הטיפול והשימוש בדגים שנוצרו לתוצאות נציג המתוארות בפרוטוקול זה נערך בהתאם מלא להנחיות שנקבעו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים בבית החולים לילדים בבוסטון, # פרוטוקול 14-05-2673R.

1. Rotifer תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכיבים בסיסיים של מערכת תרבות באמצעות כלי 100 L תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את כל הרכיבים להתקנת תרבות rotifer. התקנת תרבות rotifer מורכבת מכלי תרבות (CV) לגדול rotifers; כלי דומה כדי לשמור על rotifers feedout (כלי תרבות feedout, FCV); צנצנת בקיעה עגולה תחתית (Feed מאגר, FR) לאחסון של התערובת להאכיל אצות (AFM); אספקת אוויר (AS) ללאוורר את קורות החיים, וFCV FR; משאבת peristaltic עם טיימר מדידה (PMT) לשלוט משלוח של מזון אצות לקורות החיים וFCV; ומסנן חלקיקי חוט (FPF) שיושב בתוך קורות החיים. הערה: רשימה של ציוד ורכיבים מלא מסופקת ברשימת חומרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תְצוּרָה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות את קורות החיים וFCV על דוכן או שולחן, כך שהתרבויות יכולות להיות שנקטפו בקלות באמצעות ניקוז ההולם להמשך אוסףainer (איור 1). השתמש בצינורות אספקת האוויר גמישים להתחבר AS לאורכו של צינור קשיח בכל כלי תרבות. ודא שהצינור הוא מספיק זמן כדי לספק אוויר לתחתית קורות החיים או FCV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקו אוויר קטן-יכולת להתחבר AS לאורכו של צינור קשיח המשתרע עד לתחתית של FR המכיל את AFM. התקן שסתום לכל שורת אוויר להסדיר את זרימת אוויר. חבר את FR לPMT עם צינורות אספקת מזון, ומפעיל את הצינור מPMT לתוך חור שנקדח בצד של קורות החיים / FCV, בחלקו העליון. איור 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לִקְפּוֹץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את כלי התרבות עד 90% מההיקף הזמינים במי אוסמוזה ההפוך (RO). אם RO אינו זמין, להשתמש במים נקיים, dechlorinated עירוניים; עם זאת, הערכת סיכוני ביטחון ביולוגי צריכה להתבצע כדי לוודא ששום אורגניזמים שעלולים להיות פתוגניים נמצאים במי המקור. הערה: ניתוח כזה יכול להתבצעבכל מעבדת בדיקה מוסמכת מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מינון המים כלי התרבות במלח אקווריום להגיע מליחות של 15 גר &#39;/ ל&#39;. הגדר את זרימת האוויר לתוך הכלי, כך שהוא שומר על &quot;רתיחה מתגלגלת&quot;, ולאחר מכן להוסיף לאט כמות המדודה של מלח לכלי התרבות עד שהוא נמס לגמרי על ידי האוורור. המשך aerating מים ל&gt; 1 שעה כדי לוודא שהוא הוא מחומצן באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את התערובת להאכיל אצות. עד 3 ליטר נקי, dechlorinated מים מתוקים (0 ppm) להוסיף של NaHCO 3 100 גרם ושל מנטרל אמוניה (hydroxymethylsulfonate נתרן) 100 גרם. מגיב אחרון זה מספק את היתרון נוסף של נטרול כל כלור שיורי משאריות מים ברז או אקונומיקה מהחיטוי של ציוד התרבות. זה קריטי כדי להבטיח כי תרכובות אלה להמסה מלאה. ואז להוסיף 1 ליטר של תרכיז אצות (משקל יבש ביומסה ~ 15%). מוסיף את תערובת המזון לFR ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תרבות המתנע של 5-10,000,000 <eמ &#39;&gt; rotifers plicatilis Brachionus לקורות החיים המכילים מים מליחות סודה 15 גר&#39; / ל &#39;. אם rotifers כבר מקורר במהלך משלוח או אחסון, הם צריכים להיות בהדרגה (במהלך 30 דקות או יותר) התאקלמו לטמפרטורה של המים בכלי התרבות (25 - C ° 27). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל PMT ולהתחיל שאיבה להאכיל אצות לתוך כלי תרבות rotifer. באמצעות תכונת טיימר של PMT, להגדיר את קצב האספקה ​​של תערובת מזון לאצות כדי ש~ 1.6 מיליליטר של תערובת להאכיל אצות מועבר למיליון rotifers בתרבות, בכל יום. להפיץ את ההאכלות במנות קטנות במרווחי זמן קבועים במהלך תקופה של 24 שעות; תכוף יותר ההאכלות, טוב יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את שיעור המסירה של המשאבה ידנית על ידי סיבוב על PMT לתקופה קצובה (למשל, 1 דקות) ולאסוף את האצות שמשאבות בפרק זמן זה לגליל או כוס סיים. לדוגמא, אם במינוני PMT 5 מיליליטר של אצות בדקות 1, ולאחר מכן את שיעור המינון יהיה5 מיליליטר אצות / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את שיעור ההאכלה היומי הנדרש על ידי הכפלת מספר rotifers הנוכחי, במיליון, ב- 1.6 מיליליטר. לדוגמא, תרבות rotifer עם גודל אוכלוסייה של 100 מיליון rotifers תדרוש ~ 160 מיליליטר של מזון ליום (100 x 1.6 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את PMT למינון דרישת עדכונים היומי הכוללת במרווחים קבועים לאורך תקופה של 24 שעות. לדוגמא, אספקה ​​של כמות מזון יומית כוללת של 160 מיליליטר יכולה להיות מועברת במנות פעם אחת כל 3 שעות במשך 24 שעות באמצעות סט PMT עם שיעור משאבת מינון של 5 מיליליטר / דקה במשך 4 דקות, 8 פעמים ביום (5 מיליליטר / דקה x 4 דקות = 20 מיליליטר x 8 האכלות = 160 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לתרבות לגדול עד שהוא מייצר אוכלוסייה הנדרשת, בדרך כלל עבור 48-72 שעות, לפני הקציר. ב 24 שעות שלאחר להתחיל, להוסיף מסנני חלקיקי חוט לכלי התרבות ולהתחיל תחזוקה רגילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תַחזוּקָה הערה: התרבות פועלת באופן רציף ודורשת routinתחזוקת דואר שבאופן אידיאלי צריכה להתבצע באותו הזמן בכל יום, ברצף הבא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את FCV 90% מנפח זמין עם נקי, dechlorinated מים מתוקים, במינון עם מלחי אקווריום L / 10 גרם. ודא שהמים הוא גם מעורבים, וכי כל מלח מתמוסס באופן מלא. הגדר את זרימת האוויר לתוך הכלי, כך שהוא שומר על &quot;רתיחה מתגלגלת&quot;. מדוד את המליחות עם refractometer ולהבטיח שהמליחות היא 10 גר &#39;/ L. זה קריטי כדי לעמוד ביעד זה ושלא יעלה על זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא rotifers בקורות החיים: ודא שהתרבות היא מעורבת היטב, לאחר מכן לאסוף 3 דגימות של 2 - 3 מיליליטר כל אחד באמצעות פיפטה העברה או autopipettor, מחלקים שונים של התרבות. לשלב דגימות אלה בצינור או בקבוקון של גודל נוח (למשל, 10 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 - 2 מיליליטר של המדגם המשולב על צלחת פטרי, כדי שניתן דמיינה אותו תחת מיקרוסקופ לנתח. בדוק את האיכות של התרבות (שחייה התנהגות שלrotifers, נוכחות של ביצים מנותקות, פרוטוזואה זיהום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשתק את rotifers במדגם בשילוב שנותר על ידי הוספה של 50% תמיסת יוד Lugols 100 μl למדגם. בתוך שניות לאחר תוספת של Lugols, להתבונן rotifers להפסיק חייה. עכשיו, בקלות לספור את rotifers. הערה: אתנול, אקונומיקה מדוללת, או חומץ יכולה לשמש במקום של Lugols. חומץ (2 טיפות / 10 מיליליטר) יש את היתרונות של להיות לא מסוכן, לא לאבד את הכוח באחסון כפתרונות אקונומיקה ויוד יכול, ולא מה שהופך את חוזה rotifers, כך העטרה של cilia ו&quot; הרגל &quot;יישארו מורחבת ו בעלי חיים נראים טבעיים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהמדגם הוא גם מעורב (rotifers המשותק יישב במהירות), ואז לקחת במהירות subsample מיליליטר ~ 2 בpipet פלסטיק ולוותר 1 מיליליטר לשקופית לספור Sedgewick-Rafter (20 x 50 ריבועים 1 מ&quot;מ) (איור 2 ). באמצעות מיקרוסקופ לנתח או תרכובת, לספור את rotifers שלם ולאמספר otal של ביצים המצורפות לrotifers אלה (איור 2). ספירה כמה שיותר משטח השקופית כצורך לספור ~ 100 rotifers. לחשב את מספר rotifers לכל מיליליטר, ולהקליט את זה בגיליון אלקטרוני או יומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר ~ 30% מהיקף rotifers בקורות החיים: הסירו את אספקת האוויר ומסנן חוט, לפתוח לאט את השסתום בחלק התחתון של קורות החיים ולאפשר למים לזרום לאספן פלנקטון עם מסך רשת 53 מיקרומטר. לאסוף את המים זורמים החוצה של החלק התחתון של האספן לאחר הסינון לדלי או ניקוז. השתמש בעדין לזרימה מתונה כדי למנוע נזק לrotifers. אל תאפשר rotifers לייבוש על המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסיבות עקביות, רצוי להקים FCV עם מספר סטנדרטי של rotifers בכל יום. לכן, בהתבסס על הצפיפות הידועה rotifer קורות חיים וקציר הנפח, להתאים כולל FCV הנפח להשיג צפיפות סופית עולה בקנה אחד (למשל., 1500 rotifers מיליליטר /). הוסף את רוטי נקטףfers לFCV: בעדינות להעביר את rotifers מהמסך הגבייה באמצעות בקבוק לשטוף מלאים במים נקיים מלח (10 - L / 15 גר &#39;). הפוך את המסך מעל FCV ולשטוף את rotifers לFCV עם זרם עדין של מים מלוחים. התחל PMT כדי לספק מזון (~ 1.57 מיליליטר למיליון rotifers ליום) לFCV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשפשף את כל החלק הפנימי של קורות החיים עם, מברשת נקייה רכה ניילון או כרית קרצוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תערובת חדשה של מים / L 15 גרם על ידי הוספת הכמות המתאימה של מלח לכמות מדודה של מי RO נקיים בדלי 5 ליטר להחליף את נפח מים איבד למסוק. מוסיף את המלח למים בדלי ומערבבים נמרצות עד שהוא נמס לגמרי, ולאחר מכן להוסיף לקורות החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתרסיס בלחץ גבוה בכיור, לשטוף את מסנן החוט עד שהוא נקי מפסולת, ולאחר מכן להחזיר אותו לקורות החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם שיעורי הזנה של אצות נמסרו לקורות החיים על ידי שינוי משך הזמן של כל אירוע מינון, על פי הספירה היומית של rotifers מיליליטר /.השתמש בחישובים הניתנים בשלב 1.3.8, לעיל כדי לקבוע את הכמות המתאימה של מזון כדי להיות מועברת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 24 שעות מאוחר יותר, לחזור על התהליך. התחל על ידי קצירת rotifers שנותר בFCV (שלא היה זקוק ליום הקודם) באותו אופן כפי שתוארו לעיל (שלבים 1.4.2 - 1.4.10). לרכז אותם ב 2 ליטר של מים טריים, נקיים dechlorinated (מלח L / 5 ז). אלה יכולים להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס כפי שאספקת גיבוי, או נהגו להאכיל שלבים מאוחר יותר של דגים, מעבר למה שמתואר בפרוטוקול זה. הערה: פרוטוקול זה מאפשר עד 2 - 3 ימים של תחזוקה מופחתת תרבות (עם הזנה אוטומטית רגילה), כי rotifers בקורות החיים יכול לסבול מחדל של יבולים ללא השלכות חמורות. </li></ol></li></ol> 2. פוליקולטורה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עוברי דג הזברה מאירוע השרצה על ידי שפיכת עוברים הולידו דרך תה מסננת ולאחר מכן בעדינות שטיפה עם FIS סטריליהמים h (או כל מקור אחר שאינם מזוהם של פתרון מותנה כראוי; למשל, בינוני עובר, E3, וכו &#39;) מבקבוק לשטוף לתוך צלחות פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עובר ב25 - 28 מעלות צלזיוס בצלחות פטרי בצפיפות של 40 - 50 עובר לכל צלחת במשך 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתחיל את שלב פוליקולטורה ביום 5 לאחר הפריה, או כאשר יותר מ -90% מהזחלים שבקעו באופן פעיל בחייה בעמודת המים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הַרכָּבָה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 מיליליטר של תרבות rotifer ישירות מFCV לטנק משתלת 3.5 L; הכללה של מים תרבות rotifer מספקת הזנה של אצות ששומרת על הערך התזונתי של rotifers במהלך פוליקולטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשפוך את הזחלים מצלחת פטרי אחת לתוך טנק חדר הילדים. ודא שאין זחלים יישארו בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 מיליליטר של מים נקיים, ממוזגים דגים ממערכת הסירקולציה המחודשת או מקור מים ייעודי לטנק להגיע נפח סופי של 1 ליטר ושל אחרוןalinity של 5 גר &#39;/ ל&#39;. הערה: מליחות זה קריטי כי הישרדות זחלי דג הזברה תושפע לרעה אם המליחות היא&gt; 7 גרם / L והישרדות rotifer יושפע לרעה אם מליחות &lt;2 g / L. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב פוליקולטורה הערה: שלב פוליקולטורה צריך להימשך עד 4 ימים לאחר חיסון (כולל של 5 ימים, מתאים לימים 5-9 לאחר הפריה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב למכל פוליקולטורה לפחות פעם ביום בתקופה זו על מנת להבטיח שrotifers ודגים נמצאים וגדל. ודא שrotifers גלוי לאורך כל עמודת המים. ודא שfishs הם גם נראים בתוך עמודת המים, שחיה בין rotifers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל זרימת מים רגילה באמצעות הטנק. הנח מסך או לבלבל מעל נמל הניקוז כדי להבטיח זחלים שאינם סמוקים מהטנק. הערה: בסופו של שלב זה, הדגים יהיו גדולים מספיק כדי לצרוך פריטי טרף גדולים יותר כגון הארטמיהפריטי מזון Nauplii או מעובד בטווח הגודל של 75-125 מיקרומטר. הערה: דינמיקת אוכלוסיית rotifer בתוך טנק פוליקולטורה נציג נמדדה על ידי דגימה / ספירת rotifers מהמכל באותו אופן כפי שתואר בצעדים 1.4.2 - 1.4.5. זה נעשה פעם אחת בכל יום מההתחלה של שלב פוליקולטורה עד שהושלם. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ribas, L., Piferrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+(Danio+rerio)+as+a+model+organism,+with+emphasis+on+applications+for+finfish+aquaculture+research.">The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research.</a> Reviews in Aquaculture. 6, 209-240 (2014).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nature reviews. Genetics. 11, 710-722 (2010).</li><li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in genetics TIG. 29, 611-620 (2013).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+study+of+the+zebrafish+assay+as+an+alternative+method+to+screen+for+developmental+toxicity+and+embryotoxicity+using+a+training+set+of+27+compounds.">Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds.</a> Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).</li><li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+husbandry+of+zebrafish+(Danio+rerio):+A+review.">The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review.</a> Aquaculture. 269, 1-20 (2007).</li><li>Harper, C., Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Zebrafish (Laboratory Animal Pocket Reference). , (2010).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish, A Practical Approach. , (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (2007).</li><li>Carvalho, P., Arau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearing+zebrafish+(Danio+rerio)+larvae+without+live+food:+evaluation+of+a+commercial,+a+practical+and+a+purified+starter+diet+on+larval+performance.">Rearing zebrafish (Danio rerio) larvae without live food: evaluation of a commercial, a practical and a purified starter diet on larval performance.</a> Aquaculture Research. 37, 1107-1111 (2006).</li><li>Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+and+ecology+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 83 (1), 13-34 (2008).</li><li>Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+rearing+first-feeding+larval+zebrafish:+polyculture+with+Type+L+saltwater+rotifers+(Brachionus+plicatilis).">A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis).</a> Zebrafish. 7 (3), 289-295 (2010).</li><li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+zebrafish+husbandry+and+management.">Advances in zebrafish husbandry and management.</a> Methods in Cell Biology. 104, 429-451 (2011).</li><li>Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+saltwater+rotifers+(Brachionus+plicatilis)+for+rearing+larval+zebrafish.">Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish.</a> Zebrafish. 9, 140-146 (2012).</li><li>Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology and Culture of Channel Catfish. 34, 634-657 (2004).</li></ol>

EC הנרי מועסק על ידי ריד חקלאות ימית, Inc, חברה המספקת rotifers, תרכיזי אצות, ומצרכים אחרים לשווקי תחביבים החקלאות הימית ודגים.

יישום מוצלח של שיטת פוליקולטורה rotifer האכלה דג הזברה זחל מוקדם דורש פרוטוקולים יעילים לשתי משימות: ההקמה ותחזוקה של מערכת תרבות rotifer רציפה כדי להאכיל את הדגים, וculturing הראשון-האכלת זחלי דג הזברה יחד עם rotifers באותו הטנק. ההתקנה למערכת ...

דג הזברה (Danio rerio) היא בחיות מעבדה מראש יחסני מנוצלות במספר הולך וגדל של דיסציפלינות מדעיות, כולל אך לא מוגבל לגנטיקה התפתחותית, טוקסיקולוגיה, התנהגות, חקלאות ימית, ביולוגיה משובי, והמודלים של הפרעות אנושיות רבות 1 - 5. למרות שהמין הוא קל יחסית כדי לשמור על במעבדה, יש מספר אתגרי ניהול המזוהים עם תרבותם 6. הבולט ביותר הוא גידול זחל, במיוחד כאשר הדגים יתחילו ראשון להאכיל לאחר האינפלציה שלפוחית ​​גז 7. בתנאים רגילים, בשליטה, אירוע התפתחותי זה מתרחש ב ~ 5 ימים לאחר הפריה (DPF), עם 3 הבאים - 5 הימים של צמיחה להיות 7 קריטיים במיוחד. הקושי הטכני המרכזי בשלב זה הוא לענות כראוי את הדרישות התזונתיות של זחלי ההאכלה הראשונים - פריטי מזון חייבים להיות בגודל מתאים, digestible, אטרקטיבי, וזמין על בסיס כמעט רציף, ללא יצירת פסולת מוגזמת בטנקי culturing. מבחינה הסטורית זו הושגה בדרך כלל על ידי מתן כמויות קטנות של מזון רבות לדגים בטנקים, יחד עם 8,9 תחלופת מים שיגרתי. בעוד שיטות אלה הן במידה מסוימת מוצלחות, הם לא יעילים, דורשים תשומות עבודה גבוהות, ולחזור רק משתנה ושיעורים מוגבלים של צמיחה והישרדות 10. בטבע, זחלי דג הזברה ככל הנראה להאכיל בהווה זואופלנקטון קטן בשפע בעמודת המים 11. מסיבה זו, פרוטוקולי larviculture שלשלב הזנות חיות כגון הסנדלית, rotifers, והארטמיה הם בדרך כלל יעילים ביותר 7. בשנת 2010, בסט והמחברים הוכיחו שזה אפשרי לגדל דג הזברה זחל במי סטטי, מליחים יחד עם rotifers המים המלוחים במשך 5 הימים הראשונים של האכלת אקסוגני 12. גישה זו, הרותמת אתes הפרודוקטיביות הגבוהה הטבעית של תרבויות rotifer לספק טרף בשפע, ערך תזונתי גבוהה מבלי לזהם את המים, תשואות שיעורים גבוהים מאוד של צמיחת זחל והישרדות עם תשומת עבודה נמוכה 12,13. בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של מעבדות ברחבי העולם אימץ וריאציות של פרוטוקול זה, ורבים מהם עכשיו culturing rotifers באופן רציף לתמיכה במערכות משתלת 14. בשנים האחרונות, שיטות לשני rotifer / פוליקולטורה דג הזברה וייצור rotifer כבר מעודנת והשתפרו להיות יותר סטנדרטי וניתן להרחבה בקלות. מאמר זה מספק הוראות צעד-אחר-צעד ל1) ייצור rotifer רציף וחזק ו 2) הקמת rotifer / מערכת פוליקולטורה דג הזברה משמשת לתמיכה בצמיחה חזקה של דגים במשך 5 הימים הראשונים של האכלת אקסוגני.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifer Culture Infrastructure</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">100 Liter Culture Vessel</td>
			<td style="width:135px;">Aquaneering</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td style="width:264px;">Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">5 Gallon Culture Bucket Kit</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">CCS Starter Kit</td>
			<td style="width:264px;">Small volume culture vessel for small facilities</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rigid Clear Tubing 1/2&#34; O.D., 36&#8221;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">16025</td>
			<td style="width:264px;">Rigid clear tubing for air delivery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Mesh tube</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">RT444X</td>
			<td style="width:264px;">Mesh tube support for floss filter</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rotifer Floss</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">Rotifer floss 12&#8221; x 42&#8221;</td>
			<td style="width:264px;">Particulate waste trap</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD</td>
			<td style="width:135px;">Grainger</td>
			<td style="width:119px;">38M003&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Metering pump with timer for dosing feed to rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/h (for smaller-scale culture)</td>
			<td style="width:135px;">Coral Vue</td>
			<td style="width:119px;">SKU: IC-LQD-DSR</td>
			<td style="width:264px;">Metering pump with timer for dosing feed to rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Silicone Tubing&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;">Tubing for algae delivery to rotifer vessel</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rigid Clear Tubing &#34; O.D.,36&#8221;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">16025</td>
			<td style="width:264px;">Rigid clear tubing for air delivery to algae paste</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rigid Clear Tubing O.D., 36&#8221;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">16025</td>
			<td style="width:264px;">Rigid clear tubing for algae delivery</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifers</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">Type L 5 million</td>
			<td style="width:264px;">Rotifer stock culture for system startup</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifer Feed</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:305px;">Sodium hydroxymethylsulfonate</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">ClorAm-X&#174; 1lb tub</td>
			<td style="width:264px;">Ammonia reducer for algae feed mix</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S25533B</td>
			<td style="width:264px;">pH buffer for algae feed mix</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:305px;">Microalgae concentrate</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">Rotigrow Plus&#174; 1 liter bag</td>
			<td style="width:264px;">Nutritionally optimized rotifer feed</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Water Preparation</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:305px;">&#160;Reef Crystals Reef Salt</td>
			<td style="width:135px;">That Fish Place</td>
			<td style="width:119px;">198210</td>
			<td style="width:264px;">Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Refractometer</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">SR6</td>
			<td style="width:264px;">measuring salinity</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifer Culture Equipment</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Plankton Collectors 12&#34; Dia, 53 microns</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">BBPC20</td>
			<td style="width:264px;">Mesh screen for collecting rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Scrub Pads</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">SCR-58</td>
			<td style="width:264px;">Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Scrub Brush</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Bucket</td>
			<td style="width:135px;">Grainger Supply&#160;</td>
			<td style="width:119px;">43Y530</td>
			<td style="width:264px;">Graduated bucket for mixing culture water</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Hatching Jar</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">J30</td>
			<td style="width:264px;">Storage of algae feed mix</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Lugol&#8217;s Solution, Dilute</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S99481</td>
			<td style="width:264px;">Agent used to immobilize live rotifers for counting</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Eco-Systems</td>
			<td style="width:119px;">M415</td>
			<td style="width:264px;">Counting rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Miscelleneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Tea Strainer</td>
			<td style="width:135px;">Kitchenworks</td>
			<td style="width:119px;">971972</td>
			<td style="width:264px;">Used for collecting zebrafish embryos after spawning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the complete and updated "rotifer polyculture method" for rearing first feeding zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

מערכת תרבות rotifer רציפה המתוארת כאן היא דינמית, וזה נורמלי למספרי rotifer להשתנות במידה מועטת לאורך זמן אם יש וריאציות בשיעורי האכלה וקציר יומיים. האוכלוסייה של rotifers באחת התרבויות הפעילה במתקני החקלאות הימית בבית החולים לילדים בבוסטון, נשמר באופן מתואר...

Watch this Scientific Journal Video about The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish at JoVE.com

The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

&quot;פוליקולטורה שיטת Rotifer&quot; השלמה ומעודכנת לדג הזברה האכלת לתי-פוסקת הראשונה

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science.  One of the most demanding technical aspects of ...

the-complete-updated-rotifer-polyculture-method-for-rearing-first

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

15.3K Views.  Boston Children's Hospital. Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

Video: The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

הדמיה חיה של אינטראקציות תא של מערכת חיסון המולדת וPreneoplastic שימוש מערכת ביטוי / כטב&quot;מ העין מתנהלת Gal4 בעור הזחל דג הזברה

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

גידול זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית</em&gt; בתנאי Axenic ו Gnotobiotic

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

התרמת התחדשות פוליפ שלמה מן Aboral Physa של שושנת ים הכוכבת<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM ו Microrheology בתא חלמון עובר דג זברה

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

שיטת In Vivo ללמוד העכבר דם Testis מכשול שלמות

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

במבחני חוץ גופית כדי להעריך את ההעברה הפלישה, התפשטות של שורות תאים מונצחים Trophoblast בטרימסטר הראשון אנושי

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...