מימון לפיתוח הפרוטוקול הנוכחי נתמך בעיקר על ידי &quot;לשאוף תוכנית Top אוניברסיטת&quot; של האוניברסיטה הלאומית של טייוואן, טייוואן (מענק ID-104R350144), כמו גם את משרד המדע והטכנולוגיה של טייוואן (ID מענק: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). תודה מיוחדת במרכז לביוטכנולוגיה של הלאומית טייוואן אוניברסיטת למתן חדר חיה ומרחב מעבדה לחקר הנוכחי.

הערה: הליך זה הוא שינוי של פרוטוקול תרבות מודל עוף שפותחה על ידי באואר ואח &#39;2013 Nakazawa ואח&#39;, 2011. 2,9.. 1. הכין בריא עוברי יום 5 עובר מן השליו יפני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 1 זכר ונקבה 3 שליו יפני בוגרים מינית יחד באותו כלוב. Feed היצע כרצונך מים. התאם את האור בחדר חיה ל -14 שעות של אור ו -10 שעות חושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ביצים מופרות בשקיות פלסטיק בכל יום בשעות אחר הצהריים ולשמור אותם במקרר 16 ° C לעכב את קצב הצמיחה של עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף מספר מספיק של ביצים בתוך תקופה של שבועיים, לדגור על הביצים המופרות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם אוורור טוב במשך חמישה ימים. </li></ol> 2. כן בסל בינוני לשטוף פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש DMEM / F-12 בינוני (מותאם pH 7.2) כמדיום הצמיחה, ומשלימים זהעם 10 סרום חדש נולד% עגל (NBCS) ו -1% פן-סטרפטוקוקוס Ampho. פתרון (PSA; פניצילין, 10 5 יחידות / L; סטרפטומיצין, 100 מ&quot;ג / L; Amphotericin B, 0.25 מ&quot;ג / ליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בופר פוספט פתרון (PBS) בריכוז 10x לאחסון; לשימוש פתרון PBS 1x (המכיל NaCl, 137.93 מ&quot;מ; KCl, 2.667 מ&quot;מ; KH 2 4 PO, 1.471 מ&quot;מ; Na 2 HPO 4 -7 ש 2 O, 8.06 מ&quot;מ; להסתגל 7.2 pH) כדי לשטוף להרטיב אותו זמן קרום שק החלמון הפרדת endoderm מן החלמון אלבומין ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בינוני DMEM (מותאם pH 7.2) מחדש להשעות כדורי האנדודרם. </li></ol> אוסף 3. EECS ראשית ממנהל YSMs יפני שליו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על הביצים שנאספו במשך 5 ימים (שלב 1.3). בדוק את הביצים על ידי בודק ביצים כדי לאשר התפתחות עוברית נורמלית. הערה: ביום עוברי יום 5, הגבול של mesoderm YSM הוא מאוד ברורה ואת 3 השכבות העובריות הן פחות בחוזקה צמודות זו לזו, כך קל OBendoderm טיין. השתמש רק את הביצים מראות פיתוח זרימת נימים נורמלי אוספים YSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את קליפת הביצה באמצעות מים מתוקים בזהירות אתנול 75%. פתח את קליפת הביצה מעמדת תא אוויר על ידי זוג מספריים, לקלף בעדינות החוצה לאסוף את כל YSM ידי מלקחיים ומניחים בצלחת תרבות 10 ס&quot;מ מלא 37 ° C 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג מספריים להסיר את העובר, חלמון ביצה-לבן, לשטוף בעדינות את YSM עם 1x PBS שלוש פעמים ומניחים YSM בתמיסה PBS בצלחת תרבות 10 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים וזוג מספריים כדי להסיר את האאקטודרם מ YSM. שימוש 2 מלקחיים, אחד להחזיק את שכבת תאי endodermal בתקיפות, ושני להחזיק את המזודרם נימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, לפרק ולהפריד את endoderm מהקצה של mesoderm בכיוון כלפי העובר. אסוף את endoderm אור צהוב 50 מ&quot;ל צינורות צנטריפוגות באמצעות טפטפת ומניחים 15 מ&quot;ל של מדיום הגידול בתוך וואט 37 ° Cאה באמבטיה עד כל אוספי הרקמות הושלמו. </li></ol> 4. עיכול של פרוסות endoderm ידי Collagenase עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי לפזר 6.5 יחידות של collagenase מסוג IV ב 10 מ&quot;ל של DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 50 מ&quot;ל צינורות (3.4) ב 130 XG 3 דקות ב RT. לשאוב את המדיום ולמקם כל endoderm בצלחת תרבות 6 ס&quot;מ בעזרת פיפטה. הוסף פתרון collagenase 1 מ&quot;ל ל צלחת תרבות זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את endoderm שנאספו 2 עוברים שליו עם זוג מספריים מעוקל עד לגודל של כל פרוסה הוא כ 2 עד 3 מ&quot;מ. השתמש טפטף, לאסוף את כל הפרוסות לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר יחד עם 9 מיליליטר של תמיסת collagenase הטריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את הרקמה עם collagenase למשך 30 דקות באמבט מים רועד 37 מעלות צלזיוס ב 175 סל&quot;ד. עיכול חלקי זה עם collagenase משמש כדי לשפר את התפשטות תאי explant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 130 XG 3 דקות ב RT בעדינות להסיר את החלק היחסי supernatant בעזרת פיפטה. שטפו את הכדור על ידי השעיית ב 20 מ&quot;ל DMEM ולהסיר את החלק היחסי supernatant לאחר צנטריפוגה 130 XG במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות את גלולה עם 12 מ&quot;ל של מדיום הגידול (DMEM / F12 עם 10% ו -1% NBCS PSA) וזרעי בעדינות שווה לתוך צלחת 24 גם (כל טוב עם 500 פתרון התא μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה explants רקמות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באוויר במשך 2 ימים כדי לאפשר לתאים להתרבות מתוך הרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 2 ימים נוספים ולאפיין עבור כדאיות התא על ידי פרוטוקול assay כדאיות התא. 15 הערה: תאי חיים לשמור על סביבת הפחתה בתוך cytosol. Resazurin, המרכיב הפעיל, הוא תרכובת חדירה רעילה, תא זה כחול בצבע הלא ניאון כמעט. כאשר נוספו בתרביות תאים, resazurin מצטמצם resorufin ב cytosol על ידי אנזימים המיטוכונדריה. Resorufin הוא בצבע אדום ניאון מאוד. תאים חיים להמיר ברציפות resazurin כדי resorufin, increasing הקרינה והצבע הכולל של מדיום תרבות תאים הסובבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע בידוד RNA הכולל תא אפיתל endoderm, הפוכה שעתוק בזמן אמת PCR כמותי של ביטוי mRNA הגן סמן כמתואר. 16,17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש PCR transcriptase הפוך לזהות SOAT1 mRNA (במובן: 5&#39;-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 &#39;; antisense: 5&#39;-ATCTGCACGTGACATGACCA-3&#39;; PCR מוצר = 168 נ&quot;ב) כסמן ספציפי עבור תאי EEC. השתמש β-תקטין mRNA (במובן: 5&#39;- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 &#39;; antisense: 5&#39;- GTGATGGACTCTGGTGATGG-3&#39;; מוצר PCR = 151 נ&quot;ב) כמו גן משק ובקרה פנימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ג&#39;ל אלקטרופורזה כדי לזהות את גודל המוצר של RT-qPCR. כן 1% ג&#39;ל agarose, ומערבב 10 μl מוצר qPCR עם צבע טעינה 2 μl. תערובת טען 10 μl היטב לתוך כל אחד בתוך הג&#39;ל agarose 1%, ולהפעיל את הג&#39;ל על ידי 100V במשך 30 דקות. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+white+proteins+and+their+potential+use+in+food+processing+or+as+nutraceutical+and+pharmaceutical+agents--a+review.">Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review.</a> Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).</li><li>Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+chicken+yolk+sac+acquires+nutrient+transport+competence+by+an+orchestrated+differentiation+process+of+its+endodermal+epithelial+cells.">The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells.</a> J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).</li><li>Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+concentration+of+different+lipid+classes+during+late+embryonic+development+in+a+randombred+turkey+population+and+a+subline+selected+for+increased+body+weight+at+sixteen+weeks+of+age.">The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age.</a> Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).</li><li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+expression+of+acyl-coenzyme+A:+cholesterol+acyltransferase+in+the+yolk+sac+membrane,+liver,+and+intestine+of+developing+embryos+and+posthatch+turkeys.">The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys.</a> Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).</li><li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ontogeny+of+fatty+acid-binding+protein+in+turkey+(Meleagridis+gallopavo)+intestine+and+yolk+sac+membrane+during+embryonic+and+early+posthatch+development.">The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development.</a> Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).</li><li>Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Participation+of+endodermal+epithelial+cells+on+the+synthesis+of+plasma+LDL+and+HDL+in+the+chick+yolk+sac.">Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac.</a> Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).</li><li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+endodermal+epithelium+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development.">Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).</li><li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+across+endodermal+cells+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development.">Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).</li><li>Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yolk+sac+endoderm+is+the+major+source+of+serum+proteins+and+lipids+and+is+involved+in+the+regulation+of+vascular+integrity+in+early+chick+development.">Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development.</a> Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).</li><li>Noble, R. C., Cocchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+the+neonatal+chicken.">Lipid metabolism and the neonatal chicken.</a> Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).</li><li>Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+esterification+of+cholesterol+in+the+yolk+sac+membrane+of+the+chick+embryo.">The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo.</a> Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).</li><li>Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+of+nutrient+transporters+and+digestive+enzymes+in+the+yolk+sac+membrane+and+small+intestine+of+the+developing+embryonic+chick.">Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick.</a> Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).</li><li>Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+Induction+of+VLDLy+Assembly+in+Egg-Laying+Hens.">Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens.</a> J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).</li><li>Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+consumption+of+yolk+granules+during+the+development+of+quail+embryos.">Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos.</a> Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , (2008).</li><li>Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Amelioration+of+High-Fat+Diet-Induced+Fatty+Liver+by+Docosahexaenoic+Acid+and+Lysine+Supplementations.">Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations.</a> Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).</li><li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+receptor+1+regulates+bone+formation+and+osteoblast+differentiation+by+GSK-3&#946;/&#946;-Catenin+signaling+in+mice.">Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3&#946;/&#946;-Catenin signaling in mice.</a> Bone. 64, 147-154 (2014).</li></ol>

There is no competing financial interests or other conflicts of interest. We did not get any funding from any private company.

כיוון שמערכת התרבות הקודמת יש הצלחה מוגבלת בלבד, מערכת התרבות טוב יותר הוא זקוק. Endoderm YSM שליו יפני נזקק לטיפול אנזימים מפרקי חלבונים כגון collagenase כדי לשחרר את הצמתים תאים תאים כדי להשיג ביצועים לצמיחה טובה יותר של explants-vivo לשעבר. הנתונים שלנו מראים כי מספרים סלולריים מט?...

המשאב התזונתי העיקרי של עובר העופות הוא חלמון, מורכב 33 שומני%, 17% חלבון, ו -1% אפר. 1 במהלך התפתחות עוברית, קרום צק חלמון (YSM) גדל מתוך חלל הבטן העוברי ובהדרגה מכסה את החלמון משטח. החל ביום עוברי 2, ביטוי גנים הקשורים לחילוף חומרי אנגיוגנזה שומנים הוא גדל בהדרגת YSM, ואת YSM מתפתחת לאט תחזיות סיסיות דמויות. 8,9 תחזיות אלו להגדיל ספיגת מזון בגוף חלמון לתמוך התפתחות עוברית. YSM הוא רקמת extraembryonic המכיל שלוש שכבות הנבט, האנדודרם, והמזודרם ו האאקטודרם. 14 האאקטודרם שק חלמון פונה חלבון וקישורים עם קרום vitelline כדי לכסות את שק החלמון בעדינות. לתאי האפיתל endodermal מתמודדים ישירות לעבר חלמון ביצה ולשמש פורטלים ניצול מזין. 6 ככל YSM מתרחב, תא אפיתל endodermal (EECS) ניתן לחלק ידי shapדואר ופונקציונלי לשתי קבוצות, vitelline האזור והאזור vasculosa. 7 vitelline פינת מורכב של תאים endodermal והוא רחוק מן העובר; vasculosa באזור מורכב של תאי mesodermal ומכסה EECS בדיל עם כלי דם ורקמות חיבור. על ידי עוברי יום 5, החלמון מכוסה לחלוטין על ידי האאקטודרם ו endoderm של YSM ואזור וסקולרית גדל בקצב מהיר. YSM סופג, גורם לבנייה מחדש ומשחרר שומנים (כמו החלמון נגזר ליפופרוטאין בצפיפות נמוך מאוד) וחלבונים לתוך מערכת הדם העוברית. 9, 2 לכן, הקימו מערכת תרבית תאי אפיתל endodermal עוברית שליו יפנית עיקרית, כדי לחקור את המנגנונים של שומנים הנצילות YSM במהלך ההתפתחות העוברית העופות. ליפידים כגון triacylglycerol, לציטין, פוספוליפידים ואסתר כולסטרול (CE) הם מקורות האנרגיה העיקריים עוברות עופות. בשלבים המוקדמים של פיתוח, שומני חלמון הם גomposed של CE 1.3% בלבד והוא עולה ל 10-15% ב אמצע הקדנציה של פיתוח 3 עובריים העופות, 11. אסתר כולסטרול הוא מסונתז מכולסטרול על ידי 1-acyltransferase O sterol (SOAT1) ב YSM העובר העופות. 4 צורת האחסון של כולסטרול היא CE, CE מתבצעת ליפופרוטאינים, ו ליפופרוטאינים מועברים על ידי מחזור דם לרקמות. 13 שבוע לפני הצוהר יש צמיחה מהירה של עוברי עופות. כ -68% מתוכן השומנים שנותר חלמון נספגים בשלב זה. 10 המנגנון שבאמצעותו חלמון שומנים מנוצלים ניתן לברר באמצעות מודל מחקר EEC. פרוטוקול תרבות עוף EEC הוקם כדי להשיג את מטרה במחקר זה. 2, 9 עם זאת, עקב שיעור ההצלחה הנמוך של explants רקמות, הליך תרבית תאים משופר EEC נדרש כדי ללמוד את הפונקציה של אנזימים מסוימים וחלבונים בתיווך ניצול מזין ידי עוברי עופות במהלך פיתוח.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>12800-017 10 X 1 L</td><td>For wash the EECs pellets</td></tr><tr><td>D-MEM/F-12</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>12400-024 10 X 1 L</td><td>As the basal medium in culturing EECs</td></tr><tr><td>NBCS</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>16010-159</td><td>As the supplyment serum in culturing EECs</td></tr><tr><td>Pen-Strep Ampho. Solution</td><td>BI (Biological Industries)</td><td>03-033-1B 100 ml</td><td>For attenuating the possible infection&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>17104-019 1 g</td><td>&amp;nbsp;Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue.</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>FALCON&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;</td><td>REF-353047</td><td>For EECs to attach and extension</td></tr><tr><td>50 ml PP centrifuge tubes</td><td>Corning&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt; CentriStar&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>430829</td><td>For transportion of membranes and enzyme digestion</td></tr><tr><td>50 ml Conical bottomed Tube with Cap</td><td>PRO TECH</td><td>CT-50-PL-TW</td><td>For transportion of membranes and enzyme digestion</td></tr><tr><td>Reciprocal shaking bath</td><td>DEAGLE</td><td>SB302</td><td>For better enzymatic digestion on membranes</td></tr></tbody></table>

primary endodermal epithelial cell culture from the yolk sac membrane of japanese quail embryos

הקמנו מודל תרבית תאים endodermal אפיתל (EEC) ללימוד פונקציה של אנזימים מסוימים וחלבונים בתיווך ניצול מזין ידי עוברי העופות במהלך הפיתוח. ביצי שליו יפניות מופרות הודגרו ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים ולאחר מכן חלמון ממברנות צק (YSM) נאספו להקים מערכת התרבות EEC. בודדנו את שכבת endoderm העוברית YSM, וחתכתי את הממברנה לתוך 2 - 3 חתיכות מ&quot;מ ו מעוכל חלקית עם collagenase לפני זריעת צלחות תרבות 24 גם. EECS להתרבות מתוך הרקמה והם מוכנים ללימודי תרבית תאים. מצאנו כי EECS היו מאפיינים טיפוסיים של YSM in vivo, למשל, הצטברות של טיפות השומנים, ביטוי sterol O-acyltransferase וטריפז השומנים בדם. טיפול עיכול חלקי גדיל משמעותי את השיעור המוצלח של תרבות EEC. ניצול EECS, הראינו כי הביטוי של SOAT1 הוסדר על ידי ד cAMPחלבון ependent kinase מסלול רציף קשור. מערכת תרבות EEC שליו היפנית העיקרית זהו כלים שימושיים ללמוד תחבורת שומנים עוברית להבהיר את התפקיד של גני המעורבים בתיווך ניצול מזין YSM במהלך התפתחות עוברית עופות.

על מנת להשיג את המטרה של הקמת מודל תא עקבי ושימושי, אנחנו צריכים להרחיב ולייצב את קצב ההתפשטות וביצועים של EECS עופות. השווינו דגירה ישירה של endoderm ללא עיכול אנזים עם endoderm מעוכל חלקית עם אנזימים פרוטאוליטים, כגון collagenase או collagenase בתוספת 0.6 U של dispase. Dispase ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos at JoVE.com

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.

הראשי Endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

primary-endodermal-epithelial-cell-culture-from-yolk-sac-membrane

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.8K Views.  National Taiwan University. To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.

Video: Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך<em&gt; אקס אובו</em&gt; זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ&#39;יק עובר

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biology

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. Chimeric avian embryos, in which quail donor tissue is transplanted into a chick embryo in ovo, combine the power of indelible genetic labeling of cell populations with the ease of manipulation presented by the avian embryo.
Quail-chick chimeras are a classical tool for tracing migratory neural crest cells (NCCs)1-3. NCCs are a transient migratory population of cells in the embryo, which originate in the dorsal region of the developing neural tube4. They undergo an epithelial to mesenchymal transition and subsequently migrate to other regions of the embryo, where they differentiate into various cell types including cartilage5-13, melanocytes11,14-20, neurons and glia21-32. NCCs are multipotent, and their ultimate fate is influenced by 1) the region of the neural tube in which they originate along the rostro-caudal axis of the embryo11,33-37, 2) signals from neighboring cells as they migrate38-44, and 3) the microenvironment of their ultimate destination within the embryo45,46. Tracing these cells from their point of origin at the neural tube, to their final position and fate within the embryo, provides important insight into the developmental processes that regulate patterning and organogenesis.
Transplantation of complementary regions of donor neural tube (homotopic grafting) or different regions of donor neural tube (heterotopic grafting) can reveal differences in pre-specification of NCCs along the rostro-caudal axis2,47. This technique can be further adapted to transplant a unilateral compartment of the neural tube, such that one side is derived from donor tissue, and the contralateral side remains unperturbed in the host embryo, yielding an internal control within the same sample2,47. It can also be adapted for transplantation of brain segments in later embryos, after HH10, when the anterior neural tube has closed47.
Here we report techniques for generating quail-chick chimeras via neural tube transplantation, which allow for tracing of migratory NCCs derived from a discrete segment of the neural tube. Species-specific labeling of the donor-derived cells with the quail-specific QCPN antibody48-56 allows the researcher to distinguish donor and host cells at the experimental end point. This technique is straightforward, inexpensive, and has many applications, including fate-mapping, cell lineage tracing, and identifying pre-patterning events along the rostro-caudal axis45. Because of the ease of access to the avian embryo, the quail-chick graft technique may be combined with other manipulations, including but not limited to lens ablation40, injection of inhibitory molecules57,58, or genetic manipulation via electroporation of expression plasmids59-61, to identify the response of particular migratory streams of NCCs to perturbations in the embryo's developmental program. Furthermore, this grafting technique may also be used to generate other interspecific chimeric embryos such as quail-duck chimeras to study NCC contribution to craniofacial morphogenesis, or mouse-chick chimeras to combine the power of mouse genetics with the ease of manipulation of the avian embryo.62

An approach for analyzing migration and eventual fate of avian neural crest cells in quail-chick chimeric embryos is described. This method is a simple and straightforward technique for tracing neural crest cells during migration and differentiation that are otherwise difficult to distinguish within an unmanipulated chick embryo.

ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

Neuroscience

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the formation of quail-chicken chimeras and the use of the chorioallantoic membrane (CAM) to sustain the development of ectopic tissues date back to the last century. Nowadays, the combination of these classical techniques with recent in vitro methodologies offers novel prospects to further explore organ formation.
Here we describe a two-step approach to study early- and late-stages of organogenesis. Briefly, the embryonic region containing the presumptive territory of the organ is isolated from quail embryos and grown in vitro in an organotypic system (up to 48 h). Cultured tissues are subsequently grafted onto the CAM of a chicken embryo. After 10 days of in ovo development, fully formed organs are obtained from grafted tissues. This method also allows the modulation of signaling pathways by the regular administration of pharmacological agents and tissue genetic manipulation throughout in vitro and in ovo developmental steps. Additionally, developing tissues can be collected at any time-window to analyze their gene-expression profile (using quantitative PCR (qPCR), microarrays, etc.) and morphology (assessed with conventional histology and immunochemistry).
The described experimental procedure can be used as a tool to follow organ formation outside the avian embryo, from the early stages of organogenesis to fully formed and functional organs.

This article provides an updated approach to the classical quail-chicken chimera system to study organ formation, by combining novel in vitro and in ovo experimental procedures.

גישה דו-שלבית לחקור ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של היווצרות האיברים במודל העופות: בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס Organogenesis הפרדיגמה

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Quail Chorioallantoic Membrane - A Tool for Photodynamic Diagnosis and Therapy

The chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo is a thin, extraembryonic membrane that functions as a primary respiratory organ. Its properties make it an excellent in vivo experimental model to study angiogenesis, tumor growth, drug delivery systems, or photodynamic diagnosis (PDD) and photodynamic therapy (PDT). At the same time, this model addresses the requirement for the replacement of experimental animals with a suitable alternative. Ex ovo cultivated embryo allows easy substance application, access, monitoring, and documentation. The most frequently used is chick CAM; however, this article describes the advantages of the Japanese quail CAM as a low-cost and high-throughput model. Another advantage is the shorter embryonic development, which allows higher experimental turnover. The suitability of quail CAM for PDD and PDT of cancer and microbial infections is explored here. As an example, the use of the photosensitizer hypericin in combination with lipoproteins or nanoparticles as a delivery system is described. The damage score from images in white light and changes in fluorescence intensity of the CAM tissue under violet light (405 nm) was determined, together with analysis of histological sections. The quail CAM clearly showed the effect of PDT on the vasculature and tissue. Moreover, changes like capillary hemorrhage, thrombosis, lysis of small vessels, and bleeding of larger vessels could be observed. Japanese quail CAM is a promising in vivo model for photodynamic diagnosis and therapy research, with applications in studies of tumor angiogenesis, as well as antivascular and antimicrobial therapy.

The chorioallantoic membrane (CAM) of the avian embryo is a very useful and applicable tool for various areas of research. A special ex ovo model of Japanese quail CAM is suitable for photodynamic treatment investigation.

ממברנת שליו כוריואלנטואית - כלי לאבחון וטיפול פוטודינמי

The chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo is a thin, extraembryonic membrane that functions as a primary respiratory organ. Its properties ...

Cancer Research

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed contributions to unveiling key processes in developmental biology.
Herein is described an optimized method to isolate embryonic tissues from quail and chickens by microsurgery and enzymatic digestion while preserving its biological properties. After isolation, tissues from both species are associated in an in vitro organotypic assay for 48 h. Quail and chicken tissues can be discriminated by distinct nuclear features and molecular markers allowing the study of the cellular cross-talk between heterospecific association of tissues. This approach is, therefore, a useful tool for studying complex tissue interactions in developmental processes with highly dynamic spatial modifications, such as those occurring during pharyngeal morphogenesis and the formation of the foregut endoderm-derived organs. This experimental approach was first developed to study the epithelial-mesenchymal interactions during early-stages of thymus formation. In this, the endoderm-derived prospective thymic rudiment and mesoderm-derived mesenchyme, were isolated from quail and chicken embryos, respectively.
The capacity of the associated tissues to generate organs can be further tested by grafting them onto the chorioallantoic membrane (CAM) of a chicken embryo. The CAM provides nutrients and allows gas exchanges to the explanted tissues. After 10 days of in ovo development, the chimeric organs can be analyzed in the harvested explants by conventional morphological methods. This procedure also allows studying tissue-specific contributions during organ formation, from its initial development (in vitro development) to the final stages of organogenesis (in ovo development).
Finally, the improved isolation method also provides three-dimensionally (3D) preserved embryonic tissues, that can also be used for high-resolution topographical analysis of tissue-specific gene-expression patterns.

This article provides a method to isolate pure embryonic tissues from quail and chicken embryos that can be combined to form ex vivo chimeric organs.

בידוד של רקמות עובריים ועל היווצרות האיברים Chimeric שליו-עוף לפי הדוגמה בלוטת התימוס

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that the amniotic epithelium is a homogeneous layer. The human amnion can be divided into three anatomical regions: reflected, placental, and umbilical. Each region has different physiological roles, such as in pathological conditions. Here, we describe a protocol to dissect human amnion tissue in three sections and maintain it in vitro. In culture, cells derived from the reflected amnion displayed a cuboidal morphology, while cells from both placental and umbilical regions were squamous. Nonetheless, all the cells obtained have an epithelial phenotype, demonstrated by the immunodetection of E-cadherin. Thus, because the placental and reflected regions in situ differ in cellular components and molecular functions, it may be necessary for in vitro studies to consider these differences, because they could have physiological implications for the use of HAEC in biomedical research and the promising application of these cells in regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane to determine their heterogeneity and functional properties for possible application in clinical and physiopathological models.

בתרבות מבחנה של תאים אפיתל מאזורים אנטומיים שונים של קרום הפיר האנושי

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

בידוד והתרבות של תאים עובריים העופות אבי valvular

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like the craniofacial skeleton and the peripheral nervous system. While it is critical to understand NCC migration in the context of a 3D embryo, isolating migratory cells in 2D culture facilitates visualization and functional characterization, complementing embryonic studies. The present protocol demonstrates a method for isolating chick cranial neural folds to generate primary NCC cultures. Migratory NCCs emerge from neural fold explants plated onto a fibronectin-coated substrate. This results in dispersed, adherent NCC populations that can be assessed by staining and quantitative morphological analyses. This simplified culture approach is highly adaptable and can be combined with other techniques. For example, NCC emigration and migratory behaviors can be evaluated by time-lapse imaging or functionally queried by including inhibitors or experimental manipulations of gene expression (e.g., DNA, morpholino, or CRISPR electroporation). Because of its versatility, this method provides a powerful system for investigating cranial NCC development.

This versatile protocol describes the isolation of premigratory neural crest cells (NCCs) through the excision of cranial neural folds from chick embryos. Upon plating and incubation, migratory NCCs emerge from neural fold explants, allowing for assessment of cell morphology and migration in a simplified 2D environment.

הכנה וניתוח מורפולוגי של תרביות תאי צמרת עצביים גולגולתיים של אפרוחים

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

הראשי Endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ'יק לשעבר vivo (תרבות חדש)