תבנית-המופעל חמצוני ושתיל עיכוב הצמיחה שתילה Assays באריידרופסיס thaliana

בדיקות אלה ניתן להשתמש כדי להעריך ולהשוות תפוקות החיסון של גנוטיפים צמחיים שונים. היתרון העיקרי של טכניקות אלה הוא שהם מהירים, אמינים, ולהשתמש בציוד מעבדה משותף. עבור עיכוב הצמיחה להגיד, שתילים באותו גודל וגיל צריך להיות מושתל לחלוטין כתם יבש לפני השקילה כדי להגביל את הווריאציה.

לאחר נביטה של ארבעה עד חמישה שבועות, השתמש באגרוף ביופסיה חד של ארבעה מילימטרים כדי להסיר דיסק עלה אחד לכל צמח Arabidopsis, הימנעות midvein נזהר להגביל את הפציעה. לאסוף את הדיסקים לתוך בארות בודדות של צלחת לומינומטר 96-well שאינם שימוש המכיל 100 microliters של מים מזוקקים כפולים לתוך באר, צד adaxial למעלה, כדי למנוע ייעוד. אם מעריכים מספר מעוררים, מסירים דיסק עלה שני מאותו עלה עבור כל טיפול מעורר, ומכסים את הצלחת במכסה כדי לאפשר לדיסקים העלים להתאושש בן לילה בטמפרטורת החדר.

למחרת בבוקר, הגדר את הפרמטרים של קורא המיקרופלסטיק לזמן אינטגרציה של 1,000 אלפיות שניה במרווחים של שתי דקות לאורך תקופה של 40 עד 60 דקות כדי ללכוד את פרץ החמצון הדינמי. לאחר מכן, השתמש פיפטה רב ערוצית להחליף את המים בכל באר עם 100 microliters של פתרון תגובה מוכן טרי, כולל שליטה, אין תגובה מעוררת עבור כל גנוטיפ כדי להעריך את רמות מיני חמצן התגובה הבסיסית בהיעדר עוררות. לאחר מכן, מיד למדוד את פליטת האור עבור כל אורכי הגל בספקטרום הנראה על קורא מיקרופלסטיק.

בארבעה ימים לאחר הנביטה, לטעון כל באר של צלחת 48 באר עם 500 microliters של מדיום MS בתוספת דילול של פפטיד elicitor. לאחר מכן, השתמש במטלפים סטריליים כדי להשתיל בזהירות שישה עד שמונה שתילים באותו גודל, גיל וגנוטיפ לכל דילול פפטיד, תוך טיפול שום נזק השתיל או שבירה לשורש, כי השורש שקוע בינוני. כאשר כל השתילים כבר מצופים, לאטום את הצלחות עם סרט Micropore, ולמקם את הצמחים בתנאים סטנדרטיים של יום קצר במשך שמונה עד 12 ימים.

כדי לקבוע את עיכוב הצמיחה באחוזים, צלם תמונה כדי לתעד חזותית את עיכוב הגדילה לפני שתסיר בזהירות את השתילים מכל באר. לאחר מכן, לטבול את השורשים על מגבת נייר להתייבש, ולשקול כל שתיל בקנה מידה אנליטי. בניסוי מייצג זה, צמחים מוטנטים עם איתות חיסוני היפראקטיבי הדגימו פרץ חמצוני מצטבר וממוצע גבוה יותר בהשוואה לצמחים ערבידופסיים מסוג בר, ואילו צמחים מוטנטים עם איתות חיסוני לקוי הציגו פרץ חמצוני מופחת בריכוזים שבין 10 ל -1,000 ננומולרים.

ניתן להבחין גם בהבדלים הצפויים בעיכוב צמיחת השתילים בין כל הגנוטיפים הגדלים ב-100 וב-1,000 ריכוזי פפטיד ננו-מולאריים. כאשר גדל 1, 000 דילול פפטיד nanomolar, המוטנטים עם איתות חיסוני היפראקטיבי היו קטנים משמעותית מאשר צמחים מסוג בר גדל באותם תנאים, בעוד המוטנטים עם איתות חיסוני לקוי הציג עיכוב חלש של צמיחה יחסית לצמחים מסוג בר. שיטות אלה מספקות ראיות לתגובות חיסוניות מוקדמות ומאוחרות.

מספר טכניקות אחרות, כולל מסיכי MAP kinase, ביטוי גנים הנגרמים על ידי פתוגן, ו assays זיהום, ניתן להשתמש כדי לתוות מסלולים אלה. טכניקות אלה שונו לשימוש במסכים בקנה מידה גדול, אשר זיהו בהצלחה חלבונים קולטן פתוגן וכמה רכיבי איתות אחרים.