אנחנו הולכים להראות לך איך להכין שליו יפני ex ovo תרבות וכיצד להשתמש קרום chorioallantoic או CAM בקיצור לאבחון פוטודינמי וטיפול בסרטן או זיהומים מיקרוביאליים. היתרונות של שיטה זו הם צמיחה התפתחותית מהירה, גודל קטן, גישה טובה לרקמה וטיפול קל. כמו כן, הוא מכבד את העקרונות של כלל 3R לביצוע מחקר בבעלי חיים.
בשל הדמיון המבני שלו לקרום הרירי כגון שלפוחית השתן, הריאות או השליה, הוא מתאים לבדיקות in vivo של תרופות פוטנציאליות, בדיקות רעילות או מחקרי השתלה. מי שידגימו את ההליך יהיו ברבורה קונדקובה ומג'לינדה מטא, דוקטורנטיות מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להשתמש ביצי שליו מופרות, טרי או מאוחסן ב 10 עד 15 מעלות צלזיוס לכל היותר 4 עד 5 ימים לפני תחילת הדגירה.
השתמשו רק בביצים נקיות ולא פגומות, ולאחר מכן דגרו את הביצים באינקובטור בצורת כפייה בטמפרטורה של 50 עד 60% לחות ו-37.5 מעלות צלזיוס למשך כ-54 שעות שהונחו אופקית כאשר סיבובי הביצים כבויים. מחטאים את משטח הביצה עם 70% אתנול מבלי לסובב את הביצה. לאחר מכן, בארון זרימה למינרית סטרילי תוך לבישת כפפות, פתחו את קליפת הביצה באמצעות מספריים כירורגיים סטריליים קטנים והעבירו את התוכן לצלחת תרבית של 6 בארות.
לאחר כל ביצה, לחטא את המספריים עם 70% אתנול. הוסיפו כ-5 מיליליטר מים סטריליים למרווחים בלוח 6 הבארות מכיוון שהלחות חיונית כדי למנוע מה-CAM להתייבש. לאחר מכן, שאפו עוברים בעלי קצה לא תקין או ביציות לא מופרות עם שואב ואקום, ואז הניחו את העוברים באינקובטור עד לניסויים נוספים תוך שמירה על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בלחות של 80 עד 90%.
כאשר ה-CAM מפותח מספיק, בדרך כלל מהיום העוברי השביעי, הניחו טבעת סיליקון מעוקרת על משטח ה-CAM לאורך הנימים הקטנים תוך הימנעות מכלי דם גדולים. בתנאים סטריליים, להחיל נפח מתאים של תמיסת hypericin 30 microliters על טבעת הסיליקון ולשמור את העוברים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ב 80 עד 90% לחות. כדי לבצע אבחון פוטודינמי, להאיר את ה- CAM באמצעות אור עירור סגול ולרשום את הפלואורסצנציה של היפריצין ותאי גידול של רקמת CAM ותאי גידול באמצעות מצלמה דיגיטלית במרווחי זמן שונים לאחר מתן היפריצין.
אם המחקר דורש תמונה של ה-CAM באור לבן, רשמו את ה-CAM לפני מתן ההיפריצין ובסוף הניסוי זמן קצר לפני קיבוע הרקמה, שכן האור מפעיל הפעלת פוטו של היפריצין. כדי לבצע את הטיפול הפוטודינמי לאחר יישום היפריצין, הנח את ה- CAM מתחת לסיב האופטי עבור קרן הלייזר כדי לכסות את כל האזור בתוך טבעת הסיליקון. לאחר ביצוע הקרנה in vivo, במקרה הספציפי הזה עם אור לייזר של 405 ננומטר בקצב פלואנס של 285 מילי-וואט לסנטימטר מרובע, הקלט CAM באמצעות אור לבן ו/או אור פלואורסצנטי לפני ואחרי טיפול פוטודינמי.
לתקן את רקמת CAM בצלחת טיפוח עם 4% paraformaldehyde ב PBS במשך מינימום של 2 שעות ומקסימום של לילה, ולאחר מכן להסיר את paraformaldehyde בזהירות לחתוך מתוך CAM חלק של הרקמה בתוך טבעת סיליקון. כל השלבים האלה צריכים להיעשות במכסה אדים. לשטוף לחתוך חלק מרקמת CAM במים במשך 10 דקות ולאחר מכן להתייבש בסדרת אלכוהול עולה על ידי הצבת רקמת CAM ב 70% אתנול במשך 3 דקות, תמיסת eosin במשך 2 דקות, throcin 96% אתנול במשך 5 דקות, 100% אתנול במשך 5 דקות, ופעמיים קסילן במשך 10 דקות בצלחת פטרי חדשה.
לאחר מכן, העבירו את הדגימות מהר ככל האפשר לפרפין המומס בכלי פטרי באמצעות מרית או מברשת דקה. לאחר 24 שעות, מניחים את הרקמה בתבנית היסטולוגית, ממלאים אותה במדיום הטמעת פרפין ומאפשרים לה להתמצק במקרר, ואז חותכים את ה- CAM המוצק ממדיום ההטבעה, הופכים אותו במגש ב -90 מעלות, ממלאים אותו שוב במדיום ההטבעה ומניחים לו להתמצק. הכן 5 עד 10 מיקרומטר על מיקרוטום לניתוח היסטופתולוגי כדי לקבוע נזק הנגרם על ידי PDT.
כדי להכין את מקטעי ה-CAM הקפואים להיסטולוגיה, הרכיבו בזהירות CAM קבוע מקורי או 4%paraformaldehyde על מגלשת הזכוכית, מלאו את התבנית המוטבעת עד לחצי עם OCT והקפיאו בחנקן נוזלי או בתערובת של קרח יבש ואתנול. לאחר ההקפאה, הטה בזהירות והחלק את ה- CAM ממגלשת הזכוכית אל החלק העליון של מדיום ה- OCT הקפוא. מניחים שוב בתבנית, מכסים אותה במדיום OCT ומקפיאים כפי שתואר קודם לכן.
לניתוח של כלי דם CAM, יש צורך בדגימות CAM שלמות. בארון הזרימה הלמינרית, הצפת CAM עם תמיסת קיבוע מחוממת מראש של 4% אלדהיד פרפורם, ו-2% גלוטראלדהיד ב-PBS, ולאחר מכן הסר את תמיסת הקיבוע לאחר 48 שעות. לאחר מכן, להפריד בזהירות את CAM מן העובר עם מספריים מיקרו מברשת עדינה ולשטוף אותו PBS, ולאחר מכן להרכיב את CAM שטף על מגלשת זכוכית ולתת לו להתייבש לאט.
לאחר מכן, צלמו את השקופית באמצעות מצלמה דיגיטלית בטרנס-אילומינטור כמקור לאור לבן הומוגני. מיקום הגידול על פני השטח של CAM הודגם תחת אור לבן ואור פלואורסצנטי עם הוספת היפריצין. ניתוח היסטולוגי הראה מבנים קונצנטריים של תאי קשקש לא תקינים הפולשים לרקמות הבריאות בליווי בצקת ועיבוי ממברנות.
לאחר הטיפול ב- PDT, נצפה הבדל ברור בצפיפות כלי השיט בתוך הטבעת והסביבה. קרינת הלייזר ללא נוכחות של פוטוסנסיטייזר לא גרמה לנזק דומה לבקרה ללא כל טיפול. לאחר 3 שעות של דגירה עם היפריצין, קרינת לייזר גרמה לפלואורסצנציה שנגרמה על ידי מונומריזציה של ההיפריצין המצטבר עם נזק נרחב לכלי הדם.
ניתוח היסטולוגי גילה כי ל-CAM בקרה לא מטופל היה עובי שווה יחסית. עם זאת, טיפול PDT גרם ל-CAM להיות דק ושברירי יותר. רק הדגמנו כיצד להכין שליו ex ovo CAM בדיקה וכיצד להשתמש בו.
תוך שמירה על ההנחיות, מתודולוגיה זו קלה לשליטה ויכולה להוכיח תוצאות מהירות.
