הערכה מיני אנדוסקופית של המעי הגס בעכברים חיים מספקת תמיכה ניסיונית מרכזית בחקירת ביטויי מעיים של מחלה חריפה של גרף מול מארח, GvHD, על השתלת תאי גזע אלוגניים, hematopoietic. ההערכה הלא פולשנית של קוליטיס חריפה הקשורה ל- GvHD יכולה לתפקד כתחליף עובד להיסטופתולוגיה של תקן זהב, ובכך להפוך קורבנות חוזרים ונשנים של בעלי חיים כדי להשיג דגימות רקמה מיותרות. הדגימה של ההליך תהיה ורה בוצ'ל, פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי.
יום אחד לאחר הקרנת הגוף הכולל של העכברים BALB / c הנמען, למקם CD-45.1 לחיות 5B6 עכבר תורם SJL במצב נוטה על נדן עבודה נקי, ולהשתמש אחד 13 ס"מ מעוקל משונן קצה של מדפים סימקין להרים את הפרווה בעקב אכילס אחד. באמצעות מספריים עדין מוקשה 8.5 ס"מ עם טיפים ישרים, חתוך את העור בין המדחפים ועקב אחד, הארכת החתך בקריאנית כדי להקל על הסרת העור ופרווה מן הגפיים האחוריות. כאשר העור הוסר מהגפיים האחוריות, חתוך דרך כל מפרק ירך, קרסול וברכיים.
לאחסן את הירך ואת השוק של כל איבר אחורי בצלחת פטרי אחת 92 מ"מ מלא PVS על קרח בזהירות להסיר כמה שרירים ככל האפשר מכל עצם, העברת כל עצם ירך ניקה שוקה לתוך צינור 50 מ"ל של RPMI סטרילי 1640 בינוני על קרח רטוב. כדי לבודד את מח העצם, מעבירים עצם אחת בכל פעם לתבשיל פטרי חדש של 92 מ"ל מלא במדיום RPMI 1640 טרי, ולהשתמש באזמל כדי לחתוך את הקצוות של כל עצם. לאחר מכן, השתמש מזרק 1 מ"ל מצויד מחט 26-מד לשטוף את העצמות עם 1 מ"ל של מדיום טרי בכל פעם לתוך צינור איסוף 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום.
כאשר כל העצמות כבר סמוקות, בעדינות pipette חתיכות מח עצם מתפורר למעלה ולמטה מספר פעמים כדי ליצור השעיה של תא יחיד לפני סינון התאים דרך מסננת תא רשת 40 מיקרומטר לתוך צינור איסוף חדש 50 מ"ל. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את התאים ב 5 מ"ל של אמוניום כלורי אשלגן תמוגה חיץ עבור דגירה של שלוש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לעצור את התגובה עם 10 מ"ל של PVS, צנטריפוגה התאים שוב.
להשעות מחדש את גלולה ב 2 מ"ל של PVS טרי לספירה, ולהניח בצד שש פעמים 10 כדי aliquot התא השישי לניתוח ציטומטרי זרימה במורד הזרם. לאחר מכן, השתמש בערכת טיהור תאים זמינה מסחרית כדי לרוקן מגנטית את תאי ה- T החיוביים של CD90.2 מההשעיה החד-תאית של מח העצם, בהתאם להוראות היצרן, והניח בצד את עליקוט התא השישי של האלוט המדולדל של תאי T לניתוח ציטומטרי של זרימת הזרם במורד הזרם של טוהר התא והרכבו לפני ואחרי ההפרדה. לאחר מכן, השתמש מזרק 1-mL מצויד מחט 30-מד להזריק חמש פעמים 10 לתאי מח עצם מדולדל T-cell החמישי ב 100 microliters של PVS דרך הווריד לתוך החלל retrobulbar של הסינוס הוורידי של כל חיה נמען מוקרן.
למחרת, מניחים טחול שנקטף מבעל חיים תורם על מסננת רשת 40 מיקרומטר בצינור איסוף 50 מ"ל, ולהשתמש בוכנה מזרק ללחוץ על רקמת הטחול דרך מסננת לתוך הצינור. לשטוף את מסננת ובוכנה עם PVS כדי לאסוף את כל הטחול, ו גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר תותבת תאי הדם האדומים הוא הפגין, להשעות מחדש את תאי הדם הלבנים לספירה, ולהניח בצד שש פעמים 10 כדי aliquot התא השישי לניתוח ציטוטי זרימה במורד הזרם.
עבור בידוד תא T3 חיובי הכולל מן הטחול הכולל, להשתמש בערכת טיהור תאים זמינה מסחרית על פי הוראות היצרן, ולהניח בצד פעם אחת 10 כדי aliquot תא T חיובי CD3 השישי מן שבר התא החיובי עבור ניתוח ציטומטרי זרימה במורד הזרם של טוהר התא והרכב לפני ואחרי ההפרדה. לאחר מכן, להזריק שבע פעמים 10 לתאי CD3 חיוביים ALLOREactive החמישי ב 100 microliters של PVS דרך הווריד לתוך שטח רטרובולבר של כל עכבר נמען כדי לגרום GvHD. כדי להבקיע נגעים הקשורים ל- GvHD על ידי מיני אנדוסקופיה של אזור המעי הדיסטלי, הרם את הזנב של בעל חיים נמען ממש מעל שורש הזנב ביד אחת, ולהשתמש ביד השנייה כדי להכניס בזהירות את האנדוסקופ לפי הטבעת דרך פי הטבעת.
בעוד זרם האוויר מנפח את לומן המעיים, לאט ובזהירות להזיז את אנדוסקופ קדימה בכיוון aboral. כדי למנוע פציעות מעי המעי הגס, לשמור על אנדוסקופ באזור האמצעי של לומן באמצעות מסך וידאו חי כדי לסייע במיקום זה. התחל להקליט את זרם הווידאו והבקיע את הדלקת, הערכת דלקת הקשורות GvHD של המעי הגס על ידי ניקוד הפרמטרים כפי שמודגם.
כאשר נקודת ניקוד אותרה, הזז את האנדוסקופ בעדינות ומעט קדימה ואחורה כדי להעריך את הפרמטרים השונים. כדי להעריך את שקוף הפרמטר ועקביות הצואה, מקם את האנדוסקופ במרחק רחב יותר ביחס לקיר המעי הגס. כדי להעריך את הצפיפות ואת כלי הדם של הנגע, למקם את אנדוסקופ בסמיכות לקיר המעי הגס, בזהירות להחיל מתח מנון היטב על הקיר המעי הגס עם קצה האנדוסקופ.
עם השלמת תהליך הניקוד, הפסק את ההקלטה. בהשוואה לפקדים, השתלת תאי גזע hematopoieic allogenic כפי שהוכח מייצרת אינדוקציה חזקה להתרבות של פנוטיפ GvHD מערכתי, עם הגדלת בהדרגה ציוני GvHD קליניים בבעלי חיים הנמען. קריטריונים אלה להערכת מיני אנדוסקופית הותאמו במיוחד קוליטיס סינגנית שדווחו בעבר בהקשר של פרמטרים ניקוד קוליטיס מונחה תגובה allo לתיאור מדויק, ניקוד, ו דירוג של נגעים הקשורים למחלות GvHD במעיים במעי הגס.
ואכן, מערכת הדירוג המבוססת על מיני אנדוסקופיה מאפשרת אפליה קלה של עכברים המקבלים תורמים-לימפוציטים עם סימנים חמורים של דלקת מעיים מעכברי בקרה נטולי GvHD. לעומת זאת, רקמות המעי הגס של עכברי שליטה הראו לא, לכל היותר, סימנים היסטופתולוגיים קלים של דלקת, בהסכמה עם היעדר וירטואלי של סימנים מיני אנדוסקופיים לזיהוי של קוליטיס.
יתר על כן, מחקרי מתאם בין מיני אנדוסקופיה והיסטופתולוגית העריכו פעילות קוליטיס וציוני GvHD מערכתיים מראים כי מיני אנדוסקופית קבעה כמה ציונים של פחות או שווה לשלושה לחזות באופן אמין את היעדר ציונים דלקת המעי הקשורים GvHD בדרגה בינונית עד גבוהה יותר שהתקבלו דירוג היסטופתולוגי. בנוסף, חומרת GvHD מעיים אנדוסקופי מוערך מראה מתאם עם פעילות מחלת GvHD מערכתית. כדי לתקנן את התוצאות של הערכה מיני אנדוסקופית של דלקת קולונית ולהבטיח השוואה בין עכברים וניסויים שונים לאורך זמן, יש לבחור אתר אנטומי מוגדר לניקוד.
בנוסף לדלקת המעי הגס ניקוד, ערוץ העבודה המובנה בתוך ההתקנה האנדוסקופית מיני מאפשר אחזור של ביופסיות רקמות מונחות תצוגה החלות על ניתוחים שונים במורד הזרם, כגון היסטופתולוגיה סטנדרטית. בשל האופי הלא פולשני של המיני אנדוסקופיה, קוליטיס חריפה הקשורה GvHD ניתן להעריך שוב ושוב בתוך אותה חיה כמעט בכל עת, ובכך להניב תובנות מרתקות לתוך GvHD מעיים.
