מטרת שיטה זו היא לזהות את הקישוריות התפקודית של תשומות ארוכות טווח מאזורי מוח מרוחקים באמצעות פוטוטימוציה בפרוסות מוח. המיקוד הסטריאוטקסי של אזור מוח מסוים לביטוי מתווך שונים של תעלות יונים רגישות לאור מאפשר גירוי סלקטיבי של אקסונים המגיעים מאזור זה עם אור. הדגמת ההליך תהיה לואיס ריצ'בו, דוקטורנט מהקבוצה שלי.
לפני הניתוח, ודא כי החיה היא הרדמה היטב עם קמצוץ בוהן. משוך בעדינות את לשונו כדי להקל על הנשימה. לאחר מכן, לגלח את השיער הגולגולתי.
להזריק 20 microliters של הידרוכלוריד לידוקאין מתחת לעור הראש עבור הרדמה מקומית ולחכות חמש דקות. כדי לחשוף את הגולגולת, לעשות חתך על הקרקפת. לאחר מכן, מניחים את החיה במסגרת סטריאוטוקסית.
הכנס את הסורגים ואת אותם על העצמות מעט rostral לאוזניים ולמשוך את העור כדי ליצור גישה טובה לגולגולת. הדקו את פסי האוזן והתקינו את חתיכת האף. יש לשמור על גוף החיה אופקית וברמה של הראש באמצעות תמיכה מותאמת גובה.
מניחים כרית חימום מתחת לחיה כדי לשמור אותו בטמפרטורה פיזיולוגית. לאחר מכן לנקות את הגולגולת על ידי החלת 0.9% נתרן כלורי עם ספוגית כותנה כדי להסיר רקמה רכה. התאימו את הגולגולת כך שהגישה לבריגמה למדה תהיה מפלסת.
לאחר מכן, לאתר את אתר ההזרקה על הגולגולת על פי הקואורדינטות האחוריות והמדיאליות ולמקם את מחט ההזרקה מעליו. סמן את הגולגולת עם מחט חד פעמית. לאחר מכן, להזיז את מחט ההזרקה כלפי מעלה על ידי ארבעה סנטימטרים.
באמצעות בר 0.5 מילימטר, ליצור craniotomy בקוטר מילימטר אחד על הסימן במחצית אחת של המהירות המרבית. ספוגית עם רקמה אם מתרחש דימום כלשהו. לאחר מכן, רוקן את המים הכלולים במזרק המילטון לאחסון על ידי פליטה מוחלטת שלו עם משאבה.
רק המחט מלאה במים. להפשיר את הפתרון הוויראלי להיות מוזרק על קרח, ולאחר מכן, בקצרה להסיר אותו מהקרח ולקבל 700 nanoliters של הפתרון עם micropipette. לאחר מכן, להפקיד טיפה על פיסת סרט פרפין.
מניחים את סרט הפרפין על גבי הגולגולת. לצלול את המחט בירידה של פתרון ויראלי מבלי לשנות את התווית anteroposterior ומיקום משני. לאחר מכן, השתמש בפונקציית הנסיגה של המשאבה כדי למלא את המזרק בכ-500 ננוליטרים של הפתרון הוויראלי בסרט הפרפין.
בצע הליך זה תחת הסטריאוסקופ, צפה בירידה נעלמת, וודא שלא שאפת אוויר. ודא שהמזרק מולאה כראוי. בדוק את מערכת הפליטה על ידי נסיעה במורד הבוכנה כדי לבדוק להוציא טיפה קטנה של נוזל.
לאחר מכן, הכנס את המחט לתוך המוח לעומק שנבחר. לחץ על כפתור הריצה להזרקה. לאחר מכן, לאט למשוך את המחט מעל שלוש עד חמש דקות.
מיד לשטוף את המחט במים מזוקקים נקיים על ידי מילוי ריקון זה כמה פעמים על מנת למנוע סתימת. לאחר מכן, הסר את החיה מהמסגרת הסטריאוטוקסית. לתפור את העור ולעשות שלושה או ארבעה תפרים קשור עם 2-1-1 קשרים כירורגיים סטנדרטיים.
כדי לחלץ את המוח, לעשות חתך על העור מן הצוואר לאף, ולאחר מכן לחתוך את החוליות האחרונות מהגולגולת עם מספריים. לסגת את העור לחתוך את הגולגולת לאורך קו האמצע מן caudal לכיוון rostral. בזהירות להסיר את העצםקודית ואת החלק caudal של העצם הקדמית.
לחלץ את המוח עם מרית מעוגל קטן על ידי החדרתו בין המוח לבין רצפת הגולגולת, קטע הנורה חוש הריח, עצב הראייה, עצב הגולגולת אחרים ואת המוח הקטן. בעדינות להטביע את המוח בתת פתרון חיתוך קר כקרח. לאחר מכן, מעבירים את המוח לנייר סינון ומייבשים בעדינות את משטח קליפת המוח.
הדבק את קליפת המוח למחזיק הדגימה של רטט כאשר הצד הקודלי פונה ללהב כדי לחתוך פרוסות מוח אופקיות. לאחר מכן, מלאו את תא החיתוך בתת פתרון חיתוך מחומצן קר כקרח כך שהמוח יהיה שקוע לחלוטין. חלק 300 פרוסות מיקרומטר עבה עם הרטט במהירות של 07 מילימטרים לשנייה משרעת מילימטר אחד.
בשלב זה, מומלץ לבדוק בקצרה את הביטוי Chronos-GFP בתלמוס באמצעות פנס פלואורסצנטי ומשקפי מסנן תואמים. כדי לבצע הקלטת מהדק תא שלם, העבר בעדינות פרוסת מוח המכילה את קומפלקס ההיפוקמפוס לתא ההקלטה. ברציפות לבלבל את תא ההקלטה עם 34 מעלות צלזיוס ACSF מבעבע עם קרבוגן ב 2-3 מיליליטר לדקה.
בדקו בקצרה את ביטוי הכרונוס-GFP במסופי אקסון באזור המעניין עם תאורת LED כחולה בהגדלה של פי 4. עבור למטרת טבילה של 63X והתאם את המוקד. בדוק אקסונים המבטאים כרונוס-GFP ובחר נוירון פירמידלי להקלטת טלאי.
לאחר מכן, למלא פיפטה עם אשלגן גלוקומט מבוסס פתרון פנימי. הר אותו במחזיק פיפטה על במת הראש. תתקן את התא בתצורת מלחצי מתח.
התקרבו לנוירון המזוהה ולחץ בעדינות על קצה הפיפטי על הקומה. הלחץ החיובי אמור לייצר גומה על משטח הממברנה. לאחר מכן, שחרר את הלחץ כדי ליצור חותם ג'יגה-אום.
לאחר האטום, הגדר את מתח ההחזקה למינוס 65 מילי-וולט. לשבור את הממברנה עם דופק חד של לחץ שלילי. רשום את התגובות של הנוירון כדי hyperpolarizing ו depolarizing השלבים הנוכחיים במצב מהדק זרם התא כולו.
שיא בתגובות פוסט-סינפטיות של מהדק זרם או מתח לגירוי שדה של 475 ננומטר LED של סיבים אדישים המבטאים כרונוס. לעורר עם רכבות של עשרה גירויים של שני אלפיות שנייה משך ב 20 הרץ. הפעילות של נוירונים טרום-חיים בשכבה שלוש בתגובה להיפר-קוטביות ודפולריזציה של השלבים הנוכחיים נרשמה בתצורת מהדק התיקון של התא כולו.
מגרה מסופי אקסון ADN המבטאים כרונוס-GFP עורר פוטנציאל סינקרטי מעורר בשכבה presubicular שלושה תאים עיקריים במצב מהדק הנוכחי. בהתאם לעוצמת האור, ה- EPSPs יכולים להגיע לסף פוטנציאל פעולה. תגובות פוסט סינפטיות נצפו גם במצב מהדק מתח, כמו זרמים פוסט סינפטיים מעוררים היו עורר.
מוצג כאן הוא נוירון פירמידלי שכבה שלוש מוקף אקסונים תלמיים המבטאים כרונוס-GFP בשכבות שטחיות presubicular עם כתם DAPI בתמונה עם מיקרוסקופ epifluorescence. והתמונה הזו צולמה בהגדלה גבוהה יותר עם מיקרוסקופ קונפוקל. החלקה זהירה של bregma לאורך הציר בביצוע ניסויים פיילוט עם מעקב פלואורסצנטי חיוניים כדי לשפר את הדיוק של הזריקה הסטריאוטוקסית.
הליך זה יכול לשמש גם כדי לחקור תחזיות התכנסות מאזורים שונים על ידי הזרקת בשתי סצנה גריג רגישה לשני אורכי גל שונים. ההתפתחות של טכניקה זו אפשרה ניתוח מעגלים אנטומיים ותפקודיים מדויקים בין אזורי מוח מרוחקים באופן ספציפי לסוג התא.
