We thank Dr. Shahid Mukhtar for critiquing the manuscript and Dr. Xinnian Dong for the sample data analysis file. This work is supported by a NSF-CAREER award (IOS-1350244) to KPM and the UAB Biology Department.

יש המחברים אין לחשוף.

בהפחתה חקלאית זמין והגדלת אוכלוסייה, חוקרים ברחבי העולם מאותגרים עם צרכי דחופים ליבול השבחה. התשואה יכולה להיות מושפעת במידה רבה מלחצי יוטיים ואביוטי מגוון. ביניהם, זיהום הפתוגן הוא אחד הגורמים המובילים של הפחתת תשואת יבול, אחראי לכ -12% הפסדים בארה&quot;ב 45 בלבד. כ...

בשל אופיים הנייח, צמחים מאוימים ללא הרף על ידי שפע של פתוגנים המציגים את אורח החיים שונים ואסטרטגיות תזונתיות 1. להערכה ראשונה, פתוגנים biotrophic לשומרם מארח בחיים כדי לאחזר חומרים מזינים, ואילו רעלים באופן פעיל סוד פתוגנים necrotrophic ואנזימים להרוג רקמת מארח ולהאכיל על התאים המתים 1. קבוצה נוספת של פתוגנים, hemibiotrophs מכונה, מתחילה כמובן הזיהום שלהם עם שלב biotrophic ומשמרות לשלב necrotrophic עם הגיע לסף מסוים של הפתוגן הצטברות 2. על מנת להגן על עצמם יעילות נגד מיקרואורגניזמים אלה, צמחים התפתחו מערכת חיסון מולדת מסובכת מצויד במנגנון מעקב מרובה כדי לזהות את התקפת הפתוגן ולעורר מקומיים מתוכנת תא מוות 3, כמו גם התנגדות המערכתית נרכשת (SAR) 4. על אפיון sig החיוני מחקר נוכחי מתמקדרכיבי naling וצלב-שיחות בתוך המערכת החיסונית הצמח 5. כפי שהוצע במודל &quot;זיג-זג&quot; 5, השכבה הראשונה של התגובה החיסונית המולדת הצמח דורשת הנוכחות של תבנית-מקומי קרום פלזמה ההכרה רצפטורים (PRRs) כדי לזהות את הפלישה של חיידק. PRRs מסוגל לזהות דפוסי חיידקים, Associated מולקולרי (MAMPs) ולהקים חסינות מופעלת על-MAMP (MTI) 6. מלבד גרימת upregulation תעתיק של גני המקודדים חלבוני יחסי ציבור מיקרוביאלית 7, MTI מוביל למגוון רחב של אירועים שיעצור את צמיחת הפתוגן, כוללים הייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS) ומיני חנקן תגובתי (RNS), בתצהיר של callose לקיר התא כמו גם את ההפעלה של איתות קינאז מרובה מסלולי 8. עד עכשיו, כמה MAMPs זוהה להפעיל MTI בארבידופסיס, לרבות flg22 חיידקי 9 </sup&gt; (שבר 22 חומצות אמינו הנגזר מflagellin), elf18 10 (18 חומצות אמינו מגורם חיידקי התארכות תרגום ט&quot;ו) וקיר תא רכיב מבני peptidoglycans 11. להקים זיהום מוצלח, כמה פתוגנים מיוחדים התפתחו יכולת חלבוני מפעיל אלימות סוד לחללים תאיים או אינטר, וכתוצאה מכך להדחיק MTI ולעורר רגישות מופעלת על-מפעיל (ETS) 12,13. לדוגמא, effectors הארסיות יכולה להשבית מפלי קינאז זירחון (MAPK) חלבון פעיל-mitogen של MTI לגרום להתפתחות המחלה בתוך הרקמה נגועה 14-16. במהלך שיתוף האבולוציה הדינמית בין מארחים ופתוגנים, צמחים פיתחו גם את אסטרטגית התקפת נגד להכיר חלבוני מפעיל ולהחליש את ארסיות הפתוגן מולקולות 17. הכרת מפעיל ישירה או עקיפה זה מתווכת על ידי התנגדות מחלה חלבונים (R) 18. רוב tאמרה הן חברים של NB-LRR (נוקלאוטיד כריכה ולאוצין-ריץ חזרות) משפחה 19. התפיסה של מפעיל לֹא אַלִים ידי חלבון R מעורר תגובה חיסונית חזקה יותר ורחב יותר מאופיינת כחסינות מופעלת על-מפעיל (ETI) 20. מלבד גרימת הביטוי של גני ההגנה 21 והייצור של מטבוליטים הגנה 22, אתי לעתים קרובות מוביל למוות מהיר מקומי לתכנת תאים הידועים כרגישה להפליא תגובה (HR) כדי להגביל את הפתוגן מלהתפשט לרקמות הסמוכות 3. בנוסף למקומי מתוכנת המוות של תאי 23, צמחים מסוגלים ליזום טווח ארוך ותגובה חיסונית מערכתית כינה מערכתית נרכשת התנגדות (SAR) 4. על אתגר עם הפתוגן biotrophic, תאי צמח לעורר את ביוסינתזה והצטברות של חומצה סליצילית phytohormone אנדוגני (SA) וחלבוני יחסי הציבור בשתי רקמות מערכתיות ומקומיות 24. באמצעות tהתהליך שלו, מדינה מוגברת של מוכנות מושגת בעלים נגוע המאפשר להרכבת תגובות הגנה מהירות יותר במהלך זיהום לאחר מכן על ידי קשת רחבה של פתוגנים 24. SA ותחליפיו סינטטיים כגון benzo- (1,2,3) -thiadiazole 7-carbothioic-אסתר -methyl S החומצה (BTH) וחומצת 2,6-dichloroisonicotinic (INA) מסוגלים כימי התרמה חומצה סליצילית (SA) חסינות -Triggered (STI) על יישום חיצוני 24. Nonexpressor של גנים הקשורים פתוגנזה 1 (NPR1) מוצע לאחד את הקולטנים SA ומתפקד כרגולטור תעתיק עיקרי בתגובת הגנת תיווך SA בשתי רקמות מערכתיות ומקומיות 21,25,26. הוכח בודאות כי NPR1 נדרש לכינון SAR ואובדן NPR1 מוביל לרגישות דרמטית לקראת syringae Pseudomonas 25. הרחבה לאפיין את התרומה המולקולרית של צמחרכיבים באינטראקציות צמח לפתוגן, bioassays מרובה פותחו כדי למדוד אירועים ביטחוניים ספציפיים, כולל ROS פרץ 27, callose תצהיר 28, ביטוי גני הגנה והצטברות של מוצרי החלבון שלהם 21. בעוד מבחני הבודדים אלה יכולים לספק תובנות צורה מסוימת של התגובה החיסונית הצמח, אף אחד מהם, לעומת זאת, יכול לייצג את תגובת הגנה המלאה ברמת המפעל כולו. לעומת זאת, כימות של צמיחת הפתוגן לאחר ההדבקה מספקת הערכה כוללת של תגובה חיסונית ברמת האורגניזם. לכן, הפיתוח ואופטימיזציה של assay חיסון הפתוגן מדויק ואחיד ביותר הוא קריטי לדלק את המחקר ותגליות בתגובות החיסונית ארבידופסיס. Pseudomonas syringae, חיידק גראם שלילי, זוהה כphytopathogen מסוגל לגרום למחלות במגוון של מארחי מפעל כולל Arabidopsהוא 29. כמערכת מודל הצמח לפתוגן, ארבידופסיס - פ האינטראקציה syringae כבר מיושמת באופן נרחב כדי להבין את המנגנונים המולקולריים תגובות הגנת צמח בסיס 29. עד עכשיו, יותר מ- 50 P. pathovars syringae זוהה על סמך יכולתם כדי להדביק מיני צמחים שונים 30 . פ syringae PV. DC3000 עגבניות (PST DC3000) 31 ופ syringae PV. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 שני זנים אלימים ביותר בשימוש נרחב והרחבה המאופיינת. מלבד להיות מוכר על ידי המפעל ומפעיל את תגובת MTI, PST DC3000 וPSM ES4326 מסוגל להפריש חלבוני מפעיל ארסיים לדכא MTI ולעורר ETS להעדיף 31,33 צמיחת הפתוגן. פונקציונלי לנתח את האינטראקציה בין ארבידופסיס ופ syringae, מרובה0; שיטות זיהום הפתוגן פותחו בהתבסס על גישת מסירת הפתוגן. לצמחים שגודל באדמה, הפתוגן יכול להיות מועבר על ידי חדירת מזרק, חדירת אבק, חיסון טבילה וחיסון תרסיס 29,34. לאחרונה, assay שיטפון חיסון השתיל פותח כדי לבצע מסכי בקנה מידה גדול בתרבית רקמת צלחות גדלו צמחי ארבידופסיס צעירים 35. חדירת מזרק, כאחד מהגישה הנפוצה ביותר, באופן ידני מספקת את הפתוגן לאפופלסט דרך הפתחים טבעי העלה כינו הפיוניות 29. באמצעות גישה זו, כמויות שווה מפ syringae יכול להיות חדר לעלה הנגוע ואת הכוח של תגובה חיסונית מפעל בקורלציה הופך לרמות צמיחת הפתוגן. לכן, כימות של צמיחת הפתוגן משמשת כגישה אופטימלית כדי להעריך את תפקוד מערכת החיסון ברמת המפעל כולו. בנוסף, חדירת מזרק יכולה להבחין הרקמה מערכתית והמקומית, שיכול בדואר החל באפיון המנגנונים המולקולריים שבבסיס SAR 36. בפרוטוקול הבא, אנו מתארים assay חדירת מזרק מותאם עם PSM ES4326 למסך מוטציות ארבידופסיס לרגישות מוגברת למחלות (EDS). פרוטוקול זה יעסיק שני גנוטיפים ארבידופסיס: אקוטיפ wild-type קולומביה-0 (Col-0) צמחים (שליטה) ומוטציות פסד של הפונקציה npr1-1 (רגיש במידה קיצונית) אשר נגוע בזן חיידקים הארסי PSM ES4326 37. המוטציה npr1-1 נושאת מוטציה נקודה בתוך רצף קונסנסוס ankyrin-חוזר של מולקולת NPR1, אשר משנה את היסטידין השמור ביותר לטירוזין והופך את החלבון שאינו פונקציונלי 25. בנוסף, מספר השינויים של assay חדירת מזרק מתואר המאפשר כימות של פגמים בשכבות מסוימות של תגובה חיסונית, כולל MTI וSTI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MetroMix 360&#160;</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>SNGMM360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large pots</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>TEKUVCC10TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x6 Inserts</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>LM1206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11x21 Flats with no holes</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>LM1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11x21 Flats with holes</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>LM1020H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl propagation domes</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>CW-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0122-17-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>151946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A360-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>SB0494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150x15mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R80150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-450&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Hexahydrate</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>MB0328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#160;</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>MN1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9992493&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding tubes&#160;</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>B1257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps for grinding tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>B1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding ball</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Salicylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>s3007-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>Made to order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>Made to order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher</td>
			<td>Staples</td>
			<td>146308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>952000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen High-Throughput Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu spin micro centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette (10-100 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122 000.043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette (30-300&#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122 000.060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (20&#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120 000.038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3552-HR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpie permanent marker</td>
			<td>Staples</td>
			<td>507130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-890</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the arabidopsis thaliana-pseudomonas syringae pathosystem

בהיעדרם של תאים חיסוניים ניידים מיוחדים, צמחים לנצל מקומי מותם המתוכנת תא והמערכתי נרכשת ההתנגדות להגן על עצמם נגד התקפת הפתוגן. תרומתו של גן ארבידופסיס ספציפי לתגובה החיסונית הצמח הכולל יכולה להיות ספציפי וכמותית הוערכה על ידי מנסה לאמוד את צמיחת הפתוגן בתוך הרקמה נגועה. במשך יותר משלושה עשורים, את חיידק Pseudomonas hemibiotrophic syringae PV. Maculicola ES4326 (ES4326 PSM) כבר מיושם באופן נרחב כמחולל מחל המודל כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התגובה החיסונית ארבידופסיס. כדי לספק פתוגנים לתוך רקמת העלה, שיטות חיסון מרובות הוקמו, למשל, חדירת מזרק, חיסון טבילה, ריסוס, חדירת אבק, וחיסון מבול. הפרוטוקול הבא מתאר שיטת חדירת מזרק מותאמת לספק ארסי PSM ES4326 לעלים של מבוגריםהאדמה גדלה צמחי ארבידופסיס ומדויק למסך לרגישות משופרת מחלה (EDS) לפתוגן זו. בנוסף, פרוטוקול זה ניתן להשלים עם-טיפולים מראש מרובים לנתח נוסף פגמים חיסוניים ספציפיים בתוך שכבות שונות של הגנת צומח, הכוללים חומצה סליצילית (SA) חסינות -Triggered (STI) וחסינות מופעלת על-MAMP (MTI).

הפרוטוקול אנו מתארים כאן מייצג פ מותאם assay חדירת מזרק syringae להעריך כמותית את התגובה החיסונית בצמחי ארבידופסיס. כפי שמודגם באיור 1, חדירת המזרק של PSM ES4326 ואחריו חילוץ הפתוגן וכימות באמצעות מניין דילולים ומושבות סידוריים. <p class="jove_content" style=";...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem at JoVE

בדיקת חדירת עלים חיידקיים לאפיון עדין של תגובות הגנת הצמח באמצעות הפתולוגיה של Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae | אימונולוגיה וזיהום | וִידֵאוֹ

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות<em&gt; Thaliana-Pseudomonas ארבידופסיס syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

bacterial-leaf-infiltration-assay-for-fine-characterization-plant

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Plant Biology

Plant Responses to the Environment

SCIENTISTS IN ACTION

21.5K Views.  University of Alabama at Birmingham. Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

Video: Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Plants

To perceive potential pathogens in their environment, plants use pattern recognition receptors (PRRs) present on their plasma membranes. PRRs recognize conserved microbial features called pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and this detection leads to PAMP-triggered immunity (PTI), which effectively prevents colonization of plant tissues by non-pathogens1,2. The most well studied system in PTI is the FLS2-dependent pathway3. FLS2 recognizes the PAMP flg22 that is a component of bacterial flagellin. 
Successful pathogens possess virulence factors or effectors that can suppress PTI and allow the pathogen to cause disease1. Some plants in turn possess resistance genes that detect effectors or their activity, which leads to effector-triggered immunity (ETI)2.
We describe a cell death-based assay for PTI modified from Oh and Collmer4. The assay was standardized in N. benthamiana, which is being used increasingly as a model system for the study of plant-pathogen interactions5. PTI is induced by infiltration of a non-pathogenic bacterial strain into leaves. Seven hours later, a bacterial strain that either causes disease or which activates ETI is infiltrated into an area overlapping the original infiltration zone. PTI induced by the first infiltration is able to delay or prevent the appearance of cell death due to the second challenge infiltration. Conversely, the appearance of cell death in the overlapping area of inoculation indicates a breakdown of PTI. 
Four different combinations of inducers of PTI and challenge inoculations were standardized (Table 1). The assay was tested on non-silenced N. benthamiana plants that served as the control and plants silenced for FLS2 that were predicted to be compromised in their ability to develop PTI.

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern PAMP-Triggered Immunity PTI in Plants

A cell death-based assay for PTI in Nicotiana benthamiana plants is described.

Assay עבור תבנית הפתוגן-Associated מולקולרית (PAMP)-שהופעלו חסינות (PTI) בצמחים

To perceive potential pathogens in their environment, plants use pattern recognition receptors (PRRs) present on their plasma membranes. PRRs recognize ...

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

מיקרוגל Assisted אבחון מהיר של מחל וירוס צמח על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

מדידת עומס בקטריאלי ותגובות החיסון של עכברים נגועים עם חיידקי ליסטריה</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

ויזואליזציה של תגובות מושרות רעלן של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא החי

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of innate immunity are conserved between insects and mammals, and since Drosophila can readily be genetically and experimentally manipulated, they are powerful for studying immune system function and the physiological consequences of disease. The procedure demonstrated here allows infection of flies by introduction of bacteria directly into the body cavity, bypassing epithelial barriers and more passive forms of defense and allowing focus on systemic infection. The procedure includes protocols for the measuring rates of host mortality, systemic pathogen load, and degree of induction of the host immune system. This infection procedure is inexpensive, robust and quantitatively repeatable, and can be used in studies of functional genetics, evolutionary life history, and physiology.

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

זיהום חיידקים מערכתי וחיסון ביטחון פנוטיפים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

יישום של assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי אנזים צמוד להערכת תגובות תא מפעיל וזיכרון T בבקר

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

אפיון של אימונוגלובולינים התימוס תלוית ועצמאי התימוס תגובות Isotype בעכברים באמצעות אנזים-מקושרים Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...