עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות / המכון לאומי להפרעות ושבץ (NIH / NINDS) מעניק R01-NS074387, R01-NS057711 וR21-NS091555 לMGC נוירולוגיות; NIH / NINDS מעניק R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 וR21-NS084275 לPRL; מענקים מהלבבות השמחים של לאה, אוניברסיטת מרכז הסרטן המקיף מישיגן זכה לMGC וPRL; המחלקה לנוירוכירורגיה, אוניברסיטת מישיגן בית הספר לרפואה; מכון מישיגן לקליני ומחקר בריאות, נתמך על ידי מענק NIH 2UL1-TR000433; גרנט הדרכת ביולוגיה של אוניברסיטת מישיגן הסרטן נתמך על ידי NIH / T32-CA009676 המענק NCI (המכון הלאומי לסרטן); אוניברסיטת מישיגן ההדרכה במדעי המוח קליני והבסיסיים הנתמכות על ידי NIH / NINDS להעניק T32-NS007222; ואוניברסיטת מישיגן רפואית מדען תכנית אימונים נתמכה על ידי NIH / NIGMS (המכון הלאומי למדעי רפואה כלליים) להעניק T32-GM007863. המחבריםמחדש אסיר תודה על המנהיגות האקדמית ותמיכה שקיבלה מד&quot;ר קארין Muraszko והמחלקה לנוירוכירורגיה; למ &#39;Dahlgren, ד Tomford, וס Napolitan לתמיכה ניהולית מעולה; למ &#39;Dzaman לקבלת סיוע טכני יוצא מן הכלל; ופיל פ ג&#39;נקינס לתמיכה נדיבה כלפי רכישת Zeiss 3D מיקרוסקופ אלקטרוני סורק. אנחנו גם מכירים המעבדה Kuchroo בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד שממנו הגרסה שונה של האסטרטגיה בתיווך תקשורת צנטריפוגה הצפיפות לבידוד של תאי mononuclear מוח נמשכת.

<ol>
	<li>Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+molecular+understanding+of+glioblastoma.">Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma.</a> J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).</li><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBTRUS+statistical+report:+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2007-2011.">CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.</a> Neuro Oncol. 16, iv1-63 (2014).</li><li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels.">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523, 337-341 (2015).</li><li>Kennedy, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+macrophages+in+glioma:+friend+or+foe?.">Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe?.</a> J Oncol.. 2013, 486912 (2013).</li><li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2.">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).</li><li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/macrophages+promote+glioma+progression.">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59, 472-485 (2011).</li><li>Kmiecik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+CD3++and+CD8++tumor-infiltrating+immune+cells+correlate+with+prolonged+survival+in+glioblastoma+patients+despite+integrated+immunosuppressive+mechanisms+in+the+tumor+microenvironment+and+at+the+systemic+level.">Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level.</a> J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).</li><li>Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+infiltrate+differences+in+pilocytic+astrocytoma+and+glioblastoma:+evidence+of+distinct+immunological+microenvironments+that+reflect+tumor+biology.">Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology.</a> J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).</li><li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial/macrophage+expression+of+interleukin+10+in+human+glioblastomas.">Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas.</a> Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).</li><li>El Andaloussi, A., Lesniak, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increase+in+CD4+CD25+FOXP3++regulatory+T+cells+in+tumor-infiltrating+lymphocytes+of+human+glioblastoma+multiforme.">An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme.</a> Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).</li><li>Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., Anderson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+regulation+of+human+monocytic/microglial+activation.">Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation.</a> J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).</li><li>Curtin, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB1+mediates+endogenous+TLR2+activation+and+brain+tumor+regression.">HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression.</a> PLoS Med. 6, e10 (2009).</li><li>Curtin, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+recruits+plasmacytoid+dendritic+cells+to+the+brain.">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain.</a> J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).</li><li>Mineharu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+brain+tumor+microenvironment+enhances+the+efficacy+of+dendritic+cell+vaccination:+implications+for+clinical+trial+design.">Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design.</a> Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).</li><li>Larocque, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+overrides+brain+immune+privilege+and+facilitates+recognition+of+a+neo-antigen+without+causing+autoimmune+neuropathology.">Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).</li><li>Curtin, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treg+depletion+inhibits+efficacy+of+cancer+immunotherapy:+implications+for+clinical+trials.">Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials.</a> PLoS One. 3, e1983 (2008).</li><li>Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunostimulation+and+conditional+cytotoxic+gene+therapy+provide+long-term+survival+in+a+large+glioma+model.">Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model.</a> Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).</li><li>Dewey, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+brain+inflammation+and+persistent+herpes+simplex+virus+1+thymidine+kinase+expression+in+survivors+of+syngeneic+glioma+treated+by+adenovirus-mediated+gene+therapy:+implications+for+clinical+trials.">Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials.</a> Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).</li><li>Baker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+eradicate+galectin-1-deficient+glioma+in+the+absence+of+adaptive+immunity.">Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity.</a> Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).</li><li>Baker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+glioma+formation:+iterative+perivascular+glioma+growth+and+invasion+leads+to+tumor+progression,+VEGF-independent+vascularization,+and+resistance+to+antiangiogenic+therapy.">Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy.</a> Neoplasia. 16, 543-561 (2014).</li><li>Ormerod, M. G., Novo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow cytometry : a basic introduction. , (2008).</li><li>Stirling, D. P., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+inflammatory+response+after+murine+spinal+cord+injury+revealed+by+flow+cytometry.">Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry.</a> J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).</li><li>Hirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+and+phenotype+of+activated+microglia/macrophages+within+the+spinal+cord+of+the+hyperostotic+mouse+(twy/twy)+changes+in+response+to+chronic+progressive+spinal+cord+compression:+implications+for+human+cervical+compressive+myelopathy.">The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy.</a> PLoS One. 8, e64528 (2013).</li><li>Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+Ly-6G+on+myeloid+lineage+cells+in+mouse+bone+marrow.+RB6-8C5+mAb+to+granulocyte-differentiation+antigen+(Gr-1)+detects+members+of+the+Ly-6+family.">Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family.</a> J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).</li><li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA.">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Res. 69, 431-439 (2009).</li><li>Holland, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+activation+of+Ras+and+Akt+in+neural+progenitors+induces+glioblastoma+formation+in+mice.">Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice.</a> Nat Genet. 25, 55-57 (2000).</li><li>Lynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral-induced+high-grade+gliomas+in+rats:+the+effects+of+PDGFB,+HRAS-G12V,+AKT,+and+IDH1-R132H.">Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H.</a> Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).</li><li>de Vries, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+robust+transgenic+high-grade+glioma+mouse+models+for+therapy+intervention+studies.">Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies.</a> Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).</li><li>Uhrbom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ink4a-Arf+loss+cooperates+with+KRas+activation+in+astrocytes+and+neural+progenitors+to+generate+glioblastomas+of+various+morphologies+depending+on+activated+Akt.">Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt.</a> Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).</li><li>Marumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+mouse+glioma+model+using+lentiviral+vectors.">Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors.</a> Nat Med. 15, 110-116 (2009).</li><li>Assanah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+progenitors+in+adult+white+matter+are+driven+to+form+malignant+gliomas+by+platelet-derived+growth+factor-expressing+retroviruses.">Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses.</a> J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה ושחזור לניתוח הבידוד ותזרים cytometric של PBMCs שהסתנן למייקרו-סביבת גידול במוח העכבר המוקדם. השעיות תא גליומה נוצרות בריכוז שצוין על ידי בניסויים שengrafted stereotactically לסטריאטום של מוח העכבר. עכברים מורדמים אז בנקודות זמן קבועות מראש שצוינו על ידי עיצ?...

גליומות היא מחלקה של סרטן מוח neuroepithelial הנובע מגליה הפכה בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS). של כל גליומות, ארגון בריאות עולמי (WHO) גליומה IV כיתה, או גליובלסטומה (GBM), הוא נפוצה וקטלני ביותר 1. GBM הוא עקשן מאוד לטיפול הסטנדרטי של שוטף הכולל כריתת גידול ולאחריו קרינה בתוספת כימותרפיה במקביל ואדג&#39;ובנט בטקסול 2 במידה האפשר. סוגי הסרטן קטלניים אלה נושאים פרוגנוזה עגומה של רק 15-18 חודשים של הישרדות מרגע אבחון ראשוני עם רק 5% מהחולים ששרדו את המחלה לאחר 5 שנים 3. נוכחותו של מחסום דם המוח (BBB), חוסר בתא הצגת אנטיגן המקצועי (נגמ&quot;שים), וקיום בלתי מזוהה בעבר מבני הלימפה בתום לב בתוך המוח 4 הובילו לרעיון של GBM חיסוני כחסוי. עם זאת, מחקרים רבים עכשיו sho<html> w שסרטן המוח אלה אכן לעורר הגיוס של תאים חיסוניים היקפיים שהם בעיקר מיאלואידית במקור הכוללים מונוציטים, מקרופאגים, ותאי שמקורם מיאלואידית המדכאים (MDSCs) 5. GBM גם משפיע על הפעילות של מיקרוגליה מוח-התושב להפוך פרו-סרטני 6,7. תאי הלימפה כגון תאי CD8 + T 8 ותאים + רוצח טבעי CD56 9 נמצאים גם בתוך מייקרו-הסביבה של הגידול, אבל בהרבה פחות מספרים, למעשה חשבו להיות בשל תפקוד לדיכוי מערכת החיסון ביוזמת גורמים שמקורם בגליומה במקרופאגים גידול קשור ( שירות רפואי לנוער) 10. תאי CD4 + T נמצאים גם בGBM, אבל הרבה של אוכלוסייה זו מבטא גם CD25 וFoxP3, מקבלי של דיכוי המערכת החיסונית (T reg) רגולציה תאים T 11. המדינה מדכאות את מערכת החיסון הכוללת של GBM מגיע לשיאו בקידום בריחה החיסונית והתקדמות גידול 12. = &quot;Jove_content&quot;&gt; הבנה טובה יותר של המנגנונים של דיכוי חיסוני GBM היא קריטית לפיתוח אסטרטגיות טיפול חיסוניים יעילות שנועדו לעורר את המערכת החיסונית נגד הגידול. במהלך 15 השנים האחרונות במעבדה שלנו עבדה כדי להתגבר על המנגנונים של immunosuppresson גידול במוח על מנת לפתח immunotherapeutics אנטי GBM החדש היעיל 13-19. שיאו של עבודה זו הובילה כעת לניסוי קליני שנועד להעריך ציטוטוקסיות בשילוב וטיפולי חיסוני גירוי בחולים עם (מזהה ClinicalTrials.gov: NCT01811992) שאובחן לאחרונה GBM. העבודה האחרונה שלנו מראה כי מערכת העצבים המרכזית-1 תאי GBM GL26 העכבר והחולדה לחסום מעקב חיסוני תא NK אנטי-סרטני על ידי ייצור כמויות גדולות של קטיני β-מחייב galactoside galectin-1 (גל-1) 20. זה הודגם על ידי דיכוי הביטוי של גל-1 בתאי גליומה באמצעות מציאה גן בתיווך shRNA. במבחנה experimenTS הראה כי תאי גליומה גל-1-חסר התרבו בדרך כלל בתרבות, עדיין עבר דחייה מהירה מייד לאחר קליטתם תוך גולגולת לתוך C57BL / 6J או RAG1 syngeneic - / - עכברים, וכך לבסס את עצמאותה של טי או B- תאים בצורה זו של דחיית גידול. immunodepletion תא NK עם אנטי-asialo GM 1 אנטי-סרום או נוגדנים חד שבטיים NK1.1 הובילו לשיקום צמיחת גליומה גל-1-לקויה תוך גולגולת השלם, הקמת התפקיד של תאי NK בגל-1-לקוי דחיית גליומה. אנו מציגים כעת immunodepletion שתאי מיאלואידית Gr-1 + / CD11b + מספיק כדי למנוע דחיית גליומה גל-1-לקוי למרות נוכחותם של תאי NK, ובכך חושף את תפקיד עזר הכרחי לתאי מיאלואידית שבמסייעת לגל של תיווך NK תמוגה -1 הלקויה גידול (נתונים שלא פורסמו). תוצאה בלתי צפויה זה הובילה אותנו לפתח פרוטוקול מקיף לבידוד והניתוח של תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs) שלחדור מייקרו-סביבת גידול במוח מייד לאחר קליטתם תוך גולגולתי, כך שנוכל לאפיין טוב יותר את אירועי חדירה חיסוניים שלבסס דחיית גליומה גל-1-חסר. השיטה הוכיחה כאן על ידי שימוש בתאי גליומה GL26 עכבר שחלבון mCitrine constitutively המפורש ניאון, נקרא GL26-Cit, המאפשרים הדמיה תאים סרטניים ישירה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי 21. תאים אלה engrafted stereotactically לתוך המוח של עכברי C57BL / 6J syngeneic ומותרים לגדול במשך 24, 48, או 72 שעות לפני המתת חסד עכבר. אז PBMCs הסתננות-גליומה מבודדים וimmunolabeled באמצעות -CD45 אנטי, -Gr-1, -CD11b ו-NK1.1 נוגדנים פני תא יחד עם immunolabeling תאיים לgranzyme B (GzmB). השילוב הספציפי הזה של נוגדנים מאפשר זיהוי של Gr-1 + / CD11b + תאי מיאלואידית חדירת גידול וNK1.1 +, תאי NK, סוגי תאים יש לנו בeen מעורב בדחיית גידול גל-1-חסר. פרופיל החדירה החיסונית של גליומה GL26-Cit גל-1-חסר, המכונה כאן GL26-Cit-gal1i, לעומת אז לזה של גליומות להביע רמות נורמליות של בשם GL26-Cit-NT גל-1 המכילות אי מיקוד סיכת ראש shRNA שליטה. הפרוטוקול מתחיל בתיאור על איך תרבות תאי גליומה GL26-Cit במבחנה, ואחריו הסבר על איך נקלט orthotopically תאים אלה לסטריאטום של C57BL / 6J syngeneic. לאחר מכן הוא ממשיך למנות את השלבים כרוכים בבידוד וimmunolabeling של PBMCs הסתננות-גליומה לניתוח התזרים cytometric. הפרוטוקול מסתיים בהסבר של ניתוח נתונים סטנדרטי וייצוג גרפי. ההפגנה מגלה כי שני Gr-1 + / CD11b + תאי מיאלואידית ותאי NK NK1.1 + מעדיפים לצבור בתוך מייקרו-סביבת גידול במוח גל-1-לקוי בתוך 48שעות של השתלת גידול, תוצאה אשר מסייעת להסביר מדוע גידולים אלה במהירות לעבור תמוגה גידול המלאה engraftment הודעה גידול-כ 1 שבוע 20. השיטה היא להתאמה בקלות למספר עיצובים ניסיוניים שונים בvivo שבו נתונים זמניים על חדירת חיסון לתוך המוח נדרש. בניסויים בודדים יכולים לבצע את הפרוטוקול מקצירת המוח לזרום ניתוח cytometric של PBMCs הסתננות-גליומה בכ 4-6 שעות, תלוי במספר דגימות להיות מנותח. השיטה גם עשויה להיות משולבת עם ניסויים שמטרה לאפיין את הפרופיל של מחזורי PBMCs בעכברי נושאי גידול להשוואה עם אלה שלחדור למוח כל כך לזהות פנוטיפים דיכוי חיסוני הנגרמים במיוחד על ידי מייקרו-הסביבה של הגידול. יישום של שיטות וזה דומה צריך להקל הבנה טובה יותר של הגורמים מעורבים בסחר בתאים חיסוניים ההיקפיים למייקרו-סביבת גידול במוח.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modification of Eagles Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430-054</td>
			<td>with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25mM HEPES and phenol red&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144&#160;</td>
			<td>without calcium chloride or Magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Omega Scientific Inc.</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10,000U/ml Penicillin; 10,000&#956;g/ml Streptomycin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>200mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 sulfate&#160;</td>
			<td>Omega Scientific Inc.</td>
			<td>GN-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td>from Streptomyces alboniger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SV30030.01</td>
			<td>in DPBS with EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>0.1mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 0.9% NaCl injection, USP</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC: 0409-4888</td>
			<td>10ml vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6ml conical polypropylenemi microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride injection</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>NDC: 52483-6298</td>
			<td>5mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td>Fort Dodge</td>
			<td>NDC: 0409-2051</td>
			<td>100mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexmedetomidine hydrochloride injection</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>NDC: 54771-2805</td>
			<td>0.5mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride injection</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>NDC: 61311-481</td>
			<td>100mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen injection</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>NDC: 61106-8501</td>
			<td>50mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine hydrochloride injection</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>NDC: 12496-0757</td>
			<td>0.3mg/ml ampuls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml tuberculin syringes&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881501400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x &#189; (0.45mm x 13mm) syringe needles&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical clippers</td>
			<td>3M</td>
			<td>9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-iodine solution</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>82-217</td>
			<td>NDC: 52380-1905</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petrolatum ophthalmic ointment&#160;</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>NDC: 17033-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol prep pads</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8044</td>
			<td>non-woven, 4&#34; x 4&#34;, 4-ply&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7ml conical polypropylene microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse stereotactic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td>Philips Burton</td>
			<td>CS316W</td>
			<td>Coolspot II Variable Spotlight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved dissecting forceps</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>5431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri retractors&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>17000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless precision power drill</td>
			<td>Dremel&#160;</td>
			<td>1100-01</td>
			<td>Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engraving Cutter</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>105</td>
			<td>1/32&#34; or 0.8 mm bit diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>75</td>
			<td>Hamilton Microliter&#174; Syringes 700 series; 5&#956;l volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7762-06</td>
			<td>33G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures&#160;</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74950-296</td>
			<td>7.9mm diameter x 50mm length (5/16&#34; diameter x 2&#34; length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L glass screw-cap storage bottle</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1395</td>
			<td>Type 1, Class A borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium&#160;</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400</td>
			<td>1,000U/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole Parmer Instruments Group</td>
			<td>77200-60</td>
			<td>Master Flex Easy Load II console drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2)</td>
			<td>available from local vendor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A-type, large cylinder&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G x 1 &#189;&#34; aluminum hub blunt needles</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>8881202363</td>
			<td>0.9mm x 38.1mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane ice bucket</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-45</td>
			<td>Capacity: 0.152 oz. (4.5L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type I-S)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1639</td>
			<td>from Clostridium histolyticum&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS002007</td>
			<td>&#62;2,000 Kunitz units per mg dry weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>20157-3</td>
			<td>top I.D. 115mm, base I.D. 85mm, 203ml volume&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel single edged razor blades&#160;</td>
			<td>Garvey</td>
			<td>40475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone rongeurs</td>
			<td>FST</td>
			<td>16001-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>FST</td>
			<td>13014-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large dissection scissors</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small dissection scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end forceps</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>13250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7ml glass Dounce tissue grinder</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>KT885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll Density Centrifugation Media&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>12-104</td>
			<td>single use; sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70&#956;m sterile nylon mesh cell strainers&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136)</td>
			<td>eBiosciences&#160;</td>
			<td>17-5941-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: RTK4530) isotype control&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG2a, &#954; (clone: eBM2a) isotype control&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: eB149/10H5) isotype control&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: RTK4530) isotype control</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>515403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, &#954; (Clone: MOPC-21) isotype control&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-103</td>
			<td>conical bottom&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td>conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x75mm round-bottom polypropylene FACS tubes&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-956-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>650033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG603</td>
			<td>model: SterilGARD III Advance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells

המעבדה שלנו הוכיחה לאחרונה כי רוצח טבעי (NK) תאים מסוגלים לחסל GL26 עכבר מושתל orthotopically ועכברוש CNS-1 גליומות הממארת מייד לאחר קליטתם תוך גולגולתי אם תאי הסרטן ניתנים לקויים בביטוים של הקטינים galectin β-galactoside מחייב -1 (גל-1). עוד העבודה האחרונה החברה מראה כי אוכלוסייה של תאי מיאלואידית + / CD11b + Gr-1 היא קריטית להשפעה זו. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים שבאמצעותם תאי NK ומיאלואידית לשתף פעולה כדי להעניק דחיית גידול גל-1-חסר פיתחנו פרוטוקול מקיף לבידוד והניתוח של תאים שחדרו-גליומה ההיקפיים mononuclear הדם (PBMC). השיטה הוכיחה כאן על ידי השוואת חדירת PBMC למייקרו-הסביבה של הגידול של גל-1-להביע GL26 גליומות עם אלה שניתנו גל-1-לקוי באמצעות מציאה shRNA. הפרוטוקול מתחיל בתיאור של איך תרבות ולהכין לסה&quot;נ GL26LLS לחיסון לתוך מוח עכבר C57BL / 6J syngeneic. לאחר מכן הוא מסביר את השלבים כרוכים בניתוח cytometric בידוד וזרימה של PBMCs הסתננות-גליומה ממייקרו-סביבת גידול במוח מוקדם. השיטה ניתנת להתאמה למספר in vivo עיצובים הניסיוניים שבו נתונים זמניים על חדירת חיסון לתוך המוח נדרש. השיטה היא רגישה מאוד לשחזור, כפי שניתן לבודד מגידולים תוך-גולגולתי PBMCs הסתננות-גליומה בהקדם engraftment הודעה גידולי 24 שעות עם ספירת תאים דומה נצפתה מגידולי נקודת זמן המתאים בכל ניסויים בלתי תלויים. בניסויים בודדים יכולים לבצע את השיטה מקצירת המוח לזרום ניתוח cytometric של PBMCs הסתננות-גליומה בכ 4-6 שעות, תלוי במספר דגימות להיות מנותח. גם דגמי גליומה אלטרנטיביים ו / או נוגדני זיהוי תא ספציפי ניתן להשתמש בשיקול דעתם של experimentalists להעריך את החדירה של כמה immun האחרסוגי תאי דואר של עניין ללא צורך בשינויים בהליך הכולל.

אסטרטגית gating הבאה משמשת לניסוי טיפוסי: FSC-מול SSC-→ SSC-H לעומת SSC-W → FSC-H לעומת FSC-W → CD45 לעומת ספירת → Gr-1 לעומת CD11b → NK1.1 לעומת ספירה. גייטס מונח על Gr-1 תאי מיאלואידית + / CD11b + ותאי NK NK1.1 + מכן מרובדת מבוססים על ביטוי GzmB (איור 5 א). Backgating אלה תאים זוהו כתא...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells at JoVE.com

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

מוצג כאן היא שיטה פשוטה לניתוח cytometric הבידוד וזרימה של תאי דם היקפי mononuclear הסתננות-גליומה שמניב נתונים כמותיים זמן תלוי במעמד המספר והפעלת תאים חיסוניים הנכנסים למייקרו-סביבת גידול במוח מוקדם.

בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

isolation-flow-cytometric-analysis-glioma-infiltrating-peripheral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K Views.  University of Michigan.  מוצג כאן היא שיטה פשוטה לניתוח cytometric הבידוד וזרימה של תאי דם היקפי mononuclear הסתננות-גליומה שמניב נתונים כמותיים זמן תלוי במעמד המספר והפעלת תאים חיסוניים הנכנסים למייקרו-סביבת גידול במוח מוקדם. 

Video: Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

בידוד של תאים עכבר פריטוניאלית חלל

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. Innate immune cells, specifically mononuclear phagocytes, express overlapping cell surface markers, which makes identifying these populations a challenge. Multi-parameter flow cytometry allows for the simultaneous, quantitative analysis of multiple cell surface markers in order to differentiate monocytes, macrophages, microglia, and dendritic cells in mouse eyes. This protocol describes the enucleation of whole mouse eyes, ocular dissection, digestion into a single cell suspension, and staining of the single cell suspension for myeloid cell markers. Additionally, we explain the proper methods for determining voltages using single color controls and for delineating positive gates using fluorescence minus one controls. The major limitation of multi-parameter flow cytometry is the absence of tissue architecture. This limitation can be overcome by multi-parameter flow cytometry of individual ocular compartments or complimentary immunofluorescence staining. However, immunofluorescence is limited by its lack of quantitative analysis and reduced number of fluorophores on most microscopes. We describe the use of multi-parametric flow cytometry to provide highly quantitative analysis of mononuclear phagocytes in laser-induced choroidal neovascularization. Additionally, multi-parameter flow cytometry can be used for the identification of macrophage subsets, fate mapping, and cell sorting for transcriptomic or proteomic studies.

This protocol provides a method to digest whole eyes into a single cell suspension for the purpose of multi-parameter flow cytometric analysis in order to identify specific ocular mononuclear phagocytic populations, including monocytes, microglia, macrophages, and dendritic cells.

עיכול של עיני עכבר שלמות לניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת פרמטרים של פיגוציטים מונונוקאריים

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical testing, and cell-based therapies. In this study, a simple, novel protocol to isolate, activate, and expand T cells from PBMCs ex vivo is presented. This study utilizes functionalized buoyancy-activated cell sorting (BACS) technology to isolate and activate T cells. Briefly, the protocol involves the positive selection of CD3+ cells from leukopak-derived PBMCs, followed by a 48 h co-stimulation with pre-conjugated anti-CD28-bound streptavidin microbubbles (SAMBs) prior to transduction in 24-well plates. Functionalized microbubbles offer a unique opportunity to buoyantly activate cells, leading to proliferative phenotypes that allow for expansion with minimal exhaustion. This technique offers reduced exhaustion because the co-stimulatory microbubbles remain buoyant and return to the top of the culture medium, thus reducing the amount of time that the expanding cells are in contact with the co-stimulatory factors. The results indicate that the isolated and cultured T cells receive enough stimulation to activate and proliferate but not to an extent that leads to overactivation, which then leads to exhaustion, as demonstrated by the presence of excessive PD-1.

The objective of this study is to demonstrate the feasibility of flotation-based separation to isolate, activate, and expand primary human T cells.

בידוד, הפעלה והרחבה של תאי T מבוססי ציפה מדגימות תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים באמצעות מיקרו-בועות

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...

איסוף PBMC ואחסון Cryostorage לניתוח ביואנרגטיקה מיטוכונדריאלית

Cryopreservation and Bioenergetic Evaluation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells

The physiological functions of eukaryotic cells rely on energy mainly provided by mitochondria. Mitochondrial dysfunction is linked to metabolic diseases and aging. Oxidative phosphorylation plays a decisive role, as it is crucial for the maintenance of energetic homeostasis. PBMCs have been identified as a minimally invasive sample to measure mitochondrial function and have been shown to reflect disease conditions. However, measurement of mitochondrial bioenergetic function can be limited by several factors in human samples. Limitations are the amount of samples taken, sampling time, which is often spread over several days, and locations. Cryopreservation of the collected samples can ensure consistent collection and measurement of samples. Care should be taken to ensure that the parameters measured are comparable between cryopreserved and freshly prepared cells. Here, we describe methods for isolating and cryopreserving PBMCs from human blood samples to analyze the bioenergetic function of the mitochondria in these cells. PBMC cryopreserved according to the protocol described here show only minor differences in cell number and viability, adenosine triphosphate levels, and measured respiratory chain activity compared with freshly harvested cells. Only 8-24 mL of human blood is needed for the described preparations, making it possible to collect samples during clinical studies multicentrally and determine their bioenergetics on site.

מחבר זרקור: שימור פרמטרים ביואנרגטיים בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים לאחר שימור בהקפאה 

Isolated peripheral blood mononuclear cells can be used for the analysis of immune functions and disorders, metabolic diseases, or mitochondrial functions. In this work, we describe a standardized method for the preparation of PBMCs from whole blood and the subsequent cryopreservation. Cryopreservation makes this time and place independent.

שימור קריוגני והערכה ביואנרגטית של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי

The physiological functions of eukaryotic cells rely on energy mainly provided by mitochondria. Mitochondrial dysfunction is linked to metabolic diseases ...