Bu çalışma 2014 için KAIST tarafından finanse edilen K-Vadisi RED &amp; B Projesi ve Temel Bilimler Araştırma Programı Kore Ulusal Araştırma Vakfı aracılığıyla (NRF- 2012R1A6A3A040395 NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023) tarafından desteklenmektedir.

Dikkat: kanserojen aseton ve kloroform Kullanmadan önce Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) bakın. Düz hava su ara-yüzünde Fosfolipid Monolayer hazırlanması 1. <ol><li> Bir fosfolipid tek tabaka oluşumu <ol><li> Bir fosfolipid çözeltisinin hazırlanması <ol><li> Aseton, etanol ve deiyonize su, en az üç kez kullanarak bir politetrafloroetilen kaplı kap Şişeyi ve su kurtulmak için şişe içine iyice azot gazı darbe ml bir 4 temizleyin. </li><li> Fosfolipidin 1 mg çözülür (örneğin, dioleoilfosfatidilkolin, DOPC) şişe içinde kloroform 1 ml 1 mg / ml konsantrasyon elde edilmiştir. Güvenliği için Davlumbaz bu yordamı gerçekleştirin. Fosfolipid çözeltisinin daha düşük ya da daha yüksek konsantrasyonlarda gerektiğinde kullanın. </li><li> Ekle boya fosfolipidleri etiketli (örneğin, Rodamin dipalmitoilfosfatidiletanolamin, Rodamin DPPE) fosfolipid Solu az 1 mol ile%tion, bir floresan mikroskobu ile fosfolipid tek tabaka görselleştirmek için. Güvenliği için Davlumbaz bu yordamı gerçekleştirin. </li><li> Çözücü buharlaşmasını önlemek için politetrafloroetilen bant ile flakon sarın ve -20 ° C&#39;de bir dondurucuda örnek saklayın. </li></ol></li><li> Hava-su arayüzü üzerine Fosfolipidlerin Biriktirme <ol><li> Petri (çapı 55 mm ve yüksekliği 12 mm) etanol ve deiyonize su, en az üç kez temizleyin. </li><li> Bir hava-su ara yüzeyine oluşturmak için deiyonize su, 10 ml ile Petri doldurun. </li><li> Istenilen yüzey basıncını elde etmek ve önceki deney yapıyor, tamamen çözücü buharlaşması için en az 30 dakika beklemek temiz bir arayüz üzerine mikro şırınga ile fosfolipid çözümün birkaç mikrolitre yayıldı. Not: Langmuir çukur yüzeyi basınç hassas kontrol gerekirse yerine Petri kabı kullanılabilir. </li></ol></li></ol></li><li> Surface basıncı ölçümü <ol><li> Bir Wilhelmy plakası tansiyometre ile fosfolipid tek tabaka yüzey basıncını ölçün. Filtre kağıdı bir Wilhelmy plaka olarak kullanıldığında, filtre kağıdı kadar ıslatılmış almak için en az 30 dakika boyunca bekleyin. Ayrıntılı bir protokol Kuhn ve diğerleri mevcuttur. 20. </li><li> Tam yüzey basıncını kontrol etmek fosfolipid yatırılan miktarını ayarlayın. ~ 5 mN / m bir yüzey basıncı, eğer arayüzün 30,25 cm 2 &#39;lik üzerine DOPC çözeltisi (1 mg / ml) içinde 4 ul ekle gereklidir. Not: Filtre kağıdı tam ıslatılmış değilse, yüzey basıncı nedeniyle filtre kağıdı ağırlık değişimi için deney ilk 30 dakika boyunca büyük ölçüde değişir. </li></ol></li><li> Tek tabakalı konvektif akışının minimizasyonu <ol><li> Petri kabı büyük bir bölümüne bağlı olan iki ince kanalları 3 mm rezervuarı içeren bir koni şeklinde cihazı kullanın, bir konvektif akışını bastırmak içinmorfoloji görüntüleme ve yüzey basıncı ölçümü rahatsız olabilir tek tabakalı. </li><li> Fosfolipidler hava-su arayüzü üzerine fosfolipid biriktirilmesi önce tüm bölge üzerinde serbestçe hareket sağlamak için koni şeklinde aygıtının iç ve dış arasındaki su seviyelerinin maç emin olun. </li></ol></li></ol> Bir Sıvı fazı Eğimli Yüzeyinde Fosfolipid Monolayer 2. Hazırlık <ol><li> Mikropipet çektirmenin kullanarak bir cam kılcal sürecini sivrilen <ol><li> Mikropipet çektirmenin bir kılcal tutucu bir cam kapiler tüp (OD 1 mm id 0,78 mm, uzunluk 100 mm) yerleştirin. </li><li> (: Pull, Rampa: 60, Vel: 70, Gecikme: Isı 70 ve basınç 200) uygun parametre değerleri ile kılcal çekerek tasarımı için bir program ve üreticinin protokolüne göre tasarlanan program ile kılcal çekin. Not: Bir kılcal birkaç mikrometre çapında bir sona Appl ile 100 mikron damlacık oluşturulması için gerekli olan~ 10 kPa olan bir basınç Ying. Kılcal tepe ucu, daha yüksek bir basınç,&gt; 600 kPa çok küçük olduğu takdirde, bir çok su emici ucu ucuna damlacıkların boyutunu kontrol etmek için sabit iken, damlacık elde etmek için gereklidir. </li></ol></li><li> Damlacık yüzeyi üzerine fosfolipidler emilimi Not: Bir damlacık kavisli arayüzünde bir fosfolipid tek tabaka oluşturmak, boya olmadan bir fosfolipid çözüm Ayrıca prosedür 1. tarafından hazırlanan, düz tek tabakalı karşı, bir yoğunluk kontrastı elde etmek için kullanılan her iki usul 2.2.1 ve 2.2 olan fosfolipidler etiketli 0,2 Burada izin verilebilir. Damlacık yüzeyinde yüzey basıncı hassas kontrol gerekirse, prosedür 2.2.2 şiddetle tavsiye edilir. Ancak, eğer değil, prosedür 2.2.2 çok daha kolay bir yoldur prosedür 2.2.1, yararlıdır. <ol><li> Bir ipucu sonunda Fosfolipidlerin sürecini Kaplama <ol><li> Aseton, etanol, deiyonize su ve en az üç kez kullanan bir slayt camını temizleyin. </li><li> PlBir temizlenmiş slayt camına konik kılcal as ve bir ucu ucu ile slayt cam dokunmadan kolaylaştırmak için kılcal eğin. </li><li> Bir cam şırınga kullanılarak bir cam slayt yapıştırıldığı bir kılcal kısmın ucu ucuna fosfolipid çözeltisi (1 mg / ml) bir kaç damla damlacıklar ve tamamen çözücünün buharlaştırılması için en az 30 dakika bekleyin. Not: Bu son derece uç uç çevre sadece kılcal kuvveti ile ucu sonunda fosfolipidlerin damlacık tutmak için çok küçük olduğu için prosedür 2.2.1.3 sırasında cam slayt kılcal ucu ucuna bağlı tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Vezikül solüsyonunun hazırlanması <ol><li> Bir şişe temizleyin ve prosedür 1.1.1.1 tanıtılan olarak, şişeden su çıkarmak. </li><li> Yavaşça azot gazı uygulanarak fosfolipid çözeltisi (1 mg / ml) bir 2 ml hacim kurutun ve kalan çözücünün ortadan kaldırılması için oda sıcaklığında 1 saat için flakon ile kurutun. Güvenliği için Davlumbaz bu yordamı gerçekleştirin. </li><li> 2 Ekleşişe içine ml deiyonize su lipidler, kurutuldu ve 1 saat süre ile 60 ° C&#39;de bir fırın içinde şişe inkübe içeren. </li><li> Flakon birkaç kez çalkalayın ve sonikasyon (HF-frekans: 40 kHz, Güç kadar: 370 W) veziküller elde etmek için 30 dakika. </li><li> Tek dağılımlı tek lamelli veziküller elde edilmesi için ekstrüzyon ve donma-çözülme süreçleri gerçekleştirme. Hazırlanması veziküller detaylı bir protokol Mayer ve ark. 21 tarif edilmiştir. Not: Damlacık arayüzü Yüzey basıncı monodispers unilamellar veziküller içeren damlacık oluşumundan sonra bekleme süresini ayarlayarak tam kontrol edilir. Bir kolye bırak yöntemini kullanarak 22, önceden deney yapıyor, zamana göre yüzey basıncı değişimi ölçmek için gereklidir. </li></ol></li></ol></li><li> Kavisli yüzeyinde bir fosfolipid tek tabaka içeren bir damlacık oluşumu <ol><li> Prosedüründe de-iyonize edilmiş su 10 ul&#39;lik konik kılcal doldurune 2.2.1. Seçenek olarak ise, prosedür 2.2.2 vezikül çözeltisi 10 ul kullanın. </li><li> Damlacık oluşturulması için basınç temin etmek üzere otomatik bir mikro enjektöre kılcal bağlayın. </li><li> Tam olarak kılcal konumunu kontrol etmek için bir mikromanipülatör için bir mikro-, enjektöre bağlı kılcal monte edin. </li><li> CCD kamera ile kılcal yanal görünümünü görüntüleme için: (10X NA 0.3 Mikroskop 1, objektif lens) parlak alan mikroskobu hazırlayın. Mikroskop 1 nedenle z ekseni boyunca damlanın kesin konumunu gözlemlemek ve damlacık büyüklüğünü tahmin sağlar. </li><li> ~ 100 (uygun büyüklükte kadar kılcal ucu ucuna bir değişken basınç (~ 100 hPa) ucu ucuna yanal görünümü de bir micromanipulator kullanarak Mikroskop 1 tarafından görüntülenmiştir bir konuma uç uca getirin ve uygulamak damlacık çapı um) oluşturulur. Not: Bu otomatik mikro enjektör ve mikromanipülatör kullanımı olması önerilird damlacık damlacık boyutu ve konumu ince kontrolü gereklidir, eğer. Bu manuel olanları kullanmak da mümkündür. </li></ol></li></ol> Damlacık birleştirdikten sonra 3. Görüntüleme Floresan Kurtarma Not: Bu protokol temel ilkeleri damla kaynaştırma işlemi dışında, sıkı bağlamak tekniğin özdeştir. FRAP detaylı bir protokol ve ilgili teoriler A. Lopez ve ark., 15 ve D Axelrod vd. 16 mevcuttur. <ol><li> İzleme ve damlacık konumunu kontrol <ol><li> Rhodamine-DPPEs (560 nm&#39;de uyarma, 583 nm emisyon) için uygun bir filtre seti ile bir floresan mikroskop hem sağlar (: 10X NA 0.3, tüp lens odak uzaklığı 17 cm Mikroskop 2, objektif lens) ayarlanmış ters bir mikroskop hazırlayın ve parlak bir alan mikroskobu. Bir floresan mikroskop m damlanın üst görüşlerini görselleştirmek için buraya bir CCD kamera kullanınkaside ve parlak alan mikroskobu modu. </li><li> Z ekseni boyunca düz bir hava-su arayüzü bir fosfolipid ile kaplanmış damlacık taşıyabilirsiniz, ancak mikromanipülatör kullanarak, henüz damlacık birleştirme yok. Damlacık yanal görünümünü görselleştirmek için Mikroskop 1 kullanın. </li><li> Mikromanipülatör kullanarak, düz tek tabaka üst görünümden merkezinde damlacığı bulun. Düz tek tabaka üstten görünümünü görselleştirmek için Mikroskobu 2 aydınlık alan mikroskobu modunu kullanın. </li></ol></li><li> Düz hava-su arayüzü üzerine damlacığı birleştirme <ol><li> Damlacık mikromanipülatör kullanarak, arayüzü üzerine birleştirir kadar düz arayüzü doğru daha da damlacık hareket ettirin. Birleştirme işlemi başarıyla yapılırsa, beyaz bir arka plan ile çevrili bir dairesel şekle sahip bir karanlık bölge, Mikroskop 2 floresan modunu kullanarak gözlenir. </li><li> Micros floresan modunu kullanarak, damlacık birleştirdikten sonra zamana göre floresan görüntü serisi kaydedin2. Burada tek tabaka difüzyon süresi ölçeğinde daha hızlı bir kare hızı kullanın başa. DOPC tek tabaka olarak, tamamen 200 mikron-karanlık alana yaymak için bir kaç dakika sürer. </li></ol></li></ol> 4. Görüntü Analizi Difüzyon Katsayısı belirlenmesi Not: Aşağıda tarif edildiği gibi bir görüntü dizisinden difüzyon katsayısının saptanması için, görüntü analizi için özel program inşa edilmiştir. Bu programın detaylı bir kaynak kodu vallahi sitesinde mevcuttur. <ol><li> Ilgi dairesel bir tespit edilmesi <ol><li> Ilgili bölgenin merkezine tespiti <ol><li> Dairesel karanlık alanı ve beyaz bir arka plan içeren bir kurtarma işlemi sırasında kaydedilmiş olan floresan görüntüleri bir dizi elde etmek ve bir referans görüntü olarak serinin ilk resmi ayarlayın. Burada, R D referans görüntüdeki karanlık alanın yarıçapı. </li><li> Beyaz bir daire ile referans görüntü dürülmüş kimse yoğunluğu bütün bölge üzerinde üniforma olduğunu. İşte özelleştirilmiş program satırına 124. kaynak kodda gösterildiği gibi kıvrım için &#39;conv2&#39; adlı gömülü işlevini kullanın, beyaz çemberin yarıçapı R D biraz daha küçüktür. </li><li> Kıvrım hesaplamasında asgari değeri gösterir bir pozisyon bulun ve referans görüntüdeki ilgi bölgenin merkezi olarak bu konumunu ayarlamak. </li></ol></li><li> Ilgili bölgenin çapındaki belirlenmesi <ol><li> Bütün bölge üzerinde bir prosedür 4.1 ve üniform yoğunluk tarafından belirlenen bir merkez konumunu içeren beyaz bir daire ile referans görüntü dürülmüş. Burada, R S beyaz dairenin yarıçapı. Kullan yineleme gibi &#39;için&#39; veya özelleştirilmiş program satırına 109 102 kaynak kodda gösterildiği gibi beyaz bir daire yapmak için bir çemberin denklemi ile &#39;while&#39; olarak. </li><li> Biraz olan başka bir beyaz bir daire ile referans görüntü dürülmüşR, S daha büyük yarıçapı (% 5-% 10), R L,. Özelleştirilmiş program satırına 120 113 kaynak kodda gösterildiği gibi daire yapmak için prosedür 4.1.2.1 ile aynı yöntemi kullanın. </li><li> 4.1.2.1 ve 4.1.2.2 iki convolution hesaplamalarında arasındaki değer farkı edinin. </li><li> Bir piksel seviyesi ile R S ve R L artırarak, R S = 2R D R S = R D / 2 yukarıdaki işlemleri tekrarlayın. Tekrarlamak 4.1.2.3 prosedürü 4.1.2.1 gelen tüm kaynak kodları içeren bir yineleme olun. </li><li> İki convolution hesaplamalar arasındaki değer maksimum farkını gösterir R S yarıçapını bulun. Bu R, böylece referans görüntüdeki karanlık alanın yarıçapını gösterir S 149. özelleştirilmiş program satırına 148 kaynak kodda gösterildiği gibi yarıçapı bulmak için &#39;max&#39; adlı Kullanım gömülü fonksiyon değeri en yüksek farkını gösterir. </li></ol></li&gt; </ol></li><li> Kesirli yoğunluğunun hesaplanması <ol><li> Ilgi bir bölge olarak prosedür 4.1 tarafından belirlenen bir merkez konumu ve çapındaki içeren bir daire olarak ayarlayın. </li><li> Zamana göre flüoresans görüntü bir dizi ilgili bölgenin ortalama yoğunlukları hesaplayın. Ilgi bölgesi ile her kareyi dürülmüş ve ortalama yoğunluğunu hesaplamak için ilgi bölgenin alanına bölerek. Ayrıntılar vallahi sitesinde mevcuttur özelleştirilmiş programın kaynak kodu mevcuttur. </li><li> F (t) zamana göre bir ilgi alanı olan bir daire içinde, ortalama yoğunluğu, aşağıdaki denklemde, tanımlanmış bir fraksiyonel yoğunluğu hesaplanır, K i daire içinde başlangıç ​​yoğunluğu ve F o yoğunluğudur bir beyaz arka. f (t) = (F (±) - F i) / (F o - F i) (Denklem 1). </li></ol></li><li> F takılmasıFRAP teorisine ractional yoğunluğu <ol><li> Ben 1 uydurma programı kullanarak, Bessel fonksiyonları modifiye edilmiş, τ karakteristik difüzyon süresi ve 0 aşağıda denklemi ile fraksiyonel yoğunluğunu Fit ve τ elde <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376eq2.jpg" /> (Denklem 2). </li><li> D, difüzyon katsayısı ve karanlık bir yerde yarıçapıdır ilişkisi, τ göre bir difüzyon katsayısı = a 2/4 D elde edilir. Not: uydurma işlemi sırasında kurtarma işlemi zaten görüntüleri kaydederken önce başladığı bir zaman ekseni boyunca fraksiyonel yoğunluk profili kayması mümkündür. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipids:+where+they+are+and+how+they+behave.">Membrane lipids: where they are and how they behave.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).</li><li>Christon, R., Even, V., Daveloose, D., L&#233;ger, C. L., Viret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+fluidity+and+lipid&#8212;protein+relationships+in+pig+intestinal+brush-border+membrane+by+dietary+essential+fatty+acid+deficiency.">Modification of fluidity and lipid&#8212;protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency.</a> Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).</li><li>Stubbs, C. D., Smith, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modification+of+mammalian+membrane+polyunsaturated+fatty+acid+composition+in+relation+to+membrane+fluidity+and+function.">The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).</li><li>Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+landscapes+and+pipelines+in+membrane+homeostasis.">Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis.</a> Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).</li><li>Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+lung+surfactant+where+it+belongs:+protein+regulation+of+two-dimensional+viscosity.">Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity.</a> Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).</li><li>Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cholesterol+nanodomains+on+monolayer+morphology+and+dynamics.">Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).</li><li>Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Lipid+Membrane+Viscosity+Using+Rotational+and+Translational+Probe+Diffusion.">Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion.</a> Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101 (2014).</li><li>Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a., Schwartz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+needle+viscometer+for+Langmuir+monolayers.">Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers.</a> Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).</li><li>Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+interfacial+shear+microrheology+of+aging+protein+films.">Active interfacial shear microrheology of aging protein films.</a> Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).</li><li>Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+microrheology+of+DPPC+monolayers+at+the+air-water+interface.">Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface.</a> Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).</li><li>Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+microrheology+and+simultaneous+visualization+of+sheared+phospholipid+monolayers.">Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers.</a> Nature Commun. 2 (5), 312 (2011).</li><li>Caruso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+lateral+diffusion+coefficients+in+air-water+monolayers+by+fluorescence+quenching+measurements.">Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements.</a> J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).</li><li>Filippov, A., Or&#228;dd, G., Lindblom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesterol+on+the+lateral+diffusion+of+phospholipids+in+oriented+bilayers.">The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers.</a> Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).</li><li>Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+single-molecule+sensitivity+on+cell+and+model+membranes.">Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes.</a> Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).</li><li>Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+photobleaching+(FRAP)+experiments+under+conditions+of+uniform+disk+illumination.+Critical+comparison+of+analytical+solutions,+and+a+new+mathematical+method+for+calculation+of+diffusion+coefficient+D.">Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D.</a> Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).</li><li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+diffusion+of+lipids+in+liquid+crystalline+phase+phosphatidylcholine+multibilayers.+A+comparison+of+experiment+with+theory.">Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory.</a> Biochemistry. 24 (3), 781-786 (1985).</li><li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+in+phospholipid+multibilayers+measured+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3836-3841 (1977).</li><li>Peters, R., Beck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+diffusion+in+phospholipid+monolayers+measured+by+fluorescence+microphotolysis.">Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).</li><li>Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H., Crawley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical Methods of Chemistry. 1, Part 3B, 651-653 (1972).</li><li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure.">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).</li><li>Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+surface+tension+and+contact+angle+from+the+shapes+of+axisymmetric+fluid+interfaces.">Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces.</a> J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).</li><li>Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+merging+a+surfactant-covered+droplet:+a+novel+technique+to+measure+the+diffusion+of+phospholipid+monolayers+at+fluid/fluid+interfaces.">Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces.</a> Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest.

FRAM özellikle belirli bir alanı beyazlatma sonra floresan kurtarma ölçmek için FRAP ile temel ilkeleri, bir sürü paylaşır, ancak FRAM bir ağartılmış alan oluşturmak için düz arayüzü üzerine bir damlacık birleştirme yerine yoğun bir ışık uygulamak bir işlem kullanır. Birleştirme işlemi böylece FRAM en önemli adımdır ve özellikle, bir damlacık birleştirdikten sonra düz tek tabaka karanlık leke şekli yayınım ölçüm doğruluğunu belirler. Özellikle, bir akım yöntemine dayalı, biz sadece prosedür 4&#39;te gösterilen koyu leke ortalama yoğunluğunu hesaplamak için bir ilgi bölge olarak bir R yarıçaplı daire ayarlayın ve dairesel şekilden bir çok sapma varsa, Bu difüzyon katsayısı hassas ölçüm rahatsız olur. Bu nedenle, bu dairesel şekilli karanlık bölgeye elde etmek için gerekli olduğunu, ancak, dairesel olmayan şekiller çeşitli nedenlerden dolayı zaman oluşturulur. İlk olarak, Pet, bir konvektif akışını mevcutsari çanağı, koyu alanın şekli akış yönünde uzatılmış olur. Prosedür 1,3 belirtildiği gibi, koni şekilli cihazı konvektif akışını bastırmaya yardımcı olur ve bu uzama minimize olacaktır. Kılcal uç son bir birleşme sürecinde düz arayüzü dokunursa kılcal uç birleştirme işlemini keser çünkü İkincisi, karanlık alan şekillerin çeşitli ile oluşturulmuştur. Sadece kılcal sonuna asılı olan bir damlacık elde ederek, bu durdurma önlenebilir. Özellikle, kılcal bir hidrofobik tedavi kılcal en sonunda oturup damlacık yardımcı olur. Bu nedenle, yukarıdaki sorun çekimleri ve değişiklikler daha doğrusu difüzyon özelliklerini ölçmek için bize sağlar. Bu iyi sorunlarını giderdiğiniz İşlem, bu nedenle FRAM FRAP göre çok önemli avantajlara sahip olmasını sağlar. İlk olarak, FRAM FRAP kıyasla daha basit bir ekipman gerektirir. FRAM için, basit bir floresan Micros kullanmak yeterlidiryerine dalga boyu boya emme spektrumu ile eşleşmesi gerekir bir yüksek güç lazer ile pahalı bir konfokal mikroskop, baş. Buna ek olarak, bu FRAM damlacık boyutu veya damlacık yüzeyinde yüzey basıncını ayarlayarak kolayca alanın boyutunu kontrol eder, FRAP ağartılmış alanına boyutunu ayarlamak için ilave aygıtlar kullanmak gereklidir. İkinci olarak, bu ömürlük, boyalar, çeşitli türlerin kullanılması mümkündür. FRAP sadece kimin ağartma işlemi difüzyon süreci çok daha hızlı boya molekülleri kullanır. Boyaların difüzyon ağartma işlemi sırasında oluşursa, doğru difüzyon özelliği tahmin etmek zordur. FRAM Ancak, boyalar ağartılması için bir işlemi gerektirir ve bu nedenle fluoresans görüntüsü boyalar çeşitli kullanımını sağlar. Buna ek olarak, sıkı bağlamak ek yüksek güç lazerleri gerektirir ve filtre o FRAM filtre setleri yerine sadece gerekli ise, boya türlerini değiştirmek için ayarlar. NihayetFRAP yalnızca ölçer, damla yüzeyi ve düz arayüzde mono tabakaları, çünkü bu şekilde arası difüzyon incelenmesine imkan veya A-tip B tipi tek tabakalı için tek tabaka birleştirme iki farklı lipid tek katmanlarının arasındaki karıştırma bağımsız olarak oluşturulabilir bir tek tabaka kendini difüzyon. Bu avantajlara rağmen, düz bir hava-su arayüzü üzerine bir damlacık birleştirme süreci potansiyel nedeniyle böyle iki mono tabakaları arasındaki yüzey basıncı uyumsuzluğu, birleştirme işleminin zaman ölçeği olarak endişe olabilir çeşitli konulara, bu tekniği sınırlandırabilir damlacıkları birleştirdikten sonra düz bir tek tabaka yüzey basınç ve artış. Bu konular, ancak, aşağıdaki nedenlerden dolayı önemli ölçüde difüzyon ölçümünü etkilemez. İlk olarak, iki farklı mono tabakaları yüzey basınçları oldukça farklı olsa bile, bir dengeleme süreci kurtarma işlemi sırasında çok erken bir aşamada tamamlanır. Örneğin, tYüzey basıncı dengeleyecek kadar o damlacık yüzeyinde tek tabaka basıncı düz hava-su ara yüzeyinde tek tabaka daha yüksek olduğu yüzey, karanlık alanı genişler. Bu süreç 10 msn içinde tamamlanır olduğundan önemli ölçüde difüzyon sürecini etkilemektedir önce yüzey basıncı dengelenmiş olacaktır. Birleştirme işleminin zaman ölçeği yeterince hızlı ise İkincisi, hiç difüzyon ölçümü sınırı yok. Neyse ki, tipik bir birleştirme işlemi de 10 msn içinde tamamlanır. Son olarak, çukur yüzey alanının beri yüzey basıncını artırmak değil düz arayüzü üzerine damlacıkların hatta birden birleştirilmesi damlacık yüzey alanının çok büyüktür. Protokolde tarif edilen çukur ve damlacıkların, boyutlarına göre, molekül başına alan bir damlacık birleştirerek en az 0,015% artar. Bu duruma göre, bağlı molekül başına alan değişikliğine yüzey basıncı artışı negligibl olan% 0.1&#39;den az, birVVilhelmy plâka tansiyometre ile ölçülen e bu yüzey basıncı tipik hata çok daha küçük olduğu için. Özetle, biz düz arayüzü üzerine damlacık tek tabaka birleştirerek bir fosfolipid tek tabaka yanal yayılma özelliği ölçmek için yeni bir yöntem tanıttı. Bu teknik, nispeten basit bir ekipman gerektirir ve aynı zamanda boya türlerin çeşitli türlerdeki kullanımını sağlar. FRAM böylece sıvı-sıvı arayüzünde fosfolipidler, blok kopolimerleri, proteinler ve hatta nanopartiküller içeren herhangi bir yüzey aktif ajan, bir difüzyon ölçümleri için potansiyel olarak uygulanabilir. Ayrıca, FRAM iki farklı yüzey aktif maddeler arasında karıştırma arası difüzyon veya çalışmak için yeni bir yol sağlar bekliyoruz.

<html> Fosfolipidler önemli hücre zarlarının yapı parçalarıdır ve organellerin zarları, ve bu membran katmanlarının akışkanlığı genellikle membran proteinlerinin 1 aktivitesini değiştirerek hücresel fonksiyonları etkiler - 3. Örneğin, membran için &#160; homeostazda zar proteinleri ile tespit edilir membran akışkanlığını düzenleyen elde edilir ve akışkanlık anormal düzeyde hepatik steatoz ve kolestaz 4 gibi ciddi hastalıklara neden olur. Buna ek olarak, hava alveol sıvı arayüzünde bir fosfolipid tek tabaka akışkanlığı fonksiyonları önemli etkileri vardır. Düşük akışkanlık ekshalasyonun 5,6 sırasında alveol içinde kalmak katmanı sağlar, oysa akciğer yüzey fosfolipid tek tabaka yüksek akışkanlık, inhalasyon sırasında katmanın yayılmasını kolaylaştırır. Bu rollerini anlamak için fosfolipid tabakaların akışkanlığını tahmin etmek oldukça önemlidir. _content &quot;&gt; akışkanlığı bir doğrudan bir ölçüsüdür viskozitesi ve fosfolipid tabakaların viskozitesi mikron boyutunda kolloidleri 7, manyetik iğneler 8,9 ve manyetik mikro-düğme 6,10,11 kullanılarak ölçülmüştür. Bununla birlikte, bu tekniklerin nispeten sert filmler sınırlıdır ve daha az viskoz filmler ölçemez. Bu gibi durumlarda, yayınım fosfolipid tabakaların akışkanlığını ölçmek için bir alternatif olacaktır. Birkaç on yıl için, fosfolipid tabakaların difüzyon özelliklerini ölçmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir Böyle floresan su verme yöntemi 12, darbeli alan degrade NMR 13 ve flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS) en iyi temsil eden yöntemlerden 14. Bir şekilde (sıkı bağlamak) 15,16 photobleaching sonra floresan kurtarma olduğunu. ölçüm prosedürü ve ilgili basitliği nedeniyle Fosfolipid katmanların difüzyon özelliklerine teori, çeşitli çalışmalar FRAP kullanılarak yapılmıştır <sup&gt; 17 - 19. Ancak, sıkı bağlamak genellikle yüksek güç lazer pahalı bir konfokal mikroskop kurulum gerektirir. Burada, biz (FRAM) birleştirdikten sonra floresan kurtarma olarak adlandırılan fosfolipid mono tabakaları, yanal difüzyonunu ölçmek için yeni bir teknik sunuyoruz. FRAP ve FRAM arasındaki temel fark photobleaching adım damla birleşme yerini olmasıdır. Bir floresan etiketli düz tek tabaka üzerine olmayan floresan tek tabaka ile kaplıdır bir damlacık birleştirme, böylece photobleaching aşaması ile aynı başlangıç ​​durumunu kurma, parlak düz tek tabaka üzerinde dairesel koyu bir leke bırakır. Daha sonra yanal yayılma ölçmek için zaman karanlık leke floresan kurtarma gözlemlemek. Damla birleşme ile bu yeni &quot;ağartma&quot; adım FRAP göre önemli avantajlar sağlamaktadır: FRAM sadece bir floresan mikroskop ziyade FRAP için gerekli olan bir yüksek güç lazer ile pahalı bir konfokal mikroskop gerektirir. beno photobleaching sürecini içermez çünkü n eklenmesi, FRAM floresan boyaların geniş bir yelpazesi vardır. Son olarak, iki farklı tek tabakalar bir damlacık tek tabaka ve düz tek-tabakalı, ve böylece sıkı bağlamak yalnızca mono tabakaları kendi kendine difüzyonunu ölçer interdifüzyon, ölçülmesine izin verecek şekilde, bağımsız bir şekilde hazırlanabilir. FRAM yaklaşık sürtünmesiz materyallere oldukça yapışkan bir malzemeden difüzyon ölçümleri, geniş bir dizi sağlar. Difüzyon damla coalescence süreci (~ 10 msn) zamanında bölgede 100 mikron 100 mikron arasında meydana geldiğinde Prensipte, FRAM, mevcut tekniklere karşılaştırılabilir 10 6 mikron 2 / sn, maksimum yayılma ölçebilirsiniz. Tek molekül sıraları, katı olmadıkça Ayrıca, yavaş bir difüzyon işlemi kolaylıkla ölçülebilir. FRAM sürece uygun floresan etiketli moleküller bulunmaktadır gibi yüzey aktif maddelerin her türlü için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1288">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Acetone</td>
			<td style="width:269px;">OCI corporation</td>
			<td style="width:251px;">Acetone 3.8L Extra Pure</td>
			<td style="width:552px;">Purity: &#8805; 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethanol</td>
			<td>OCI corporation</td>
			<td>Ethanol 3.8L Extra Pure</td>
			<td>Purity: &#8805; 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Deionized water/Water purify system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q liocel</td>
			<td>&#62;18.2 M&#937;&#903;cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td>Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Chloroform</td>
			<td>LiChrosolv</td>
			<td>Chloroform ultrapure (A3633)</td>
			<td>Purity: &#8805; 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine DPPE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C, 810158P</td>
			<td>Avoid direct light exposure to prevent photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wilhelmy plate tensiometer</td>
			<td>R&#38;K ultrathin organic film technology</td>
			<td>Wilhelmy tensiometer</td>
			<td>http://www.rieglerkirstein.de/index.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Micromanipulator 5171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope 1</td>
			<td>Objective lens: Olympus</td>
			<td>Objective lens: UPlanFl 10x</td>
			<td>Objective lens: 10x NA 0.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope 2</td>
			<td>Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs</td>
			<td>Objective lens: UPlanFl 10x</td>
			<td>Objective lens: 10x NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD for Microscope 1</td>
			<td>Jai</td>
			<td>CV 950 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD for Microscope 2</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter set</td>
			<td>Chroma technology</td>
			<td>Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605</td>
			<td>Prepare suitable for dye molecules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>Wiseclean WUC-D06H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after merging a droplet to measure the two-dimensional diffusion of a phospholipid monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi floresans görüntüleri bir dizi düz DOPC tek tabaka üzerine DOPC tek tabaka ile kaplanmış bir damlacık birleştirme sonrası iyileşme sürecinde zaman elde edilmiştir. Düz bir hava-su ara DOPC tek tabakalı düşük miktarlarda katkılı edildi Rodamin-DPPE ve bu böylece bir parlak renkli ve yeni düz arayüzü eklenmiştir koyu bölgesi ile bir arka plan görselleştirmek için yapılmıştır. Orada, bir geri kazanım işlemi, sabit yüzey basıncı 23 mN / m gözlenmiştir. Zamana göre fraksiyonel yoğunluk değişimine denklem 1 &#39;in bir uyum, bu uyum R2 değeri 0,999 olan. Şekil 2&#39; de gösterilmiştir ve bu uyum bile hala daha düşük ya da daha yüksek yüzey basınçlarda çalışır. Bu uyum elde DOPC tek tabaka difüzyon katsayısı yüzey basıncı 23 mN / m 27,54 um 2 / sn idi. FRAM daha doğrulama, DO difüzyon katsayılarıPC ve dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC) mono tabakalar yüzey basıncına göre ölçülmüştür. Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi, FRAM ~ 9 mN / m bir yüzey basıncı, LC (sıvı yoğunlaştırılmış) nerede DPPC tek tabaka yayılma katsayısının hızlı bir düşüş yakalar - LE (sıvı genişletilmiş) faz geçiş 10 ortaya çıkar ve değerler difüzyon katsayıları da Peters ve ark. 19 tarafından önceden ölçümlerle iyi kabul edilir. Buna ek olarak, yüzey basıncı ile difüzyon katsayısı bir üstel çürüme DOPC tek tabaka gözlendi ve bu eğilim Caruso ve diğ. 12 ile ölçülen biri ile hemen hemen aynıdır. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig1.jpg" /> Şekil 1. (A) FRAM şematik gösterimi (birleştirdikten sonra floresan kurtarma) tekniği. Dudak olarakid tek tabakalı kaplı damlacık düz hava-su arayüzü birleştirilir, floresan olmadan lipit tek katmanlı lipit düz floresan lipit tek tabaka yerleştirilir etiketledi. Yüzey basıncı 23 mN / m (ölçek bar = 100 um) bir DOPC tek tabaka kurtarma işlemi sırasında zaman (B) Floresan mikroskop görüntüleri. DOPC tek tabaka karanlık bölge tamamen birkaç dakika içinde difüzyon işlemi ile elde edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53376/53376fig2.jpg" /> Zamana karşı 2. Kısmi yoğunluğunu Şekil. Siyah çevreler ve gri noktalı çizgi, zamanla fraksiyonel şiddetleri görüntü analizi (prosedürler 4.1 ve 4.2) ve denklemin 1 uyum elde kesirli şiddetleri değerlerini gösterirprosedür 4.3 gösterilen sırasıyla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53376/53376fig3.jpg" /> DOPC (üçgen) ve DPPC (boş kare) yüzey basıncının bir fonksiyonu olarak mono tabakaları Şekil 3. Difüzyon katsayıları. Parlak gri renk ve koyu gri renkli çizgiler daha önce Peters ve arkadaşları tarafından bildirilen difüzyon katsayısı değerlerini göstermektedir. ve Caruso ve ark., sırasıyla. Bu rakam Jeong et al. 23 modifiye edilmiştir. Jeong ve ark., Langmuir. 30 (48), 14369-14374 izni ile yayımlanmaktadır. Telif Hakkı 2014 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig3large.jpg" target="_blank">Onu tıklayınız</a>e bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer at JoVE.com

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Bir Damlacık birleştirme sonra Floresan Kurtarma Fosfolipid Monolayer İki boyutlu Difüzyon Tedbir

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

fluorescence-recovery-after-merging-droplet-to-measure-two

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.0K Görüntüleme.  KAIST. We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Video: Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Biyomühendislik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Monolayer sentezi, Montaj ve Karakterizasyonu Protein Monolayer Elektrokimya Korumalı Altın Nanopartikül Filmler

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Enzimatik Deneyi Galyum (III) ve H Transkripsiyon İnhibisyonunu Tedbir<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentaflüorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

Yan yana İyon Değişimi Membranlar arasında İyon Konsantrasyon Polarizasyon birleştirme Polarizasyon Bölgesi İlerlemesinin yasakla

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...