עבודה זו נתמכת על ידי הפרויקט ממומן על-KAIST K-העמק האדום וארוחת בוקר לשינה 2014 ותכנית מחקר המדע בסיסי באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).

<ol>
	<li>Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipids:+where+they+are+and+how+they+behave.">Membrane lipids: where they are and how they behave.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).</li><li>Christon, R., Even, V., Daveloose, D., L&#233;ger, C. L., Viret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+fluidity+and+lipid&#8212;protein+relationships+in+pig+intestinal+brush-border+membrane+by+dietary+essential+fatty+acid+deficiency.">Modification of fluidity and lipid&#8212;protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency.</a> Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).</li><li>Stubbs, C. D., Smith, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modification+of+mammalian+membrane+polyunsaturated+fatty+acid+composition+in+relation+to+membrane+fluidity+and+function.">The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).</li><li>Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+landscapes+and+pipelines+in+membrane+homeostasis.">Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis.</a> Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).</li><li>Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+lung+surfactant+where+it+belongs:+protein+regulation+of+two-dimensional+viscosity.">Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity.</a> Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).</li><li>Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cholesterol+nanodomains+on+monolayer+morphology+and+dynamics.">Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).</li><li>Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Lipid+Membrane+Viscosity+Using+Rotational+and+Translational+Probe+Diffusion.">Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion.</a> Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101 (2014).</li><li>Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a., Schwartz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+needle+viscometer+for+Langmuir+monolayers.">Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers.</a> Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).</li><li>Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+interfacial+shear+microrheology+of+aging+protein+films.">Active interfacial shear microrheology of aging protein films.</a> Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).</li><li>Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+microrheology+of+DPPC+monolayers+at+the+air-water+interface.">Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface.</a> Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).</li><li>Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+microrheology+and+simultaneous+visualization+of+sheared+phospholipid+monolayers.">Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers.</a> Nature Commun. 2 (5), 312 (2011).</li><li>Caruso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+lateral+diffusion+coefficients+in+air-water+monolayers+by+fluorescence+quenching+measurements.">Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements.</a> J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).</li><li>Filippov, A., Or&#228;dd, G., Lindblom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesterol+on+the+lateral+diffusion+of+phospholipids+in+oriented+bilayers.">The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers.</a> Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).</li><li>Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+single-molecule+sensitivity+on+cell+and+model+membranes.">Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes.</a> Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).</li><li>Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+photobleaching+(FRAP)+experiments+under+conditions+of+uniform+disk+illumination.+Critical+comparison+of+analytical+solutions,+and+a+new+mathematical+method+for+calculation+of+diffusion+coefficient+D.">Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D.</a> Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).</li><li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+diffusion+of+lipids+in+liquid+crystalline+phase+phosphatidylcholine+multibilayers.+A+comparison+of+experiment+with+theory.">Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory.</a> Biochemistry. 24 (3), 781-786 (1985).</li><li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+in+phospholipid+multibilayers+measured+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3836-3841 (1977).</li><li>Peters, R., Beck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+diffusion+in+phospholipid+monolayers+measured+by+fluorescence+microphotolysis.">Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).</li><li>Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H., Crawley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical Methods of Chemistry. 1, Part 3B, 651-653 (1972).</li><li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure.">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).</li><li>Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+surface+tension+and+contact+angle+from+the+shapes+of+axisymmetric+fluid+interfaces.">Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces.</a> J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).</li><li>Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+merging+a+surfactant-covered+droplet:+a+novel+technique+to+measure+the+diffusion+of+phospholipid+monolayers+at+fluid/fluid+interfaces.">Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces.</a> Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest.

פראם חולק הרבה עקרונות יסוד עם FRAP, במיוחד למדידת התאוששות הקרינה לאחר הלבנת אזור מסוים, אבל פראם משתמש בתהליך של מיזוג אגל על ​​הממשק השטוח כדי ליצור אזור מולבן, במקום ליישם אור אינטנסיבי. תהליך המיזוג הוא כך צעד החשוב ביותר בפראם, ובמיוחד, את הצורה של הכתם הכהה בmonolayer השטוח לאחר מיזוג טיפה קובעת את הדיוק של מדידת diffusivity. באופן ספציפי, המבוססים על שיטה נוכחית, שרק להגדיר את המעגל עם רדיוס R כאזור של עניין כדי לחשב את העצמה הממוצעת של הכתם הכהה, המוצגת בהליך 4, ואם יש סטייה גדולה מדי מהצורה העגולה, זה יפריע המדידה המדויקת של מקדם הדיפוזיה. לכן, יש צורך להשיג אזור כהה בצורה מעגלית, אבל, צורות noncircular נוצרות לעתים בשל מספר סיבות. ראשית, אם קיים זרימת הסעה בחיות המחמדצלחת רי, את הצורה של האזור הכהה הופכת מוארכת לאורך כיוון הזרימה. כאמור בהליך 1.3, מכשיר קונוס-צורה מסייע לדכא את זרימת ההסעה, והתארכות זו תהיה מזערית. שנית, אם סוף קצה הנימים נוגע ממשק השטוח בתהליך מיזוג, האזור הכהה נוצר עם מגוון רחב של צורות מאז סוף הנימים קוטע את תהליך המיזוג. על ידי קבלת טיפה שתלוי רק מהסוף מאוד של הנימים, ניתן למנוע הפרעה זו. בפרט, טיפול הידרופובי של הנימים עוזר הטיפה לשבת בסוף מאוד של הנימים. לכן, ירי צרות לעיל ושינויים יאפשרו לנו למדוד תכונות דיפוזיה מדויקת יותר. תהליך זה troubleshot גם כך מאפשר פראם יש כמה יתרונות משמעותיים על פני FRAP. ראשית, פראם דורש ציוד פשוט בהשוואה לFRAP. לפראם, זה מספיק כדי להשתמש במייקרו הקרינה פשוטלהתמודד, במקום מיקרוסקופ confocal יקר עם לייזר בהספק גבוה באורך גל שחייב להתאים עם ספקטרום הבליעה של הצבע. בנוסף, יש צורך להשתמש במכשיר נוסף כדי להתאים את הגודל לאזור מולבן בFRAP, תוך פראם שולט בגודל השטח בקלות על ידי התאמת גודל הטיפה, או לחץ המשטח על פני השטח אגל. שנית, ניתן להשתמש במינים שונים של צבעים בפראם. FRAP משתמש רק מולקולות צבע הלבנה שתהליך הוא הרבה יותר מהר מאשר תהליך דיפוזיה. אם דיפוזיה של הצבעים מתרחשת במהלך תהליך ההלבנה, קשה להעריך את רכוש דיפוזיה מדויקת. פראם, לעומת זאת, אינו דורש תהליך להלבנת צבעים וזה ובכך מאפשר שימוש בסוגים שונים של צבעים בהדמית הקרינה. בנוסף, דורש FRAP לייזרי מתח גבוה נוספים ומסנן קובע לשנות את מיני צבע, בזמן שהוא רק צורך להחליף את מערכות הסינון בפראם. לבסוף, מאז monolayers על פני השטח אגל והממשק השטוח יכול להיווצר באופן עצמאי, ובכך לאפשר את הלימוד בין-דיפוזיה או ערבוב בין שני monolayers שומנים שונה על ידי מיזוג מסוג monolayer לmonolayer B-הסוג, בעוד FRAP מודד רק דיפוזיה עצמית של שכבה. למרות יתרונות אלה, תהליך איחוד אגל על ​​ממשק אוויר מים שטוח עלול להגביל בטכניקה זו בשל כמה בעיות שעלולות להיות לדאגה, כגון אי-התאמת לחץ משטח בין שני monolayers, בקנה מידה של תהליך מיזוג הזמן , ועלייה בלחץ פני השטח של monolayer השטוח לאחר מיזוג טיפות. נושאים אלה, עם זאת, אינם משפיעים על מדידת דיפוזיה באופן משמעותי מהסיבות הבאות. ראשית, למרות שלחצי המשטח בשני monolayers שונה הם שונים לגמרי, תהליך איזון יושלם בשלב מוקדם מאוד בתהליך ההחלמה. לדוגמא, אם לאהוא משטח לחץ של monolayer על פני השטח הטיפה גבוה יותר מזה של monolayer בממשק אוויר מים השטוח, האזור הכהה מתרחב עד לחץ משטח equilibrates. מכיוון שתהליך זה יושלם בתוך 10 אלפיות שני, לחץ המשטח יהיה equilibrated לפני זה משפיע על תהליך דיפוזיה באופן משמעותי. שנית, אם בקנה מידה של תהליך מיזוג הזמן הוא מספיק מהר, זה לא להגביל את מדידת דיפוזיה בכלל. למרבה המזל, תהליך מיזוג אופייני גם יושלם בתוך 10 אלפיות שניים. לבסוף, גם מיזוג מרובה של הטיפות על הממשק השטוח לא להגביר את הלחץ מאז את שטח הפנים של שוקת המשטח הוא גדול בהרבה משטח הפנים של הטיפה. על פי הגדלים של השוקת והטיפין, שתוארה בפרוטוקול, האזור למולקולה מגביר פחות מ 0.015% על ידי מיזוג אגל. בהתאם לכך, הגידול של לחץ משטח עקב השינוי של אזור כל מולקולה הוא פחות מ -0.1%, שהוא negligiblדואר כי זה הרבה יותר קטן מהשגיאה האופיינית בלחץ משטח, כפי שנמדד על ידי tensiometer צלחת Wilhelmy. לסיכום, הצגנו שיטה חדשה למדידת רכוש דיפוזיה לרוחב של monolayer פוספוליפידים ידי מיזוג monolayer אגל על ​​הממשק השטוח. טכניקה זו דורשת ציוד פשוט יחסית וגם מאפשרת השימוש בסוגים שונים של מיני צבע. פראם הוא בכך שעלול להיות רלוונטי למדידת דיפוזיה של כל סוכנים פעילים שטח, כוללים פוספוליפידים, קופולימרים לחסום, חלבונים ואפילו חלקיקים בנוזל ממשק-נוזל. יתר על כן, אנו מצפים שפראם מספק דרך חדשה ללמוד בין-דיפוזיה או ערבוב בין שני סוכנים פעילים שטח שונים.

<html> פוספוליפידים הם רכיבים עיקריים של קרום תא והקרומים של האברונים, ואת הנזילות של שכבות קרום אלה לעתים קרובות משפיעים על תפקודים תאיים על ידי שינוי הפעילות של חלבונים בממברנה 1 - 3. לדוגמא, קרום &#160; הומאוסטזיס שומנים מושגת על ידי ויסות זרימת קרום, שהוא זוהה על ידי חלבונים בממברנה, ורמה חריגה של נזילות גורמת למחלות קשות, כגון steatosis וcholestasis 4 בכבד. בנוסף, יש נזילות של monolayer פוספוליפידים בממשק נוזל אוויר alveoli השלכות חשובות בפונקציות שלה. נזילות גבוהות של monolayer פוספוליפידים שטח הריאה מקלות הפצה של השכבה בשאיפה, ואילו נזילות נמוכות מאפשרת השכבה להישאר בתוך alveoli במהלך הנשיפה 5,6. מכיוון שכך, חשוב להעריך את הנזילות של שכבות פוספוליפידים להבין את תפקידם. _content &quot;&gt; מדידה ישירה של הנזילות היא צמיגות, והצמיגות של שכבות פוספוליפידים כבר נמדדה באמצעות קולואידים בגודל מיקרון 7, מחטים מגנטיות 8,9, ומיקרו-כפתורים מגנטיים 6,10,11. עם זאת, טכניקות אלה מוגבלים לסרטים קשיחים יחסית, ולא יכול למדוד סרטים פחות צמיגים. במקרים כאלה, diffusivity יהיה אלטרנטיבה ללכמת נזילות של שכבות פוספוליפידים. במשך כמה עשורים, מגוון של טכניקות כדי למדוד את תכונות דיפוזיה של שכבות פוספוליפידים פותחו, כגון שיטת הקרינה מרווה 12, NMR שיפוע השדה פעמו 13, וספקטרוסקופיה מתאם הקרינה (FCS) 14. אחת השיטות מייצגות ביותר היא התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) 15,16. בשל הפשטות של הליך המדידה וקשור תאוריות, כמה מחקרים על תכונות דיפוזיה של שכבות פוספוליפידים בוצעו באמצעות FRAP <sup&gt; 17-19. עם זאת, בדרך כלל דורש FRAP התקנת מיקרוסקופ confocal יקר עם לייזר בעצמה גבוהה. כאן, אנו מציגים טכניקה חדשה למדידת דיפוזיה לרוחב של monolayers פוספוליפידים, כפי שכונה התאוששות הקרינה לאחר המיזוג (פראם). ההבדל העיקרי בין FRAP ופראם הוא שצעד photobleaching הוא הוחלף על ידי גיבוש הירידה. מיזוג אגל מכוסה על ידי monolayer אינו הקרינה על monolayer השטוח שכותרתו fluorescently משאיר כתם כהה מעגלי על monolayer השטוח בהיר, ולכן הגדרה אותו מצב ראשוני עם צעד photobleaching. לאחר מכן, אנו צופים בהתאוששות הקרינה בכתם הכהה עם זמן למדוד את diffusivity לרוחב. צעד זה חדש &quot;הלבנה&quot; על ידי גיבוש ירידה מספק יתרונות משמעותיים על פני FRAP: פראם דורש מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולא מיקרוסקופ confocal יקר עם לייזר בהספק גבוה שיש צורך לFRAP בלבד. אניבנוסף n, יש פראם מבחר רחב של צבעי הקרינה שכן הוא אינו כרוך בתהליך photobleaching. לבסוף, שני monolayers שונה, monolayer אגל וmonolayer שטוח, ניתן להכין באופן עצמאי, ובכך מאפשרים interdiffusion להימדד, בעוד FRAP מודד את דיפוזיה העצמית של monolayers בלבד. פראם מספק מגוון רחב של מדידות דיפוזיה מחומרים צמיגים מאוד לחומרים כמעט בלתי צמיגים. בעיקרון, פראם ניתן למדוד את diffusivity המרבי של 10 מיקרומטר 6 2 / sec, אשר ניתן להשוות טכניקות קיימות, כאשר מתרחשת דיפוזיה על פני השטח של 100 מיקרומטר על ידי 100 מיקרומטר בזמן לתהליך גיבוש ירידה (~ 10 אלפיות השנייה). יתר על כן, ניתן למדוד תהליך דיפוזיה איטי בקלות, אלא אם כן monolayers הוא מוצקים. פראם יכול לשמש לכל מיני סוגים של חומרים פעילים שטח, כל עוד מולקולות מתויגות fluorescently מתאימים זמינות.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>OCI corporation</td><td>Acetone 3.8L Extra Pure</td><td>Purity: &amp;ge; 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>OCI corporation</td><td>Ethanol 3.8L Extra Pure</td><td>Purity: &amp;ge; 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td></tr><tr><td>Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td>Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>LiChrosolv</td><td>Chloroform ultrapure (A3633)</td><td>Purity: &amp;ge; 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic</td></tr><tr><td>Rhodamine DPPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C, 810158P</td><td>Avoid direct light exposure to prevent photobleaching</td></tr><tr><td>Wilhelmy plate tensiometer</td><td>R&amp;amp;K ultrathin organic film technology</td><td>Wilhelmy tensiometer</td><td>http://www.rieglerkirstein.de/index.htm</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Micro-injector</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Micromanipulator 5171</td><td></td></tr><tr><td>Microscope 1</td><td>Objective lens: Olympus</td><td>Objective lens: UPlanFl 10x</td><td>Objective lens: 10X NA 0.3</td></tr><tr><td>Microscope 2</td><td>Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs</td><td>Objective lens: UPlanFl 10x</td><td>Objective lens: 10X NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm</td></tr><tr><td>CCD for Microscope 1</td><td>Jai</td><td>CV 950 camera</td><td></td></tr><tr><td>CCD for Microscope 2</td><td>Andor</td><td>iXon3 EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Filter set</td><td>Chroma technology</td><td>Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605</td><td>Prepare suitable for dye molecules</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>Wiseclean WUC-D06H</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence recovery after merging a droplet to measure the two-dimensional diffusion of a phospholipid monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

סדרה של תמונות הקרינה התקבלו עם זמן בתהליך ההתאוששות לאחר מיזוג אגל מצופה monolayer dOPC על monolayer dOPC שטוח, כפי שמופיעה באיור 1. Monolayer dOPC בממשק אוויר מים השטוח היה מסומם עם כמויות נמוכות של Rhodamine-DPPE, וזה ובכך הפך אותו אפשר לדמיין רקע עם צבע בהיר וכהה באזור חדש שנוסף לממשק השטוח. יש, תהליך התאוששות נצפה בMN 23 / מ &#39;של לחץ משטח קבוע. בכושר של משוואת 1 לשינוי של עוצמת השבר לפי הזמן מוצג באיור 2. R 2 הערך של כושר זה הוא 0.999, ובכושר זה עדיין עובד היטב גם בלחצי משטח נמוכים או גבוהים יותר. מקדם דיפוזיה של monolayer dOPC מתקבל מכושר זה היה 27.54 מיקרומטר 2 / sec בMN 23 / ​​מ &#39;של לחץ פני השטח. לאימות נוספת של פראם, מקדמי דיפוזיה של DOמחשב וdipalmitoylphosphatidylcholine monolayers (DPPC) נמדדו לפי לחץ פני השטח. כפי שניתן לראות באיור 3, פראם לוכד את הירידה המהירה של מקדם הדיפוזיה של monolayer DPPC ב ~ 9 MN / מ &#39;של לחץ משטח, שבי LC (נוזל מרוכז) - LE (נוזל מורחב) שלב מעבר מתרחש 10, ואת הערכים של מקדמי דיפוזיה גם הסכימו גם עם המדידות בעבר על ידי פיטרס et al. 19. בנוסף, דעיכה מעריכית של מקדם דיפוזיה עם לחץ המשטח נצפתה בשכבת dOPC, ונטייה זו היא כמעט זהה לאחד שנמדד על ידי קארוזו et al. 12. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig1.jpg" /> איור 1. איור סכמטי של פראם (התאוששות הקרינה לאחר המיזוג) טכניקה (). כשפהאגל מצופה monolayer id ממוזג לממשק אוויר מים שטוח, monolayer השומנים ללא הקרינה מתויג שומנים מוכנס לתוך monolayer שומנים ניאון שטוח. תמונות מיקרוסקופ (ב) הקרינה עם זמן בתהליך ההתאוששות של monolayer dOPC בMN 23 / ​​מ &#39;של לחץ משטח (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). האזור האפל של monolayer dOPC הוא התאושש באופן מלא על ידי תהליך דיפוזיה בתוך כמה דקות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig2.jpg" /> איור 2. עוצמת חלקית לעומת זמן. עיגולים שחורים והקו המקווקו האפור מציינים את הערכים של עוצמות השבר שהתקבלו מניתוח תמונה (נהלים 4.1 ו -4.2) ואת ההתאמה של משוואת 1 לעוצמות השבר עם זמן,הראה בהליך 4.3, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig3.jpg" /> 3. מקדמי דיפוזיה איור של dOPC (משולש) וDPPC (ריבוע ריק) monolayers כפונקציה של לחץ פני השטח. הקווים עם הצבע האפור הבהיר ועם הצבע האפור הכהה מצביעים על הערכים של מקדם הדיפוזיה שדווח בעבר על ידי פיטרס et al. וקארוזו et al., בהתאמה. נתון זה שונה מet al ג&#39;אונג. 23. הודפס מחדש באישור מet al ג&#39;אונג. אנגמיור. 30 (48), 14,369-14,374. כל הזכויות שמורות 2,014 האגודה האמריקנית לכימיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ עליה</a>דואר כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer at JoVE.com

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

שחזור הקרינה לאחר מיזוג אגל למדוד דיפוזיה דו ממדים של חד שכבתי פוספוליפידים

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

fluorescence-recovery-after-merging-droplet-to-measure-two

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.0K Views.  KAIST. We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Video: Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Biochemistry

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found to represent a novel lipid transfer protein (LTP) group in yeast and human cells. They transfer phosphatidylserine (PS) from the endoplasmic reticulum (ER) to the plasma membrane (PM) via PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) exchange cycles. This finding allows a better understanding of how PS, which is critical for signaling processes, is distributed throughout the cell and the investigation of the link between this process and phosphoinositide (PIP) metabolism. The development of new fluorescence-based protocols has been instrumental in the discovery and characterization of this new cellular mechanism in vitro at the molecular level. This paper describes the production and the use of two fluorescently labelled lipid sensors, NBD-C2Lact and NBD-PHFAPP, to measure the ability of a protein to extract PS or PI(4)P and to transfer these lipids between artificial membranes. First, the protocol describes how to produce, label, and obtain high-purity samples of these two constructs. Secondly, this paper explains how to use these sensors with a fluorescence microplate reader to determine whether a protein can extract PS or PI(4)P from liposomes, using Osh6p as a case study. Finally, this protocol shows how to accurately measure the kinetics of PS/PI(4)P exchange between liposomes of defined lipid composition and to determine lipid transfer rates by fluorescence resonance energy transfer (FRET) using a standard fluorometer.

Here, we describe protocols using fluorescent lipid sensors and liposomes to determine whether a protein extracts and transports phosphatidylserine or phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

מדידות מבוססות פלואורסצנטיות של פוספטידילסרין/פוספטידילינוזיטול 4-חילופי פוספט בין ממברנות

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) of macromolecules, and can be applied to both in vitro and in vivo biological systems. Multi-fluorescence recovery after photobleaching is performed by photobleaching a region of interest within a fluorescent sample using an intense laser flash, then attenuating the beam and monitoring the fluorescence as still-fluorescent molecules from outside the region of interest diffuse in to replace the photobleached molecules. We will begin our demonstration by aligning the laser beam through the Pockels Cell (laser modulator) and along the optical path through the laser scan box and objective lens to the sample. For simplicity, we will use a sample of aqueous fluorescent dye. We will then determine the proper experimental parameters for our sample including, monitor and bleaching powers, bleach duration, bin widths (for photon counting), and fluorescence recovery time. Next, we will describe the procedure for taking recovery curves, a process that can be largely automated via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) for enhanced throughput. Finally, the diffusion coefficient is determined by fitting the recovery data to the appropriate mathematical model using a least-squares fitting algorithm, readily programmable using software such as MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

In this article we will describe the procedure for measuring diffusion coefficients using multi-photon fluorescence recovery after photobleaching. We will begin by aligning the laser along the optical path to the sample and determining the proper experimental parameters, then continue generating and finally fitting fluorescence recovery curves.

מדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות שחזור שני הפוטונים Fluorescence לאחר photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Biology

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

דיפוזיה והרכבה של מולקולה בודדת על ממברנות שומנים עמוסות פולימרים

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

דיפוזיה מולקולרית פלזמה ממברנות יסודי לימפוציטים נמדד באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Immunology and Infection

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

מלכודת בתיווך Fusion של יחיד Proteoliposomes עם Bilayers Tethered הנתמך בתוך תא זרימת Microfluidic מנוטר על ידי Polarized TIRF מיקרוסקופי

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...