetramer CD1d FACS + CD3ε + iNKT על cytometer את הזרימה ב 70 psi באמצעות זרבובית 70 מיקרומטר בקצב זרימה של &#39;1.5&#39;. איסוף תאים ממוינים iNKT בצינור FACS FCS המכיל 1 מיליליטר 100%. בהמשך לכך לשטוף תאי iNKT מסודרים מהצד של צינור FACS באמצעות 10 מיליליטר RMPI מדיום 1640 ו צנטריפוגות התאים XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend מסודרים תאי iNKT ב 1 מיליליטר RPMI 1640 בינוניים ולרכוש 40 μl על cytometer זרימה להעריך את טוהר של תאים ממוינים iNKT. בחר FSC-W lo DAPI - הלימפוציטיםים כפי שמתואר ב2.2.7. (איור 2E - G) והשער אלקטרוני αGalCer / תאי tetramer + CD3ε + iNKT CD1d כפי שמוצג באיור 2H. </li></ol></li></ol> 3. תרבות והרחבת תאי העכבר iNKT יום 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל צלחת עם תחתית שטוחה 96 גם עם אנטי-CD3ε המטוהר (3 מיקרוגרם / מיליליטר) לכל היטב במשך שעה 1 ב RT. לשטוף פעמיים עם 200 μl 1x PBS ופעם עם 200 μl בינוני שלם RPMI 1640 (10% FCS כרך / כרך, 100 U / פניצילין, סטרפטומיצין מיליליטר, 5.5 מיקרומטר β-mercaptoethanol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר תאי קיימא מסודרים iNKT (צעד 2.2.8) באמצעות 0.4% hemocytometer כמו ב1.11., צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס וגלולות בשעת 5 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום 1640 RPMI מלא המכיל 2-IL (/ מיליליטר 10 ng) רקומביננטי עכברי, IL-12 (1 ng / ml) עכברי רקומביננטי וCD28 אנטי עכבר (5 מיקרוגרם / מיליליטר) מסיס. צלחת שלorted תאי iNKT ב 10 5 תאים / גם בצלחות מצופים אנטי-CD3ε ולדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת CO 2 עבור 2 ימים. </li></ol> יום 2 <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים לצלחת טרי ללא ציפוי-תחתית שטוחה 96 גם ותרבות התאים בתנאי מנוחה במדיום RPMI 1640 שלם על 37 מעלות צלזיוס בחממה CO 2 עבור 2 ימים. </li></ol> יום 4 <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסלק את התאים מהצלחת ידי pipetting העדין ולהעביר את תאי צינור 15 מיליליטר טרי. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 ° C, גלול ב 5 x 10 5 תאים / מיליליטר בRPMI 1640 בינוני מלא המכיל 7-IL (מיליליטר / 5 ng) רקומביננטי עכברי, וצלחת 10 5 תאים / גם בשטוח תחתית 96 צלחת גם במשך 4 ימים על 37 מעלות צלזיוס בחממה CO 2. </li></ol> יום 8 <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים בצינור טרי, צנטריפוגות ב 300 xגרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס וגלולות בשעת 5 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום 1640 RPMI שלם המכילות אנטי CD28 המסיס (5 מיקרוגרם / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל צלחת עם תחתית שטוחה 96 גם עם אנטי-CD3ε המטוהר (3 מיקרוגרם / מיליליטר) לכל היטב ולשטוף כמו ב3.1. צלחת 10 5 תאים / גם באנטי-CD3ε צלחות מצופים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת CO 2 עד יום 11. </li></ol> יום 11-18 <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.4-3.6. </li></ol> יום 19-20 <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי צינור 15 מיליליטר טרי, צנטריפוגה XG ב 300 וגלולים בשעת 5 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום 1640 RPMI שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צלחת ב 10 5 תאים / גם בצלחת גם עם תחתית שטוחה 96 ולאפשר לתאים לנוח 2 ימים על 37 מעלות צלזיוס בחממה CO 2 לפני השימוש בניסוי. </li></ol> 4. ציטוקין ייצור על ידי תאי iNKT עכבר באמצעות פלאט CD1dAssay הנכנס דואר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל צלחת עם תחתית שטוחה 96 גם עם של עכברי רקומביננטי CD1d 100 μl (10 מיקרוגרם / מיליליטר ב1x PBS) לכל היטב דגירה במשך השעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ארבע פעמים עם 200 μl 1x PBS, להוסיף 200 μl של FCS 2% ב1x PBS (פתרון חסימה) לכל היטב דגירה במשך שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון החסימה, להוסיף 200 μl של αGalCer (5 ng / μl) לכל היטב, ודגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. [להכנת פתרון αGalCer, להוסיף 1,085 μ 1x PBS עד 55 מיקרוגרם של αGalCer מומס ברכב המכיל 96 מ&quot;ג / מיליליטר סוכרוז, 10 מ&quot;ג / מיליליטר נתרן deoxycholate ו5 מ&quot;ג / מיליליטר tween 20]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לבטל את פתרון αGalCer ולשטוף היטב פעמיים עם 200 μl 1x PBS ואחריו 200 μl בינוני RPMI 1640 מלאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים במבחנה iNKT מורחבים ביום 21, צנטריפוגה התאים XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס והגלולה בR המלאמדד מנהלי הרכש בינוני 1,640 בריכוז של 0.5 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של resuspension תא iNKT בכל טוב והדגירה של 72 שעות על 37 מעלות צלזיוס בחממה CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את ציטוקינים supernatant ומידה של עניין על ידי assay צמוד אנזים immunosorbant (ELISA) על פי הפרוטוקול של היצרן. </li></ol>

<ol>
	<li>Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD1-specific+NK1+T+cells:+development,+specificity,+and+function.">Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function.</a> Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).</li><li>Kronenberg, M., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unconventional+lifestyle+of+NKT+cells.">The unconventional lifestyle of NKT cells.</a> Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).</li><li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+CD1d-restricted+repertoire+is+dominated+by+a+few+autoreactive+T+cell+receptor+families.">The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families.</a> J Exp Med. 193, 893-904 (2001).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+glycosphingolipid+recognition+by+NKT+cells.">Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells.</a> Science. 306, 1786-1789 (2004).</li><li>Cardell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1-restricted+CD4++T+cells+in+major+histocompatibility+complex+class+II-deficient+mice.">CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice.</a> J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).</li><li>Kawano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1d-restricted+and+TCR-mediated+activation+of+valpha14+NKT+cells+by+glycosylceramides.">CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides.</a> Science. 278, 1626-1629 (1997).</li><li>Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells+in+rheumatic+disease:+a+joint+dilemma.">Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).</li><li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKT+cells+in+immunoregulation+of+tumor+immunity:+a+new+immunoregulatory+axis.">NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis.</a> Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).</li><li>Molling, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+sustained+expansion+of+mouse+spleen+invariant+NKT+cell+lines+with+preserved+cytokine+releasing+capacity.">Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity.</a> J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).</li><li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro.">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128, 324-333 (2009).</li><li>Gumperz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD1d-restricted+T+cell+recognition+of+cellular+lipids.">Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids.</a> Immunity. 12, 211-221 (2000).</li><li>Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+TCRs+recognize+murine+CD1.">Diverse TCRs recognize murine CD1.</a> J Immunol. 162, 161-167 (1999).</li><li>Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection,+isolation+and+culture+of+mouse+and+human+invariant+NKT+cells.">Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells.</a> Nature protocols. 3, 70-78 (2008).</li><li>Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).</li><li>Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+quantifying+cell+sorting+yield+in+'real+time'.">A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).</li><li>Drennan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thymic+microenvironment+differentially+regulates+development+and+trafficking+of+invariant+NKT+cell+sublineages.">The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages.</a> J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).</li></ol>

The authors have no competing interests to disclose.

צעדים קריטיים בפרוטוקול הנוכחי כוללים בידוד וההעשרה הבאה של CD5 + לימפוציטים (סעיף 1 ו -2), FACS (סעיף 3) מיון וציפוי הראשוני של תאי iNKT (סעיף 4). הצעדים שבוצעו בסעיף 1, זוכר שכבה בזהירות ההשעיה סלולרית הטחול על מדיום שיפוע הצפיפות כך שביניים סלולריים שונים נוצר בעקבות צנטריפוגה. ההעשרה לאחר מכן לCD5 + לימפוציטים ידי הפרדת תא מגנטית (סעיף 2) ממזערת את חומרים כימיים וזמן הנדרש לכתם ולתאי FACS iNKT סוג (סעיף 3), אשר מסייע תשואות תא iNKT עליית פוסט-מין. לבסוף, חשוב לזרע לא יותר מ 10 5 תאי iNKT לכל גם עבור 2 הימים הראשונים של התרבות (סעיף 4) כזריעת בארות עם מספרים גבוהים יותר של תאי iNKT יכול לגרום לאפופטוזיס הסלולרי. מספר השיקולים חשובים בעת שינוי ו / או troubleshooטינג פרוטוקול זה: ראשית, גילם של בעלי החיים המשמשים הוא חשוב. בעלי חיים שהם או זקנים מדי, או שיש לי זיהומי אבזר, עלולים לפגוע ביכולת שלך לבודד, להבחין, וFACS סוג תאים מספיק מהטחול. שנית, כאשר צביעה עם tetramers αGalCer / CD1d, חשוב לשמור על הנפח של תאי resuspended ב PBS חיץ נמוך כגבוה מדי נפח מדלל את יעילות צביעת tetramer αGalCer / CD1d, אשר בתורו מפחית את האשכולות של tetramer + תאי iNKT ידי FACS. באופן אידיאלי, הנוכחות של תאי tetramer + iNKT αGalCer / CD1d התקבצו בחוזקה במהלך רכישת FACS מאפשרת לgating מדויק יותר על ידי FACS ומניבה iNKTs טוהר אחוז גבוה יותר במהלך ניתוח שלאחר-מין. זה חשוב כמו תשואות תא ממוינות iNKT נמוכות יגרמו לתוצאה של אוכלוסיות תאי T זיהום אחרות במהלך התרבות. שלישית, ברציפות לרענן בינוני שהופך צהוב במהלך התרבות והרחבת לסה&quot;נ iNKTLLS. לדוגמא, להחליף 50% של מדיום מצהיב עם מדיום חדש המכיל ציטוקינים המתאימים, במיוחד בימים 8 ויום 11 של התרבות. יכולות להיות מוגדלת תשואות תא iNKT בדרך זו. למיטב ידיעתנו זו היא פרוטוקול הרחבת iNKT הראשון כולל שיפוע צפיפות וצעד העשרת הלימפוציטים CD5 + לבידוד וההעשרה של תאי iNKT מטחול עכבר. מספר הגישות חלופיות נחקר להעשיר לתאי iNKT הטחול כוללים הדימרים αGalCer / CD1d 13, Vα14 TCR Tg עכברים 10 כמו גם דלדול של תאים הלא-T על ידי תא מגנטי הפרדה 9. עם זאת, למרות שניתן להרחיב תאי iNKT בהצלחה במבחנה תוך שימוש בגישות אלה, שיטות כגון דורשות גם כמויות גדולות של הדימרים αGalCer / CD1d להעשיר לiNKTs 13, רק לייצר תאים מהונדסים iNKT 10, או בו זמנית לגרום לכמה שורות תאים שאינם iNKT 9 &lt;<html> / Sup&gt;. יתר על כן, השימוש בכריכת צלחת אנטי-CD3ε לשמור ולהרחיב את תאים ממוינים iNKT (סעיף 4) מונע דרישה לנגמ&quot;שים הופעלו במהלך התרחבות iNKT במבחנה 9. בהקשר זה, יש פרוטוקול הרחבת iNKT ללא APC היתרון של אין צורך להפריד בין נגמ&quot;שים מתאי iNKT הרחיבו לפני הזרקת in vivo. אנחנו צריכים אולם גם להוסיף כי הפרוטוקול המתואר הוא מוגבל על ידי העובדה שהחוקר דורש גישה קלה ל, כמו גם הכשרה הרלוונטית, לכייל ולפעול סדרן FACS. למרבה הצער ממייני FACS הם יקרים והם לא תמיד זמינים בכל מעבדה. עם זאת, למרות שהפרוטוקול הנוכחי כבר מותאם לבודד ותאי iNKT תרבות עכברית, יכולים לשמש גם צעדי ההעשרה המתוארים במסמך זה כדי לבודד וללמוד המהגרים iNKT האחרונים הרתי (RTEs) 16 וניתן להתאים להעשרה וללאפיין T הנדיר אחר אוכלוסיות תאים על ידי FACS. &quot;Jove_content&quot;&gt; ביחד, אנו מגדירים גישה מותאמת שיכול לשמש כדי ליצור את היעילות עד 10 8 תאי iNKT מהטחולים של שלושה עכברים תוך 3 שבועות. תאי iNKT שנוצרו באופן זה שומרים על היכולת להפריש ציטוקינים על גירוי, מה שהופך אותם שימושיים עבור ניסויי העברת מאמצת והמחקר של ביולוגיה של תא iNKT in vivo.

Murine T תאים (iNKT) רוצח טבעי משתנה הם אוכלוסייה מובחנת של לימפוציטים מסוג T המולדים נבחר בהתימוס ידי thymocytes קליפת המוח להביע CD1d 1,2. תאי iNKT לבטא קולט תא T (TCR) מורכבים משרשרת Vα14-Jα18 TCR משתנה יחד עם שני Vβ8, Vβ7 או Vβ2 TCRs 3, שהוא מסוגל להכיר אנדוגני כמו גם אנטיגנים שומנים זרים בהקשר של CD1d. לדוגמא, תאי iNKT עכברי להכיר ומופעלים על ידי isoglobotrihexosylceramide אנטיגן השומנים אנדוגני נקרא (iGb3) 4, כמו גם α-galactosylceramide (αGalCer) 5,6, גליקוליפיד מבודד מספוגים ימיים. TCR-תלויה הפעלת תאי iNKT מקדם תחול של תגובות חיסוניים אדפטיבית, וכתוצאה מכך, תאי iNKT הוכחו להיות מעורב מבחינה תפקודית בשיפור או פיתוח של מגוון רחב של פתולוגיות כוללים מחלת שיגרון 7 וסרטן &lt;sup&gt; 8. נכון לעכשיו, ligands תא iNKT הסינתטי מהווה adjuvants חיסון חדש ומבטיח שיכול להיות מסוגל ויסות מספר תנאי immunopathological. זה בעבר כבר הוכיח כי יכולים להיות שנוצרו בתאים במבחנה iNKT הבאים בידוד מרקמת עכבר זאת; רבים מהמחקרים האלה להעסיק את השימוש של תאים ראשוניים הצגת אנטיגן (נגמ&quot;שים) ו / או תא קווים 9, מהונדס Vα14 TCR (TG) עכברים 10, או thymomas לדור של hybridomas תאים שמקורם iNKT 11,12. יתר על כן, מספר גדול של עכברים, כמויות גדולות של חומרים כימיים כגון הדימרים טעונים αGalCer CD1d, ופעמים תרבות ארוכות לעשות כמה פרוטוקולים שפורסמו פחות מבחינה אתית וכלכלי מושך 9,13. בדוח זה אנו מתארים שיטה מותאמת לבידוד ובהרחבת מבחנה של תאי iNKT מטחול עכבר. באופן ספציפי יותר, הפרוטוקול מתאר שיטהלהעשרת תאי iNKT מטחול עכבר אשר מפחית את העכברים, חומרים כימיים וזמן הנדרש למיון תא FACS, ומציע גישה מותאמת להרחבת תאי iNKT הטחול מיון במבחנה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant murine IL-2</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant murine IL-12</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>39-8122-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant murine IL-7</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-8071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-mouse CD3e (145-2C11)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-0032-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-mouse CD28 (37.51)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-0281-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>48-0193-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e450-conjugated anti-mouse CD8&#945; (53-6.7)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>48-0081-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>11-0051-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500-conjugated anti-mouse CD3&#949; (500A2)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>560771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2)</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MS Columns</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% (wt/vol)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12633-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-056</td>
			<td>[Ca2+/Mg2+ - free]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>71-7167-00 AF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate F-bottom</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>657-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>665-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>655-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml falcon tube</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>188-271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml falcon tube</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>227-261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>542-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized method for isolating and expanding invariant natural killer t cells from mouse spleen

היכולת להפריש ציטוקינים במהירות על גירוי היא מאפיין פונקציונלי של שושלת תא רוצח טבעי T (iNKT) בלתי משתנה. תאי iNKT לכן מאופיינים כאוכלוסיית תא מולדת T מסוגלת הפעלה והסתגלות היגוי תגובות חיסונית. הפיתוח של טכניקות משופרות לתרבות והרחבת תאי iNKT עכברי מאפשר המחקר של ביולוגיה של תא iNKT במבחנה ובמערכות מודל vivo. כאן אנו מתארים הליך מותאם לבידוד והרחבת תאי iNKT הטחול עכברי. טחול מעכברי C57Bl / 6 יוסרו, גזור ומתוח וההשעיה הסלולרית וכתוצאה מכך היא שכבות על תקשורת שיפוע צפיפות. בעקבות צנטריפוגה, תאי הטחול mononuclear (MNCs) נאספים וימפוציטים CD5-חיוביים (CD5 +) מועשרים לשימוש בחרוזים מגנטיים. תאי iNKT בתוך שבריר CD5 + מוכתמים לאחר מכן עם ^עמוס GalCer tetramer CD1d ומטוהר על ידי תא הקרינה מיון מופעל (FACS); 5. FACS מיון תאי iNKT אז הם בתחילה בתרבית במבחנה באמצעות שילוב של ציטוקינים עכברי רקומביננטי וגירויים קולט תא T צלחת מאוגד (TCR) לפני שהרחיב בנוכחות של IL-7 רקומביננטי עכברי. שימוש בטכניקה זו, כ יכולים להיות שנוצרו 10 8 תאי iNKT בתוך 18-20 ימים של תרבות, לאחר שהם יכולים לשמש עבור מבחני פונקציונליים במבחנה, או לin vivo ניסויי העברה בעכברים.

בידוד של תאי mononuclear הטחול באמצעות שיפוע צפיפות לוקח כ 1 שעה ומבטל את השימוש בחומרים כימיים הנדרשים לlyse תאי דם אדומים (RBCs). תשואה גבוהה של תאי קיימא מתקבלת בשיטה זו ופסולת הנוצרת במהלך המאמץ של האיבר מוסר. בדרך כלל, את התדירות של תאי iNKT בתוך בריכת הלימפוציטים הטחול נעה בין 1 ל 5% בסך הכל לימפוציטים מסוג T עם זאת, זה יכול להשתנות בהתאם למצב גיל, המין ובריאות של בעלי החיים המשמשים. כ ניתן לרכוש מהטחולים המשולבים של 3 עכברים ואת התשואה הגבוהה ביותר של תאי iNKT 10 6 תאי iNKT מתקבלים מטחולים של עכברים ישנים 6-8 שבוע. השימוש בחרוזים מגנטיים העכבר אנטי-CD5 מעשירים באופן משמעותי לתאי iNKT בתוך שבריר MNC הטחול ו, מלבד אוכלוסייה קטנה של לימפוציטים מסוג B המבטא את האנטיגן CD5, רוב התאים מבודדים באמצעות הליך זה מהווה CD5 + lymphocytes. לדוגמא, 5-8% מMNCs מתקבל לאחר העשרת CD5 הם CD5-שלילי (איור 1H). לFACS תא iNKT מיון, שילוב αGalCer / tetramer CD1d ואנטי עכבר CD3ε מניב purities תא iNKT מעל 98% עם זאת, יש להשתמש בערוצי המזבלה FACS לB הטחול ותאי CD8 T לחסל אוכלוסיות &#39;דביקות&#39; הלימפוציטים בסוג. בנוסף, שער מתוך כל כפילויות שאולי נוצרו במהלך שלב העשרת CD5. באמצעות התקנת FACS זה, השגנו purities תא iNKT פוסט-מין לפי הסדר של 99% (איור 2H). גירוי 10 6 תאי iNKT מסודרים עם כריכת צלחת אנטי-CD3ε בנוכחות של IL-2, IL-12 ואנטי CD28 המסיס הביא התרחבות של פי 3 של מספרי iNKT הבאים 2 ימים של התרבות (איור 3). תאי iNKT ההתרחבות לאחר בנוכחות של IL-7 תוצאות ב3- 4-פי עלייה במספר תאי iNKT נוכחים ביום 4 בתרבות. Notably, חוזר תנאי culturing אלה יכולים להניב ממוצע של 7 x 10 7 תאי iNKT לאחר שני סבבים של הרחבה ללא כל אובדן של תאים גלויים בין שינויים בתקשורת והתרבות בימים שונים (איור 3). לפיכך, ניתן להרחיב תאי iNKT הטחול עכברי לפחות 70-לקפל באמצעות תנאים אלה ב -18 ימים. אנחנו גם הערכנו את יכולת ייצור ציטוקינים של תאי iNKT הרחיבו על ידי גירוי עם עכברי רקומביננטי-מחויב צלחת CD1d עמוסה αGalCer. בפוסט 48 גירוי-HR, IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α ו- IL-6 ניתן היה לזהות בקלות בsupernatants התרבות על ידי ELISA (איור 4). תאי iNKT מורחבים לכן לשמר את היכולת לייצר ציטוקינים Th1 וTh2 פוסט-הרחבה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53256/53256fig1.jpg" /> איור 1. העשרה לCD5 +לימפוציטים מMNCs הטחול העכבר. אסטרטגית gating לניתוח אחוז CD5 + לימפוציטים הנוכחיים בטרום מועשר (AD) והשעיות תא מגנטי מועשר הפרדת עכבר (EH) הטחול MNC. כפילויות תא (A, E) ותאים מתים (B, F) הורחקו באמצעות FSC-H לעומת FCS-W וDAPI לעומת מגרשי FSC-, בהתאמה. אחוז CD5 + תאים הנוכחיים בשער הלימפוציטים (C, G) לפני ואחרי ההעשרה מוצגים בD ו- H, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53256/53256fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53256/53256fig2.jpg" /> איור<html> יור 2. FACS מיון תאי iNKT מMNCs הטחול מועשר-CD5. אסטרטגית gating לניתוח αGalCer אחוז / תאי tetramer + CD3ε + iNKT CD1d הנוכחיים לפני (- D) ואחרי (E - H) FACS מיון. אסטרטגית gating מבטלת כפילויות תא (A, E), תאים מתים וCD8 + CD19 + לימפוציטים (B, F) מהניתוח על ידי התוויית FSC-H לעומת FCS-W וDAPI, CD8 וCD19 (ערוץ מזבלה) לעומת FSC- , בהתאמה. ΑGalCer אחוז / תאי tetramer + CD3ε + iNKT CD1d הנוכחיים בשער הלימפוציטים (C, G) לפני ואחרי מיון FACS מוצגים ב( ד) ו- (H), בהתאמה. CD1d-ט &#39;., ΑGalCer / CD1d tetramer.תקבל = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53256/53256fig3.jpg" /> איור 3. מספר מוחלט של תאי iNKT שנוצרו במבחנה. מקפלים עלייה במספר תאי iNKT בנקודות זמן המצוינת אחרי 3 שבועות של התרחבות במבחנה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53256/53256fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53256/53256fig4.jpg" /> איור 4. ציטוקין ייצור קיבולת של תאי iNKT הרחיבו במבחנה. יום 20 תאי iNKT מורחבים היו מגורה במבחנה עם CD1d הטעון αGalCer עכבר. לאחר 72 שעות supernatants נאסף ונותח לנוכחות שליFN-γ, IL-4, TNF-α, IL-2 ו- IL-6 על ידי ELISA. ברים לייצג פירוש SEM (n = 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53256/53256fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen at JoVE.com

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

שיטה אופטימלית עבור בידוד והרחבת תאי Invariant הטבעי רוצח T מטחול העכבר

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

an-optimized-method-for-isolating-expanding-invariant-natural-killer

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Views.  Ghent University Hospital. Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents. 

Video: An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

הכנה ושימוש של HIV-1 CD4 ראשי מאשרום + T-תאים כמו תאים היעד של טבע Cell מבחני Killer ציטוטוקסיות

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

הרחבת לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים מדם טבורים שציטומגלווירוס יעד, וירוס אפשטיין באר, וadenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Antigen המלאכותי הצגת תא הפעלה (aAPC) מתווכות והרחבת תאי T קטלניים טבעיים

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

תאי מציגי הרוצח המלאכותי Antigen (KaAPC) ליעיל<em&gt; במבחנה</em&gt; דלדול של תאי T אנושי אנטיגן ספציפי

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

גזירה של תאי T<em&gt; במבחנה</em&gt; מתאי עכבר גזע העובריים

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...