עבודה זו נתמכת על ידי הפרויקט ממומן על-KAIST K-העמק האדום וארוחת בוקר לשינה 2014 ותכנית מחקר המדע בסיסי באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).

<ol>
	<li>Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipids:+where+they+are+and+how+they+behave.">Membrane lipids: where they are and how they behave.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).</li><li>Christon, R., Even, V., Daveloose, D., L&#233;ger, C. L., Viret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+fluidity+and+lipid&#8212;protein+relationships+in+pig+intestinal+brush-border+membrane+by+dietary+essential+fatty+acid+deficiency.">Modification of fluidity and lipid&#8212;protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency.</a> Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).</li><li>Stubbs, C. D., Smith, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modification+of+mammalian+membrane+polyunsaturated+fatty+acid+composition+in+relation+to+membrane+fluidity+and+function.">The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).</li><li>Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+landscapes+and+pipelines+in+membrane+homeostasis.">Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis.</a> Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).</li><li>Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+lung+surfactant+where+it+belongs:+protein+regulation+of+two-dimensional+viscosity.">Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity.</a> Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).</li><li>Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cholesterol+nanodomains+on+monolayer+morphology+and+dynamics.">Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).</li><li>Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Lipid+Membrane+Viscosity+Using+Rotational+and+Translational+Probe+Diffusion.">Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion.</a> Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101 (2014).</li><li>Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a., Schwartz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+needle+viscometer+for+Langmuir+monolayers.">Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers.</a> Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).</li><li>Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+interfacial+shear+microrheology+of+aging+protein+films.">Active interfacial shear microrheology of aging protein films.</a> Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).</li><li>Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+microrheology+of+DPPC+monolayers+at+the+air-water+interface.">Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface.</a> Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).</li><li>Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+microrheology+and+simultaneous+visualization+of+sheared+phospholipid+monolayers.">Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers.</a> Nature Commun. 2 (5), 312 (2011).</li><li>Caruso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+lateral+diffusion+coefficients+in+air-water+monolayers+by+fluorescence+quenching+measurements.">Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements.</a> J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).</li><li>Filippov, A., Or&#228;dd, G., Lindblom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesterol+on+the+lateral+diffusion+of+phospholipids+in+oriented+bilayers.">The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers.</a> Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).</li><li>Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+single-molecule+sensitivity+on+cell+and+model+membranes.">Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes.</a> Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).</li><li>Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+photobleaching+(FRAP)+experiments+under+conditions+of+uniform+disk+illumination.+Critical+comparison+of+analytical+solutions,+and+a+new+mathematical+method+for+calculation+of+diffusion+coefficient+D.">Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D.</a> Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).</li><li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+diffusion+of+lipids+in+liquid+crystalline+phase+phosphatidylcholine+multibilayers.+A+comparison+of+experiment+with+theory.">Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory.</a> Biochemistry. 24 (3), 781-786 (1985).</li><li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+in+phospholipid+multibilayers+measured+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3836-3841 (1977).</li><li>Peters, R., Beck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+diffusion+in+phospholipid+monolayers+measured+by+fluorescence+microphotolysis.">Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).</li><li>Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H., Crawley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical Methods of Chemistry. 1, Part 3B, 651-653 (1972).</li><li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure.">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).</li><li>Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+surface+tension+and+contact+angle+from+the+shapes+of+axisymmetric+fluid+interfaces.">Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces.</a> J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).</li><li>Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+merging+a+surfactant-covered+droplet:+a+novel+technique+to+measure+the+diffusion+of+phospholipid+monolayers+at+fluid/fluid+interfaces.">Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces.</a> Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest.

פראם חולק הרבה עקרונות יסוד עם FRAP, במיוחד למדידת התאוששות הקרינה לאחר הלבנת אזור מסוים, אבל פראם משתמש בתהליך של מיזוג אגל על ​​הממשק השטוח כדי ליצור אזור מולבן, במקום ליישם אור אינטנסיבי. תהליך המיזוג הוא כך צעד החשוב ביותר בפראם, ובמיוחד, את הצורה של הכתם הכהה בmonolayer השטוח לאחר מיזוג טיפה קובעת את הדיוק של מדידת diffusivity. באופן ספציפי, המבוססים על שיטה נוכחית, שרק להגדיר את המעגל עם רדיוס R כאזור של עניין כדי לחשב את העצמה הממוצעת של הכתם הכהה, המוצגת בהליך 4, ואם יש סטייה גדולה מדי מהצורה העגולה, זה יפריע המדידה המדויקת של מקדם הדיפוזיה. לכן, יש צורך להשיג אזור כהה בצורה מעגלית, אבל, צורות noncircular נוצרות לעתים בשל מספר סיבות. ראשית, אם קיים זרימת הסעה בחיות המחמדצלחת רי, את הצורה של האזור הכהה הופכת מוארכת לאורך כיוון הזרימה. כאמור בהליך 1.3, מכשיר קונוס-צורה מסייע לדכא את זרימת ההסעה, והתארכות זו תהיה מזערית. שנית, אם סוף קצה הנימים נוגע ממשק השטוח בתהליך מיזוג, האזור הכהה נוצר עם מגוון רחב של צורות מאז סוף הנימים קוטע את תהליך המיזוג. על ידי קבלת טיפה שתלוי רק מהסוף מאוד של הנימים, ניתן למנוע הפרעה זו. בפרט, טיפול הידרופובי של הנימים עוזר הטיפה לשבת בסוף מאוד של הנימים. לכן, ירי צרות לעיל ושינויים יאפשרו לנו למדוד תכונות דיפוזיה מדויקת יותר. תהליך זה troubleshot גם כך מאפשר פראם יש כמה יתרונות משמעותיים על פני FRAP. ראשית, פראם דורש ציוד פשוט בהשוואה לFRAP. לפראם, זה מספיק כדי להשתמש במייקרו הקרינה פשוטלהתמודד, במקום מיקרוסקופ confocal יקר עם לייזר בהספק גבוה באורך גל שחייב להתאים עם ספקטרום הבליעה של הצבע. בנוסף, יש צורך להשתמש במכשיר נוסף כדי להתאים את הגודל לאזור מולבן בFRAP, תוך פראם שולט בגודל השטח בקלות על ידי התאמת גודל הטיפה, או לחץ המשטח על פני השטח אגל. שנית, ניתן להשתמש במינים שונים של צבעים בפראם. FRAP משתמש רק מולקולות צבע הלבנה שתהליך הוא הרבה יותר מהר מאשר תהליך דיפוזיה. אם דיפוזיה של הצבעים מתרחשת במהלך תהליך ההלבנה, קשה להעריך את רכוש דיפוזיה מדויקת. פראם, לעומת זאת, אינו דורש תהליך להלבנת צבעים וזה ובכך מאפשר שימוש בסוגים שונים של צבעים בהדמית הקרינה. בנוסף, דורש FRAP לייזרי מתח גבוה נוספים ומסנן קובע לשנות את מיני צבע, בזמן שהוא רק צורך להחליף את מערכות הסינון בפראם. לבסוף, מאז monolayers על פני השטח אגל והממשק השטוח יכול להיווצר באופן עצמאי, ובכך לאפשר את הלימוד בין-דיפוזיה או ערבוב בין שני monolayers שומנים שונה על ידי מיזוג מסוג monolayer לmonolayer B-הסוג, בעוד FRAP מודד רק דיפוזיה עצמית של שכבה. למרות יתרונות אלה, תהליך איחוד אגל על ​​ממשק אוויר מים שטוח עלול להגביל בטכניקה זו בשל כמה בעיות שעלולות להיות לדאגה, כגון אי-התאמת לחץ משטח בין שני monolayers, בקנה מידה של תהליך מיזוג הזמן , ועלייה בלחץ פני השטח של monolayer השטוח לאחר מיזוג טיפות. נושאים אלה, עם זאת, אינם משפיעים על מדידת דיפוזיה באופן משמעותי מהסיבות הבאות. ראשית, למרות שלחצי המשטח בשני monolayers שונה הם שונים לגמרי, תהליך איזון יושלם בשלב מוקדם מאוד בתהליך ההחלמה. לדוגמא, אם לאהוא משטח לחץ של monolayer על פני השטח הטיפה גבוה יותר מזה של monolayer בממשק אוויר מים השטוח, האזור הכהה מתרחב עד לחץ משטח equilibrates. מכיוון שתהליך זה יושלם בתוך 10 אלפיות שני, לחץ המשטח יהיה equilibrated לפני זה משפיע על תהליך דיפוזיה באופן משמעותי. שנית, אם בקנה מידה של תהליך מיזוג הזמן הוא מספיק מהר, זה לא להגביל את מדידת דיפוזיה בכלל. למרבה המזל, תהליך מיזוג אופייני גם יושלם בתוך 10 אלפיות שניים. לבסוף, גם מיזוג מרובה של הטיפות על הממשק השטוח לא להגביר את הלחץ מאז את שטח הפנים של שוקת המשטח הוא גדול בהרבה משטח הפנים של הטיפה. על פי הגדלים של השוקת והטיפין, שתוארה בפרוטוקול, האזור למולקולה מגביר פחות מ 0.015% על ידי מיזוג אגל. בהתאם לכך, הגידול של לחץ משטח עקב השינוי של אזור כל מולקולה הוא פחות מ -0.1%, שהוא negligiblדואר כי זה הרבה יותר קטן מהשגיאה האופיינית בלחץ משטח, כפי שנמדד על ידי tensiometer צלחת Wilhelmy. לסיכום, הצגנו שיטה חדשה למדידת רכוש דיפוזיה לרוחב של monolayer פוספוליפידים ידי מיזוג monolayer אגל על ​​הממשק השטוח. טכניקה זו דורשת ציוד פשוט יחסית וגם מאפשרת השימוש בסוגים שונים של מיני צבע. פראם הוא בכך שעלול להיות רלוונטי למדידת דיפוזיה של כל סוכנים פעילים שטח, כוללים פוספוליפידים, קופולימרים לחסום, חלבונים ואפילו חלקיקים בנוזל ממשק-נוזל. יתר על כן, אנו מצפים שפראם מספק דרך חדשה ללמוד בין-דיפוזיה או ערבוב בין שני סוכנים פעילים שטח שונים.

<html> פוספוליפידים הם רכיבים עיקריים של קרום תא והקרומים של האברונים, ואת הנזילות של שכבות קרום אלה לעתים קרובות משפיעים על תפקודים תאיים על ידי שינוי הפעילות של חלבונים בממברנה 1 - 3. לדוגמא, קרום &#160; הומאוסטזיס שומנים מושגת על ידי ויסות זרימת קרום, שהוא זוהה על ידי חלבונים בממברנה, ורמה חריגה של נזילות גורמת למחלות קשות, כגון steatosis וcholestasis 4 בכבד. בנוסף, יש נזילות של monolayer פוספוליפידים בממשק נוזל אוויר alveoli השלכות חשובות בפונקציות שלה. נזילות גבוהות של monolayer פוספוליפידים שטח הריאה מקלות הפצה של השכבה בשאיפה, ואילו נזילות נמוכות מאפשרת השכבה להישאר בתוך alveoli במהלך הנשיפה 5,6. מכיוון שכך, חשוב להעריך את הנזילות של שכבות פוספוליפידים להבין את תפקידם. _content &quot;&gt; מדידה ישירה של הנזילות היא צמיגות, והצמיגות של שכבות פוספוליפידים כבר נמדדה באמצעות קולואידים בגודל מיקרון 7, מחטים מגנטיות 8,9, ומיקרו-כפתורים מגנטיים 6,10,11. עם זאת, טכניקות אלה מוגבלים לסרטים קשיחים יחסית, ולא יכול למדוד סרטים פחות צמיגים. במקרים כאלה, diffusivity יהיה אלטרנטיבה ללכמת נזילות של שכבות פוספוליפידים. במשך כמה עשורים, מגוון של טכניקות כדי למדוד את תכונות דיפוזיה של שכבות פוספוליפידים פותחו, כגון שיטת הקרינה מרווה 12, NMR שיפוע השדה פעמו 13, וספקטרוסקופיה מתאם הקרינה (FCS) 14. אחת השיטות מייצגות ביותר היא התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) 15,16. בשל הפשטות של הליך המדידה וקשור תאוריות, כמה מחקרים על תכונות דיפוזיה של שכבות פוספוליפידים בוצעו באמצעות FRAP <sup&gt; 17-19. עם זאת, בדרך כלל דורש FRAP התקנת מיקרוסקופ confocal יקר עם לייזר בעצמה גבוהה. כאן, אנו מציגים טכניקה חדשה למדידת דיפוזיה לרוחב של monolayers פוספוליפידים, כפי שכונה התאוששות הקרינה לאחר המיזוג (פראם). ההבדל העיקרי בין FRAP ופראם הוא שצעד photobleaching הוא הוחלף על ידי גיבוש הירידה. מיזוג אגל מכוסה על ידי monolayer אינו הקרינה על monolayer השטוח שכותרתו fluorescently משאיר כתם כהה מעגלי על monolayer השטוח בהיר, ולכן הגדרה אותו מצב ראשוני עם צעד photobleaching. לאחר מכן, אנו צופים בהתאוששות הקרינה בכתם הכהה עם זמן למדוד את diffusivity לרוחב. צעד זה חדש &quot;הלבנה&quot; על ידי גיבוש ירידה מספק יתרונות משמעותיים על פני FRAP: פראם דורש מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולא מיקרוסקופ confocal יקר עם לייזר בהספק גבוה שיש צורך לFRAP בלבד. אניבנוסף n, יש פראם מבחר רחב של צבעי הקרינה שכן הוא אינו כרוך בתהליך photobleaching. לבסוף, שני monolayers שונה, monolayer אגל וmonolayer שטוח, ניתן להכין באופן עצמאי, ובכך מאפשרים interdiffusion להימדד, בעוד FRAP מודד את דיפוזיה העצמית של monolayers בלבד. פראם מספק מגוון רחב של מדידות דיפוזיה מחומרים צמיגים מאוד לחומרים כמעט בלתי צמיגים. בעיקרון, פראם ניתן למדוד את diffusivity המרבי של 10 מיקרומטר 6 2 / sec, אשר ניתן להשוות טכניקות קיימות, כאשר מתרחשת דיפוזיה על פני השטח של 100 מיקרומטר על ידי 100 מיקרומטר בזמן לתהליך גיבוש ירידה (~ 10 אלפיות השנייה). יתר על כן, ניתן למדוד תהליך דיפוזיה איטי בקלות, אלא אם כן monolayers הוא מוצקים. פראם יכול לשמש לכל מיני סוגים של חומרים פעילים שטח, כל עוד מולקולות מתויגות fluorescently מתאימים זמינות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1288">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Acetone</td>
			<td style="width:269px;">OCI corporation</td>
			<td style="width:251px;">Acetone 3.8L Extra Pure</td>
			<td style="width:552px;">Purity: &#8805; 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethanol</td>
			<td>OCI corporation</td>
			<td>Ethanol 3.8L Extra Pure</td>
			<td>Purity: &#8805; 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Deionized water/Water purify system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q liocel</td>
			<td>&#62;18.2 M&#937;&#903;cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td>Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Chloroform</td>
			<td>LiChrosolv</td>
			<td>Chloroform ultrapure (A3633)</td>
			<td>Purity: &#8805; 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine DPPE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C, 810158P</td>
			<td>Avoid direct light exposure to prevent photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wilhelmy plate tensiometer</td>
			<td>R&#38;K ultrathin organic film technology</td>
			<td>Wilhelmy tensiometer</td>
			<td>http://www.rieglerkirstein.de/index.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Micromanipulator 5171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope 1</td>
			<td>Objective lens: Olympus</td>
			<td>Objective lens: UPlanFl 10x</td>
			<td>Objective lens: 10x NA 0.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope 2</td>
			<td>Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs</td>
			<td>Objective lens: UPlanFl 10x</td>
			<td>Objective lens: 10x NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD for Microscope 1</td>
			<td>Jai</td>
			<td>CV 950 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD for Microscope 2</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter set</td>
			<td>Chroma technology</td>
			<td>Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605</td>
			<td>Prepare suitable for dye molecules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>Wiseclean WUC-D06H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after merging a droplet to measure the two-dimensional diffusion of a phospholipid monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

סדרה של תמונות הקרינה התקבלו עם זמן בתהליך ההתאוששות לאחר מיזוג אגל מצופה monolayer dOPC על monolayer dOPC שטוח, כפי שמופיעה באיור 1. Monolayer dOPC בממשק אוויר מים השטוח היה מסומם עם כמויות נמוכות של Rhodamine-DPPE, וזה ובכך הפך אותו אפשר לדמיין רקע עם צבע בהיר וכהה באזור חדש שנוסף לממשק השטוח. יש, תהליך התאוששות נצפה בMN 23 / מ &#39;של לחץ משטח קבוע. בכושר של משוואת 1 לשינוי של עוצמת השבר לפי הזמן מוצג באיור 2. R 2 הערך של כושר זה הוא 0.999, ובכושר זה עדיין עובד היטב גם בלחצי משטח נמוכים או גבוהים יותר. מקדם דיפוזיה של monolayer dOPC מתקבל מכושר זה היה 27.54 מיקרומטר 2 / sec בMN 23 / ​​מ &#39;של לחץ פני השטח. לאימות נוספת של פראם, מקדמי דיפוזיה של DOמחשב וdipalmitoylphosphatidylcholine monolayers (DPPC) נמדדו לפי לחץ פני השטח. כפי שניתן לראות באיור 3, פראם לוכד את הירידה המהירה של מקדם הדיפוזיה של monolayer DPPC ב ~ 9 MN / מ &#39;של לחץ משטח, שבי LC (נוזל מרוכז) - LE (נוזל מורחב) שלב מעבר מתרחש 10, ואת הערכים של מקדמי דיפוזיה גם הסכימו גם עם המדידות בעבר על ידי פיטרס et al. 19. בנוסף, דעיכה מעריכית של מקדם דיפוזיה עם לחץ המשטח נצפתה בשכבת dOPC, ונטייה זו היא כמעט זהה לאחד שנמדד על ידי קארוזו et al. 12. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig1.jpg" /> איור 1. איור סכמטי של פראם (התאוששות הקרינה לאחר המיזוג) טכניקה (). כשפהאגל מצופה monolayer id ממוזג לממשק אוויר מים שטוח, monolayer השומנים ללא הקרינה מתויג שומנים מוכנס לתוך monolayer שומנים ניאון שטוח. תמונות מיקרוסקופ (ב) הקרינה עם זמן בתהליך ההתאוששות של monolayer dOPC בMN 23 / ​​מ &#39;של לחץ משטח (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). האזור האפל של monolayer dOPC הוא התאושש באופן מלא על ידי תהליך דיפוזיה בתוך כמה דקות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig2.jpg" /> איור 2. עוצמת חלקית לעומת זמן. עיגולים שחורים והקו המקווקו האפור מציינים את הערכים של עוצמות השבר שהתקבלו מניתוח תמונה (נהלים 4.1 ו -4.2) ואת ההתאמה של משוואת 1 לעוצמות השבר עם זמן,הראה בהליך 4.3, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig3.jpg" /> 3. מקדמי דיפוזיה איור של dOPC (משולש) וDPPC (ריבוע ריק) monolayers כפונקציה של לחץ פני השטח. הקווים עם הצבע האפור הבהיר ועם הצבע האפור הכהה מצביעים על הערכים של מקדם הדיפוזיה שדווח בעבר על ידי פיטרס et al. וקארוזו et al., בהתאמה. נתון זה שונה מet al ג&#39;אונג. 23. הודפס מחדש באישור מet al ג&#39;אונג. אנגמיור. 30 (48), 14,369-14,374. כל הזכויות שמורות 2,014 האגודה האמריקנית לכימיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ עליה</a>דואר כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer at JoVE.com

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

שחזור הקרינה לאחר מיזוג אגל למדוד דיפוזיה דו ממדים של חד שכבתי פוספוליפידים

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

fluorescence-recovery-after-merging-droplet-to-measure-two

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.0K Views.  KAIST. We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Video: Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

חיים דימות פלואורסצנטי של הרוטורים מולקולרית בתאים חיים

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

סינתזה, הרכבה, אפיון monolayer מוגן סרטים Nanoparticle זהב עבור אלקטרוכימיה monolayer חלבון

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

<em&gt; במבחנה</em&gt; אנזימתי Assay למדוד תמלול עיכוב על ידי גליום (III) ו- H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-טריס corroles (pentafluorophenyl)

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...