הטיפול והשימוש בדגים שנוצרו לתוצאות נציג המתוארות בפרוטוקול זה נערך בהתאם מלא להנחיות שנקבעו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים בבית החולים לילדים בבוסטון, # פרוטוקול 14-05-2673R.

1. Rotifer תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכיבים בסיסיים של מערכת תרבות באמצעות כלי 100 L תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את כל הרכיבים להתקנת תרבות rotifer. התקנת תרבות rotifer מורכבת מכלי תרבות (CV) לגדול rotifers; כלי דומה כדי לשמור על rotifers feedout (כלי תרבות feedout, FCV); צנצנת בקיעה עגולה תחתית (Feed מאגר, FR) לאחסון של התערובת להאכיל אצות (AFM); אספקת אוויר (AS) ללאוורר את קורות החיים, וFCV FR; משאבת peristaltic עם טיימר מדידה (PMT) לשלוט משלוח של מזון אצות לקורות החיים וFCV; ומסנן חלקיקי חוט (FPF) שיושב בתוך קורות החיים. הערה: רשימה של ציוד ורכיבים מלא מסופקת ברשימת חומרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תְצוּרָה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות את קורות החיים וFCV על דוכן או שולחן, כך שהתרבויות יכולות להיות שנקטפו בקלות באמצעות ניקוז ההולם להמשך אוסףainer (איור 1). השתמש בצינורות אספקת האוויר גמישים להתחבר AS לאורכו של צינור קשיח בכל כלי תרבות. ודא שהצינור הוא מספיק זמן כדי לספק אוויר לתחתית קורות החיים או FCV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקו אוויר קטן-יכולת להתחבר AS לאורכו של צינור קשיח המשתרע עד לתחתית של FR המכיל את AFM. התקן שסתום לכל שורת אוויר להסדיר את זרימת אוויר. חבר את FR לPMT עם צינורות אספקת מזון, ומפעיל את הצינור מPMT לתוך חור שנקדח בצד של קורות החיים / FCV, בחלקו העליון. איור 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לִקְפּוֹץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את כלי התרבות עד 90% מההיקף הזמינים במי אוסמוזה ההפוך (RO). אם RO אינו זמין, להשתמש במים נקיים, dechlorinated עירוניים; עם זאת, הערכת סיכוני ביטחון ביולוגי צריכה להתבצע כדי לוודא ששום אורגניזמים שעלולים להיות פתוגניים נמצאים במי המקור. הערה: ניתוח כזה יכול להתבצעבכל מעבדת בדיקה מוסמכת מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מינון המים כלי התרבות במלח אקווריום להגיע מליחות של 15 גר &#39;/ ל&#39;. הגדר את זרימת האוויר לתוך הכלי, כך שהוא שומר על &quot;רתיחה מתגלגלת&quot;, ולאחר מכן להוסיף לאט כמות המדודה של מלח לכלי התרבות עד שהוא נמס לגמרי על ידי האוורור. המשך aerating מים ל&gt; 1 שעה כדי לוודא שהוא הוא מחומצן באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את התערובת להאכיל אצות. עד 3 ליטר נקי, dechlorinated מים מתוקים (0 ppm) להוסיף של NaHCO 3 100 גרם ושל מנטרל אמוניה (hydroxymethylsulfonate נתרן) 100 גרם. מגיב אחרון זה מספק את היתרון נוסף של נטרול כל כלור שיורי משאריות מים ברז או אקונומיקה מהחיטוי של ציוד התרבות. זה קריטי כדי להבטיח כי תרכובות אלה להמסה מלאה. ואז להוסיף 1 ליטר של תרכיז אצות (משקל יבש ביומסה ~ 15%). מוסיף את תערובת המזון לFR ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תרבות המתנע של 5-10,000,000 <eמ &#39;&gt; rotifers plicatilis Brachionus לקורות החיים המכילים מים מליחות סודה 15 גר&#39; / ל &#39;. אם rotifers כבר מקורר במהלך משלוח או אחסון, הם צריכים להיות בהדרגה (במהלך 30 דקות או יותר) התאקלמו לטמפרטורה של המים בכלי התרבות (25 - C ° 27). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל PMT ולהתחיל שאיבה להאכיל אצות לתוך כלי תרבות rotifer. באמצעות תכונת טיימר של PMT, להגדיר את קצב האספקה ​​של תערובת מזון לאצות כדי ש~ 1.6 מיליליטר של תערובת להאכיל אצות מועבר למיליון rotifers בתרבות, בכל יום. להפיץ את ההאכלות במנות קטנות במרווחי זמן קבועים במהלך תקופה של 24 שעות; תכוף יותר ההאכלות, טוב יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את שיעור המסירה של המשאבה ידנית על ידי סיבוב על PMT לתקופה קצובה (למשל, 1 דקות) ולאסוף את האצות שמשאבות בפרק זמן זה לגליל או כוס סיים. לדוגמא, אם במינוני PMT 5 מיליליטר של אצות בדקות 1, ולאחר מכן את שיעור המינון יהיה5 מיליליטר אצות / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את שיעור ההאכלה היומי הנדרש על ידי הכפלת מספר rotifers הנוכחי, במיליון, ב- 1.6 מיליליטר. לדוגמא, תרבות rotifer עם גודל אוכלוסייה של 100 מיליון rotifers תדרוש ~ 160 מיליליטר של מזון ליום (100 x 1.6 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את PMT למינון דרישת עדכונים היומי הכוללת במרווחים קבועים לאורך תקופה של 24 שעות. לדוגמא, אספקה ​​של כמות מזון יומית כוללת של 160 מיליליטר יכולה להיות מועברת במנות פעם אחת כל 3 שעות במשך 24 שעות באמצעות סט PMT עם שיעור משאבת מינון של 5 מיליליטר / דקה במשך 4 דקות, 8 פעמים ביום (5 מיליליטר / דקה x 4 דקות = 20 מיליליטר x 8 האכלות = 160 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לתרבות לגדול עד שהוא מייצר אוכלוסייה הנדרשת, בדרך כלל עבור 48-72 שעות, לפני הקציר. ב 24 שעות שלאחר להתחיל, להוסיף מסנני חלקיקי חוט לכלי התרבות ולהתחיל תחזוקה רגילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תַחזוּקָה הערה: התרבות פועלת באופן רציף ודורשת routinתחזוקת דואר שבאופן אידיאלי צריכה להתבצע באותו הזמן בכל יום, ברצף הבא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את FCV 90% מנפח זמין עם נקי, dechlorinated מים מתוקים, במינון עם מלחי אקווריום L / 10 גרם. ודא שהמים הוא גם מעורבים, וכי כל מלח מתמוסס באופן מלא. הגדר את זרימת האוויר לתוך הכלי, כך שהוא שומר על &quot;רתיחה מתגלגלת&quot;. מדוד את המליחות עם refractometer ולהבטיח שהמליחות היא 10 גר &#39;/ L. זה קריטי כדי לעמוד ביעד זה ושלא יעלה על זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא rotifers בקורות החיים: ודא שהתרבות היא מעורבת היטב, לאחר מכן לאסוף 3 דגימות של 2 - 3 מיליליטר כל אחד באמצעות פיפטה העברה או autopipettor, מחלקים שונים של התרבות. לשלב דגימות אלה בצינור או בקבוקון של גודל נוח (למשל, 10 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 - 2 מיליליטר של המדגם המשולב על צלחת פטרי, כדי שניתן דמיינה אותו תחת מיקרוסקופ לנתח. בדוק את האיכות של התרבות (שחייה התנהגות שלrotifers, נוכחות של ביצים מנותקות, פרוטוזואה זיהום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשתק את rotifers במדגם בשילוב שנותר על ידי הוספה של 50% תמיסת יוד Lugols 100 μl למדגם. בתוך שניות לאחר תוספת של Lugols, להתבונן rotifers להפסיק חייה. עכשיו, בקלות לספור את rotifers. הערה: אתנול, אקונומיקה מדוללת, או חומץ יכולה לשמש במקום של Lugols. חומץ (2 טיפות / 10 מיליליטר) יש את היתרונות של להיות לא מסוכן, לא לאבד את הכוח באחסון כפתרונות אקונומיקה ויוד יכול, ולא מה שהופך את חוזה rotifers, כך העטרה של cilia ו&quot; הרגל &quot;יישארו מורחבת ו בעלי חיים נראים טבעיים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהמדגם הוא גם מעורב (rotifers המשותק יישב במהירות), ואז לקחת במהירות subsample מיליליטר ~ 2 בpipet פלסטיק ולוותר 1 מיליליטר לשקופית לספור Sedgewick-Rafter (20 x 50 ריבועים 1 מ&quot;מ) (איור 2 ). באמצעות מיקרוסקופ לנתח או תרכובת, לספור את rotifers שלם ולאמספר otal של ביצים המצורפות לrotifers אלה (איור 2). ספירה כמה שיותר משטח השקופית כצורך לספור ~ 100 rotifers. לחשב את מספר rotifers לכל מיליליטר, ולהקליט את זה בגיליון אלקטרוני או יומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר ~ 30% מהיקף rotifers בקורות החיים: הסירו את אספקת האוויר ומסנן חוט, לפתוח לאט את השסתום בחלק התחתון של קורות החיים ולאפשר למים לזרום לאספן פלנקטון עם מסך רשת 53 מיקרומטר. לאסוף את המים זורמים החוצה של החלק התחתון של האספן לאחר הסינון לדלי או ניקוז. השתמש בעדין לזרימה מתונה כדי למנוע נזק לrotifers. אל תאפשר rotifers לייבוש על המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסיבות עקביות, רצוי להקים FCV עם מספר סטנדרטי של rotifers בכל יום. לכן, בהתבסס על הצפיפות הידועה rotifer קורות חיים וקציר הנפח, להתאים כולל FCV הנפח להשיג צפיפות סופית עולה בקנה אחד (למשל., 1500 rotifers מיליליטר /). הוסף את רוטי נקטףfers לFCV: בעדינות להעביר את rotifers מהמסך הגבייה באמצעות בקבוק לשטוף מלאים במים נקיים מלח (10 - L / 15 גר &#39;). הפוך את המסך מעל FCV ולשטוף את rotifers לFCV עם זרם עדין של מים מלוחים. התחל PMT כדי לספק מזון (~ 1.57 מיליליטר למיליון rotifers ליום) לFCV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשפשף את כל החלק הפנימי של קורות החיים עם, מברשת נקייה רכה ניילון או כרית קרצוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תערובת חדשה של מים / L 15 גרם על ידי הוספת הכמות המתאימה של מלח לכמות מדודה של מי RO נקיים בדלי 5 ליטר להחליף את נפח מים איבד למסוק. מוסיף את המלח למים בדלי ומערבבים נמרצות עד שהוא נמס לגמרי, ולאחר מכן להוסיף לקורות החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתרסיס בלחץ גבוה בכיור, לשטוף את מסנן החוט עד שהוא נקי מפסולת, ולאחר מכן להחזיר אותו לקורות החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם שיעורי הזנה של אצות נמסרו לקורות החיים על ידי שינוי משך הזמן של כל אירוע מינון, על פי הספירה היומית של rotifers מיליליטר /.השתמש בחישובים הניתנים בשלב 1.3.8, לעיל כדי לקבוע את הכמות המתאימה של מזון כדי להיות מועברת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 24 שעות מאוחר יותר, לחזור על התהליך. התחל על ידי קצירת rotifers שנותר בFCV (שלא היה זקוק ליום הקודם) באותו אופן כפי שתוארו לעיל (שלבים 1.4.2 - 1.4.10). לרכז אותם ב 2 ליטר של מים טריים, נקיים dechlorinated (מלח L / 5 ז). אלה יכולים להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס כפי שאספקת גיבוי, או נהגו להאכיל שלבים מאוחר יותר של דגים, מעבר למה שמתואר בפרוטוקול זה. הערה: פרוטוקול זה מאפשר עד 2 - 3 ימים של תחזוקה מופחתת תרבות (עם הזנה אוטומטית רגילה), כי rotifers בקורות החיים יכול לסבול מחדל של יבולים ללא השלכות חמורות. </li></ol></li></ol> 2. פוליקולטורה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עוברי דג הזברה מאירוע השרצה על ידי שפיכת עוברים הולידו דרך תה מסננת ולאחר מכן בעדינות שטיפה עם FIS סטריליהמים h (או כל מקור אחר שאינם מזוהם של פתרון מותנה כראוי; למשל, בינוני עובר, E3, וכו &#39;) מבקבוק לשטוף לתוך צלחות פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עובר ב25 - 28 מעלות צלזיוס בצלחות פטרי בצפיפות של 40 - 50 עובר לכל צלחת במשך 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתחיל את שלב פוליקולטורה ביום 5 לאחר הפריה, או כאשר יותר מ -90% מהזחלים שבקעו באופן פעיל בחייה בעמודת המים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הַרכָּבָה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 מיליליטר של תרבות rotifer ישירות מFCV לטנק משתלת 3.5 L; הכללה של מים תרבות rotifer מספקת הזנה של אצות ששומרת על הערך התזונתי של rotifers במהלך פוליקולטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשפוך את הזחלים מצלחת פטרי אחת לתוך טנק חדר הילדים. ודא שאין זחלים יישארו בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 מיליליטר של מים נקיים, ממוזגים דגים ממערכת הסירקולציה המחודשת או מקור מים ייעודי לטנק להגיע נפח סופי של 1 ליטר ושל אחרוןalinity של 5 גר &#39;/ ל&#39;. הערה: מליחות זה קריטי כי הישרדות זחלי דג הזברה תושפע לרעה אם המליחות היא&gt; 7 גרם / L והישרדות rotifer יושפע לרעה אם מליחות &lt;2 g / L. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב פוליקולטורה הערה: שלב פוליקולטורה צריך להימשך עד 4 ימים לאחר חיסון (כולל של 5 ימים, מתאים לימים 5-9 לאחר הפריה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב למכל פוליקולטורה לפחות פעם ביום בתקופה זו על מנת להבטיח שrotifers ודגים נמצאים וגדל. ודא שrotifers גלוי לאורך כל עמודת המים. ודא שfishs הם גם נראים בתוך עמודת המים, שחיה בין rotifers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל זרימת מים רגילה באמצעות הטנק. הנח מסך או לבלבל מעל נמל הניקוז כדי להבטיח זחלים שאינם סמוקים מהטנק. הערה: בסופו של שלב זה, הדגים יהיו גדולים מספיק כדי לצרוך פריטי טרף גדולים יותר כגון הארטמיהפריטי מזון Nauplii או מעובד בטווח הגודל של 75-125 מיקרומטר. הערה: דינמיקת אוכלוסיית rotifer בתוך טנק פוליקולטורה נציג נמדדה על ידי דגימה / ספירת rotifers מהמכל באותו אופן כפי שתואר בצעדים 1.4.2 - 1.4.5. זה נעשה פעם אחת בכל יום מההתחלה של שלב פוליקולטורה עד שהושלם. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ribas, L., Piferrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+(Danio+rerio)+as+a+model+organism,+with+emphasis+on+applications+for+finfish+aquaculture+research.">The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research.</a> Reviews in Aquaculture. 6, 209-240 (2014).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nature reviews. Genetics. 11, 710-722 (2010).</li><li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in genetics TIG. 29, 611-620 (2013).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+study+of+the+zebrafish+assay+as+an+alternative+method+to+screen+for+developmental+toxicity+and+embryotoxicity+using+a+training+set+of+27+compounds.">Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds.</a> Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).</li><li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+husbandry+of+zebrafish+(Danio+rerio):+A+review.">The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review.</a> Aquaculture. 269, 1-20 (2007).</li><li>Harper, C., Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Zebrafish (Laboratory Animal Pocket Reference). , (2010).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish, A Practical Approach. , (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (2007).</li><li>Carvalho, P., Arau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearing+zebrafish+(Danio+rerio)+larvae+without+live+food:+evaluation+of+a+commercial,+a+practical+and+a+purified+starter+diet+on+larval+performance.">Rearing zebrafish (Danio rerio) larvae without live food: evaluation of a commercial, a practical and a purified starter diet on larval performance.</a> Aquaculture Research. 37, 1107-1111 (2006).</li><li>Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+and+ecology+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 83 (1), 13-34 (2008).</li><li>Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+rearing+first-feeding+larval+zebrafish:+polyculture+with+Type+L+saltwater+rotifers+(Brachionus+plicatilis).">A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis).</a> Zebrafish. 7 (3), 289-295 (2010).</li><li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+zebrafish+husbandry+and+management.">Advances in zebrafish husbandry and management.</a> Methods in Cell Biology. 104, 429-451 (2011).</li><li>Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+saltwater+rotifers+(Brachionus+plicatilis)+for+rearing+larval+zebrafish.">Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish.</a> Zebrafish. 9, 140-146 (2012).</li><li>Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology and Culture of Channel Catfish. 34, 634-657 (2004).</li></ol>

EC הנרי מועסק על ידי ריד חקלאות ימית, Inc, חברה המספקת rotifers, תרכיזי אצות, ומצרכים אחרים לשווקי תחביבים החקלאות הימית ודגים.

יישום מוצלח של שיטת פוליקולטורה rotifer האכלה דג הזברה זחל מוקדם דורש פרוטוקולים יעילים לשתי משימות: ההקמה ותחזוקה של מערכת תרבות rotifer רציפה כדי להאכיל את הדגים, וculturing הראשון-האכלת זחלי דג הזברה יחד עם rotifers באותו הטנק. ההתקנה למערכת ...

דג הזברה (Danio rerio) היא בחיות מעבדה מראש יחסני מנוצלות במספר הולך וגדל של דיסציפלינות מדעיות, כולל אך לא מוגבל לגנטיקה התפתחותית, טוקסיקולוגיה, התנהגות, חקלאות ימית, ביולוגיה משובי, והמודלים של הפרעות אנושיות רבות 1 - 5. למרות שהמין הוא קל יחסית כדי לשמור על במעבדה, יש מספר אתגרי ניהול המזוהים עם תרבותם 6. הבולט ביותר הוא גידול זחל, במיוחד כאשר הדגים יתחילו ראשון להאכיל לאחר האינפלציה שלפוחית ​​גז 7. בתנאים רגילים, בשליטה, אירוע התפתחותי זה מתרחש ב ~ 5 ימים לאחר הפריה (DPF), עם 3 הבאים - 5 הימים של צמיחה להיות 7 קריטיים במיוחד. הקושי הטכני המרכזי בשלב זה הוא לענות כראוי את הדרישות התזונתיות של זחלי ההאכלה הראשונים - פריטי מזון חייבים להיות בגודל מתאים, digestible, אטרקטיבי, וזמין על בסיס כמעט רציף, ללא יצירת פסולת מוגזמת בטנקי culturing. מבחינה הסטורית זו הושגה בדרך כלל על ידי מתן כמויות קטנות של מזון רבות לדגים בטנקים, יחד עם 8,9 תחלופת מים שיגרתי. בעוד שיטות אלה הן במידה מסוימת מוצלחות, הם לא יעילים, דורשים תשומות עבודה גבוהות, ולחזור רק משתנה ושיעורים מוגבלים של צמיחה והישרדות 10. בטבע, זחלי דג הזברה ככל הנראה להאכיל בהווה זואופלנקטון קטן בשפע בעמודת המים 11. מסיבה זו, פרוטוקולי larviculture שלשלב הזנות חיות כגון הסנדלית, rotifers, והארטמיה הם בדרך כלל יעילים ביותר 7. בשנת 2010, בסט והמחברים הוכיחו שזה אפשרי לגדל דג הזברה זחל במי סטטי, מליחים יחד עם rotifers המים המלוחים במשך 5 הימים הראשונים של האכלת אקסוגני 12. גישה זו, הרותמת אתes הפרודוקטיביות הגבוהה הטבעית של תרבויות rotifer לספק טרף בשפע, ערך תזונתי גבוהה מבלי לזהם את המים, תשואות שיעורים גבוהים מאוד של צמיחת זחל והישרדות עם תשומת עבודה נמוכה 12,13. בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של מעבדות ברחבי העולם אימץ וריאציות של פרוטוקול זה, ורבים מהם עכשיו culturing rotifers באופן רציף לתמיכה במערכות משתלת 14. בשנים האחרונות, שיטות לשני rotifer / פוליקולטורה דג הזברה וייצור rotifer כבר מעודנת והשתפרו להיות יותר סטנדרטי וניתן להרחבה בקלות. מאמר זה מספק הוראות צעד-אחר-צעד ל1) ייצור rotifer רציף וחזק ו 2) הקמת rotifer / מערכת פוליקולטורה דג הזברה משמשת לתמיכה בצמיחה חזקה של דגים במשך 5 הימים הראשונים של האכלת אקסוגני.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Rotifer Culture Infrastructure&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 L Culture Vessel</td><td>Aquaneering</td><td>Custom</td><td>Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve</td></tr><tr><td>5 Gallon Culture Bucket Kit</td><td>Reed Mariculture</td><td>CCS Starter Kit</td><td>Small volume culture vessel for small facilities</td></tr><tr><td>Rigid Clear Tubing 1/2&quot; O.D., 36&amp;rdquo;</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>Rigid clear tubing for air delivery</td></tr><tr><td>Mesh tube</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>RT444X</td><td>Mesh tube support for floss filter</td></tr><tr><td>Rotifer Floss</td><td>Reed Mariculture</td><td>Rotifer floss 12&amp;rdquo; x 42&amp;rdquo;</td><td>Particulate waste trap</td></tr><tr><td>Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD</td><td>Grainger</td><td>38M003&amp;nbsp;</td><td>Metering pump with timer for dosing feed to rotifers</td></tr><tr><td>Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture)</td><td>Coral Vue</td><td>SKU: IC-LQD-DSR</td><td>Metering pump with timer for dosing feed to rotifers</td></tr><tr><td>Silicone Tubing&amp;nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td></td><td>Tubing for algae delivery to rotifer vessel</td></tr><tr><td>Rigid Clear Tubing &quot; O.D.,36&amp;rdquo;</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>Rigid clear tubing for air delivery to algae paste</td></tr><tr><td>Rigid Clear Tubing O.D., 36&amp;rdquo;</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>Rigid clear tubing for algae delivery</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Rotifers&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L</td><td>Reed Mariculture</td><td>Type L 5 million</td><td>Rotifer stock culture for system startup</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Rotifer Feed&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxymethylsulfonate</td><td>Reed Mariculture</td><td>ClorAm-X&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt; 1lb tub</td><td>Ammonia reducer for algae feed mix</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25533B</td><td>pH buffer for algae feed mix</td></tr><tr><td>Microalgae concentrate</td><td>Reed Mariculture</td><td>Rotigrow Plus&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt; 1 liter bag</td><td>Nutritionally optimized rotifer feed</td></tr><tr><td>RG Complete</td><td>Reed Mariculture</td><td>RG Complete 6 oz bottle</td><td>All in one microalgae based feed for small scale cultures</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Water Preparation&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Reef Crystals Reef Salt</td><td>That Fish Place</td><td>198210</td><td>Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Refractometer</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>SR6</td><td>measuring salinity</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Rotifer Culture Equipment&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plankton Collectors 12&quot; Dia, 53 microns</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>BBPC20</td><td>Mesh screen for collecting rotifers</td></tr><tr><td>Scrub Pads</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>SCR-58</td><td>Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels</td></tr><tr><td>Scrub Brush</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bucket</td><td>Grainger Supply&amp;nbsp;</td><td>43Y530</td><td>Graduated bucket for mixing culture water</td></tr><tr><td>Hatching Jar</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>J30</td><td>Storage of algae feed mix</td></tr><tr><td>Lugol&amp;rsquo;s Solution, Dilute</td><td>Fisher Scientific</td><td>S99481</td><td>Agent used to immobilize live rotifers for counting</td></tr><tr><td>Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid&amp;nbsp;</td><td>Pentair Aquatic Eco-Systems</td><td>M415</td><td>Counting rotifers</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Miscelleneous&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tea Strainer</td><td>Kitchenworks</td><td>971972</td><td>Used for collecting zebrafish embryos after spawning</td></tr></tbody></table>

the complete and updated "rotifer polyculture method" for rearing first feeding zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

מערכת תרבות rotifer רציפה המתוארת כאן היא דינמית, וזה נורמלי למספרי rotifer להשתנות במידה מועטת לאורך זמן אם יש וריאציות בשיעורי האכלה וקציר יומיים. האוכלוסייה של rotifers באחת התרבויות הפעילה במתקני החקלאות הימית בבית החולים לילדים בבוסטון, נשמר באופן מתואר...

Watch this Scientific Journal Video about The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish at JoVE.com

The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

&quot;פוליקולטורה שיטת Rotifer&quot; השלמה ומעודכנת לדג הזברה האכלת לתי-פוסקת הראשונה

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science.  One of the most demanding technical aspects of ...

the-complete-updated-rotifer-polyculture-method-for-rearing-first

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

15.4K Views.  Boston Children's Hospital. Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

Video: The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Genetics

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

תרבות, תרביות תאים תאים ראשי דג זברה

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

בסיטו הכלאה בזחלי זברה וצעירים במהלך פיתוח מסונפרוס

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to prenatal ethanol exposure. Due to the complex pathology of FASD, animal models have proven critical to our current understanding of ethanol-induced developmental defects. Zebrafish have proven to be a powerful model to examine ethanol-induced developmental defects due to the high degree of conservation of both genetics and development between zebrafish and humans. As a model system, zebrafish possess many attributes that make them ideal for developmental studies, including large numbers of externally fertilized embryos that are genetically tractable and translucent. This allows researchers to precisely control the timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts. One important genetic tool available in zebrafish is transgenesis. However, generating transgenic constructs and establishing transgenic lines can be complex and difficult. To address this issue, zebrafish researchers have established the transposon-based Tol2 transgenesis system. This modular system uses a multisite Gateway cloning approach for the quick assembly of complete Tol2 transposon-based transgenic constructs. Here, we describe the flexible Tol2 system toolbox and a protocol for generating transgenic constructs ready for zebrafish transgenesis and their use in ethanol studies.

This work describes a protocol for the modular Tol2 transgenesis system, a gateway-based cloning method to create and inject transgenic constructs into zebrafish embryos.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

אופטימיזציה של מודלים של דגי זברה GF: ייצור, תחזוקה ומחקרים מיקרוביאליים

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

מחבר זרקור: הקמת דגי זברה נטולי חיידקים למחקרי יחסי מיקרוביוטה-פונדקאי

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

ייצור, תחזוקה וזיהוי של מודלים של דגי זברה נטולי חיידקים מזחלים ועד שלבים צעירים

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and behavioural research. As a vertebrate, zebrafish share considerable genetic sequence similarity with humans and are being used as an animal model for various human disease conditions. The advantages of zebrafish in comparison to other common vertebrate models include high fecundity, low maintenance cost, transparent embryos, and rapid development. Due to the spur of interest in zebrafish research, the need to establish and maintain a productive zebrafish housing facility is also increasing. Although literature is available for the maintenance of a zebrafish laboratory, a concise video protocol is lacking. This video illustrates the protocol for regular housing, feeding, breeding and raising of zebrafish larvae. This process will help researchers to understand the natural behaviour and optimal conditions of zebrafish husbandry and hence troubleshoot experimental issues that originate from the fish husbandry conditions. This protocol will be of immense help to researchers planning to establish a zebrafish laboratory, and also to graduate students who are intending to use zebrafish as an animal model.

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

This protocol outlines regular maintenance and care to maintain optimal conditions for zebrafish husbandry. The video illustrates the protocol for system maintenance, regular housing, feeding, breeding, and raising of zebrafish larvae.

טיפול קבוע ותחזוקה של דג זברה (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) מעבדה: מבוא

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

Biology

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and pharmacological similarities to that of the mammals. GI intolerance during clinical testing of drug candidates is common and may pose a serious threat to human health. Testing for GI toxicity in preclinical mammalian models can be expensive in terms of time, test compound, and labor. The high-throughput method presented here may be used to predict GI safety issues. Compared to mammalian models, this method allows for more expedient assessment of test compound effects on GI transit while using low quantities of compound. In this method, larval zebrafish (7 days post fertilization) are fed food containing a fluorescent label. After feeding, each larval fish is placed into a well of a 96-conical-bottom-well plate and dosed with test compound (dissolved in water) or the vehicle. As gut transit occurs, fecal matter accumulates on the bottom of the wells, and the rate at which this happens is monitored by measuring fluorescence from the bottom of the well repeatedly over time using a plate spectrophotometer. The fluorescence from larvae in a given treatment group are averaged and these values are graphed along with standard error, for each measurement time, yielding a curve representing average transit of food over time. Effects on gut transit time are identified by comparing the area under the curve for each treatment group to that of the vehicle-treated group. This method detected changes in zebrafish GI transit time induced by drugs with known clinical GI effects; it can be employed to interrogate dozens of treatments for GI effects per day. As such, safer compounds can be quickly prioritized for mammalian testing, which expedites discovery and proffers 3Rs advancement.

The goal of this protocol is to measure the transit time of fluorescently labeled food through the gut of larval zebrafish in a high throughput fashion.

"פוליקולטורה שיטת Rotifer" השלמה ומעודכנת לדג הזברה האכלת לתי-פוסקת הראשונה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

תרבות, תרביות תאים תאים ראשי דג זברה

בסיטו הכלאה בזחלי זברה וצעירים במהלך פיתוח מסונפרוס

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

ייצור, תחזוקה וזיהוי של מודלים של דגי זברה נטולי חיידקים מזחלים ועד שלבים צעירים

ייצור, תחזוקה וזיהוי של מודלים של דגי זברה נטולי חיידקים מזחלים ועד שלבים צעירים

ייצור, תחזוקה וזיהוי של מודלים של דגי זברה נטולי חיידקים מזחלים ועד שלבים צעירים

טיפול קבוע ותחזוקה של דג זברה (

מדידת תפוקה גבוהה הבטן מעבר הזמן באמצעות זחל דג זברה