מחקר זה נתמך על ידי קרן Hartwell, איגוד הלב האמריקני (המדען פיתוח גרנט # 0830384N) ואת Leducq קרן: 07CVD04 צניפי.

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שליו פורייה ביצים או עוף לשלב 14 - כ (2 ימים) או 25 (כ - 4.5 ימים) ב 60% לחות ו - 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסת מלח מאוזן של ארל סטרילי (EBSS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 100 מ&quot;ל EBSS 10X עד 600 מ&quot;ל מים MΩ 18 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.2 גרם נתרן ביקרבונט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH של התמיסה עד 7.2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את הפתרון עד 1000 מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי עובר דרך פילטר 0.2 מיקרומטר </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני סטרילי M199 תרבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 1 חבילה של אבקת M199 ל 700 מ&quot;ל מים MΩ 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.2 גרם נתרן ביקרבונט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH של התמיסה עד 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל (1%) פניצילין, סטרפטומיצין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את הפתרון עד 1000 מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי עובר דרך פילטר 0.2 מיקרומטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל סטרילי 100x תוספת אינסולין transferrin-סלניום-G </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל (1%) בסרום עוף סטרילית </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין שלושה ממדי ג&#39;ל קולגן קולגן בריכוז של 1.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל. העבודה הקודם במעבדה שלנו הראו כי ריכוז הקולגן של יותר מ 1.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מספקת מטריקס כי היא נוקשה מדי biomechanically עבור התאים כדי לעבור. ריכוזים קולגן ג&#39;ל נמוך יותר מאשר 1.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​יש סיבי קולגן אחדים כך גוש תאים יכולים לגרוס את סיבי מקומית, ייצור אי של תאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הבאים קר כקרח ריאגנטים אל צינור מ&quot;ל סטרילי 15 צנטריפוגות כדי: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3X M199: נפח = נפח הכולל הכרחי / 3 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרילי 18 MΩ מים: נפח = נפח הכולל הצורך (M199 נפח נפח עוף + סרום + 0.1 נפח NaOH M + נפח קולגן) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרום עוף סטרילי: נפח = נפח הכולל הכרחי * 0.01 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זנב עכברוש קולגן אני: נפח = (ג&#39;ל ריכוז הקולגן * סך היקף הצורך) / קולגן ריכוז המניה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרילי 0.1 M NaOH: נפח = נפח הקולגן * 0.2 הערה: כמות המים, 0.1 M NaOH, וכן קולגן נוסף ישתנו בהתאם לריכוז פתרון המניות קולגן. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הפתרון קולגן היטב עם פיפטה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר 0.3 מ&quot;ל של התמיסה לתוך קולגן 1.9 2 ס&quot;מ בארות הצמיחה באזור. זהו פתרון קולגן מספיק כדי לכסות לחלוטין את הבאר לספק ג&#39;ל כי הוא כ 3 מ&quot;מ עובי. עובי ג&#39;ל של לפחות 250 מיקרומטר הכרחי ללימודי הפלישה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון קולגן כדי ג&#39;ל למשך שעה לפחות 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו -100% לחות. </li></ol></li></ol> 2. Pre-EMT Endocardial בידוד תא ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העובר בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חתיכה אחת ארוכה אינץ של הקלטת מעבדה על קצה הרחבה יותר של הביצה. זה המקום שבו התא נמצא באוויר. הקלטת מייצב את מעטפת הביצית שביר שליו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לנקב את שטח מוקלט של הביצה בתא אוויר עם קצה מעוגל מספריים מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים חור בחלק מוקלטות של הביצה כי הוא גדול מספיק כדי לאפשר החלמון לעבור. התחל את החור ב לנקב את חתך החוצה בצורת ספירלה. הקפד לחתוך דרך הממברנה החיצונית, אך להימנע פירסינג החלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר חור במעטפת תושלם, לדמיין את העובר שליו. העובר נמצא בדרך כלל בצד העליון של החלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין לשפוך את החלמון דרך לחתוך את החור הביצה ביד אחת. החזק פינצטה # 55 ב מצד שני. כאשר העובר יוצא ביצה בצד העליון של החלמון, החלק בעדינות את # 55 פינצטה תחת העובר ולהסיר ממנו החלמון. הערה: ביצים, עוף, הבידוד העובר כרוך פיצוח ביצה עוף על משטח, חד ונקי לשבור את הביצה לתוך צלחת פטרי 100 מ&quot;מ. העובר צריך להיות ממוקם בצד העליון של החלמון. החלק בעדינות # 55 פינצטה תחת העובר ולהסיר ממנו החלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העובר לתוך צלחת פטרי המכילה 100 מ&quot;מ קר כקרח, EBSS סטרילית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב את העוברים על פי הקריטריונים של המבורגר המילטון 1. עוברים בשלב 14 - הם שלב 13 האחרונות, אבל עדיין לא ב 15 הבמה, עם 20-21 somites וניצן הזנב. מאפיין המפתח של שלב 14 - עוברים הוא זווית הראש, שהוא קצת יותר מ 90 מעלות לגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את לבבות מעוברים שליו בשלב 14 - # 55 עם פינצטה ידי קיצוץ רוחבי שבו התעלה AV ו OFT ליצור קשר עם קיר החזה. מניחים את לבבות בצד אחד של צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את לבבות בודדים עם טפטפת העברת סטרילי ולהכניס אותם לתוך צלחת פטרי חדש 100 מ&quot;מ מלא סטרילי, קר כקרח EBSS. </li><html><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את OFTs ותעלות AV רוחבי מן החדרים עם # 55 פינצטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף התעלות AV הנותרים ו / או שטחי יצוא (OFTs) longitudinally. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר פיפטה לנפח של UL 20. השתמש פיפטה כדי לשאוב six longitudinally לחתוך תעלות AV ו OFTs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרש את תעלות AV ו OFTs על ג&#39;ל קולגן. לשאוב כל EBSS עודף מפני השטח של הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש # 55 פינצטה כדי לכוון את explants ולכן הם שטוחים כך את הצד לומן הפנים ג&#39;ל קולגן. נסו לא לנקב את ג&#39;ל קולגן בפינצטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2, להסיר את שריר הלב מן explants # 55 עם פינצטה. התאים endocardial צריך להשאיר מאחור על פני השטח של ג&#39;ל קולגן. לחלופין, שריר הלב יכול להיות שמאל על explant. עם הסיר שריר הלב, התאים endocardial עם לא עוברים EMT ללא התערבות. עם שריר הלב הנוכחי תת קבוצה של תאים endocardial יהפוך mesenchyme, אך מידת השינוי יכול להיות מאופנן עם גורמים חיצוניים. הערה: גם אם שריר הלב תישאר על, explant יש לאפשר לפחות 2 שעות לצרף הג&#39;ל לפני המדיום הוא הוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.4 מ&quot;ל M199 בינוני לכל explants היטב המכיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו -100% לחות. </li></ol> 3. Post-EMT AV Cell mesenchymal כריות בידוד ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפצח את הביצה עוף על משטח, חד ונקי לשבור את הביצה לתוך צלחת פטרי 100 מ&quot;מ. העובר צריך להיות ממוקם בצד העליון של החלמון. תרימי את העובר עם # 5 על ידי פינצטה לתפוס את הקרומים המקיפים את העובר ולאחר מכן למקם את העובר לתוך צלחת פטרי 100 מ&quot;מ מלאים קר כקרח, EBSS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב את העוברים על פי הקריטריונים של המבורגר המילטון 1. תכונות של עובר שלב 25 כולל המרפק ברורים המפרקים בברך פיגמנטציה עין קלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את ליבם מכל HH25 עוברים במקום לבבות בצד אחד של צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את לבבות בודדים עם טפטפת העברת סטרילי ולהכניס אותם לתוך צלחת פטרי חדש 100 מ&quot;מ מלא סטרילי, קר כקרח EBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את האזור AV מכל הלב בבת אחת. מניחים את AVS יחד בצד אחד של צלחת פטרי. בעדינות להתסיס את האזור AV להסיר את כל הדם, מה שעלול להשפיע על כדאיות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את AVS מבודד עם טפטפת העברת סטרילי ולהכניס אותם לתוך צלחת פטרי חדש 100 מ&quot;מ מלא סטרילי, קר כקרח EBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברצף לבודד את הכריות של AV. ודא שאין הנוכחית שריר הלב על כריות AV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף הכריות מבודד עם טפטפת העברת סטרילי ולהכניס אותם לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הכריות לחלק התחתון של הצינור צנטריפוגות ב XG 15 במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש טיפ סטרילי 1000 מ&quot;ל כדי להסיר כמה שיותר supernatant EBSS ככל האפשר מבלי להפריע כריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של 0.25% טריפסין-EDTA כי כבר מראש לחמם 37 ° C. אפשר הכריות כדי לדגור על טריפסין עד שהם נמס לגמרי, שהיא בדרך כלל כ 3-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של נסיוב עוף הצינור צנטריפוגות כדי להרוות את טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים ב XG 160 במשך 5 דקות. הסר את supernatant עם טיפ, סטרילי μL 1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 2 מ&quot;ל של מדיום M199 ומערבבים ידי pipetting. קח 10 μL ההשעיה התא לסמוך על hemocytometer ולקבוע את המספר הכולל של תאים שהיו מבודדים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע כמה ג&#39;ל קולגן ייעשה על בסיס מספר של תאים בודדים. תאים צריכים להיות מצופה בצפיפות של 2 x 10 5 תאים / מ&quot;ל עם נפח 250 ג&#39;ל μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים ב XG 160 במשך 5 דקות. הסר את supernatant עם טיפ, סטרילי μL 1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פרוטוקול המפורטות לעיל, להוסיף 3X M199, מים, עוף בסרום, קולגן, 0.1 M NaOH, בסדר הזה, אל התא גלולה. מערבבים על ידי pipetting עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 250 μL לכל אזור גידול 1.9 2 ס&quot;מ היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון קולגן כדי ג&#39;ל למשך שעה לפחות 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו -100% לחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.4 מ&quot;ל של התקשורת בתרבות דגירה לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמשיך culturing ג&#39;לים מדגישים ללא תנאי, לשחרר את הג&#39;לים מן הצדדים של התרבות גם באמצעות קצה סטרילי 200 פיפטה μL. תרבויות מוגבלים מבחינה מכנית הם ג&#39;לים שנשארים מחוברים הצדדים התרבות היטב. </li></ol> 4. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1:. דוגמאות של עוברים (א) HH14-שליו העובר, ו (ב) העובר HH25 עוף מוצגים כאן. fig2.jpg &quot;alt =&quot; איור 2 &quot;/&gt; איור 2: HH14 שסתום explants endocardial לאחר 2 שעות של תרבות (A) עם ההווה שריר הלב, או (ב) עם שריר הלב הסיר.. <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3:. HH14 שסתום explants endocardial (A) עם ההווה שריר הלב, רבים של תאים עוברים endocardial לשינוי mesenchymal ויש להם ציר בצורת, פנוטיפ mesenchymal לאחר 48 שעות של תרבות. (ב) כאשר שריר הלב הוא הסיר כל התאים לשמור המרוצף בצורת, פנוטיפ endocardial לאחר 48 שעות בתרבות. <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4:. HH25 תאים תאים שסתום mesenchymal ב ג&#39;ל קולגן מעוגלות מיד לאחר זריעת. <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig5.jpg" alt="איור 5"/> איור 5:. HH25 תאים mesenchymal בתרבות (א) לאחר 48 שעות של תרבות ג&#39;ל קולגן מוגבל HH25 תאים mesenchymal מתחילים להתפשט. (ב) HH25 תאים בג&#39;ל ללא מתח קולגן 7 ימים לאחר זריעה ו 6 ימים אחרי השחרור יש לדחוס את הג&#39;ל על כ -50% של האזור המקורי.

<ol>
	<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+A+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Biology. 95, 108-108 (1983).</li><li>Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periostin+promotes+atrioventricular+mesenchyme+matrix+invasion+and+remodeling+mediated+by+integrin+signaling+through+Rho/PI+3-kinase.">Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase.</a> Developmental Biology. 302, 256-256 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה לבודד תאים endocardial משלב HH14 - לבבות שפותח במקור על ידי ראניין ו Markwald מספק מבוקרת, בסביבה מבחנה כדי לחקור את הגורמים ליזום לווסת EMT עובריים 2. HH14 - explants endocardial תרבותי ללא שריר הלב לא יעברו EMT ללא התערבות ביומכנית או ביוכימי. אם שריר הלב נשאר ע...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Extra fine Bonn scissors, curved</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14085-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont tweezers #55</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>14099</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont tweezers #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>14098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile transfer pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Samco Scientific </td>
<td>2041S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4-well culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile disposable filter units, PES, 0.2 &mu;m pore size membrane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene</td>
<td>566-0020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile 15 mL centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430828</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>25384-342</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laboratory tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>89097-920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat-tail collagen I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354236</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X Earl's Balanced Salt Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quality Biological, Inc.</td>
<td>119-064-131</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>M199 powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31100-035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41400-045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chicken serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16110-082</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S5761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide solution, 1.0 N</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S2770</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fertile quail eggs (Coturnix coturnix)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lake Cumberland Game Bird Farm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fertile chicken eggs (Gallus gallus)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cornell University Poultry Farm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells

היווצרות לתפקוד תקין של מסתמי הלב העוברי הוא קריטי עבור התקדמות התפתחותית. הלב העוברי מוקדם הוא צינור בצורת U של endocardium מוקף שריר הלב. מפריש שריר הלב לב ג&#39;לי, מטריצה ​​hyaluronan עשיר דביקות, לתוך הצומת העליות והחדרים (AV) ודרכי יצוא (OFT) לומן. בשלב HH14 valvulogenesis מתחיל כאשר תת קבוצה של תאים endocardial לקבל אותות שריר הלב, לעבור endocardial לשינוי mesenchymal (EMT), וכן לפלוש ג&#39;לי לב. בשלב HH25 הכריות valvular הם mesenchymalized לחלוטין, והוא זה mesenchyme שבסופו של דבר יוצר את מנגנון valvular ו במחיצה של הלב. הבנת המנגנונים כי ליזום לווסת את תהליך הבידול EMT ותא חשובים בגלל הקשר שלהם עם מומי לב מולדים חמורים. במחקר זה אנו מציגים שיטות לבודד מראש EMT endocardial ופוסט EMT תאים mesenchymal, אשר הם שני פנוטיפים תאים שונים של כרית prevalvular. Pre-EMT תאים endocardial יכול להיות מתורבת, עם או בלי שריר הלב. Post-EMT תאים AV כרית mesenchymal יכול להיות מתורבת ג&#39;ל קולגן בתוך מוגבל מכנית או ללא מתח. אלה מודלים 3D ב במבחנה לחקות המפתח אירועים morphogenic valvular ו שימושיים לפרק את המנגנונים של valvulogenesis בשלב מוקדם ומאוחר.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells at JoVE.com

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

מאמר זה יספק שיטה בידוד שליו culturing או עוף HH14<sup&gt; -</sup&gt; שסתום תאים endocardial ו HH25 כרית שסתום תאים mesenchymal.

בידוד והתרבות של תאים עובריים העופות אבי valvular

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

isolation-and-culture-of-avian-embryonic-valvular-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Views.  Cornell University. מאמר זה יספק שיטה בידוד שליו culturing או עוף HH14 - שסתום תאים endocardial ו HH25 כרית שסתום תאים mesenchymal.

Video: Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

בידוד תרבות שלאחר הלידה cerebellar עכבר גרגיר Neuron ובתאים ונוירונים

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

בידוד של תאים אנדותל valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

בידוד והתרבות של תאים מאזור nephrogenic של הכליה עכבר עובריים

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...