Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health / Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NIH / NINDS) concede R01-NS074387, R01-R21 NS057711 e-NS091555 para MGC; NIH / NINDS concede R01-NS061107, R01-NS076991, R01 e R21-NS082311-NS084275 a PRL; subvenções de corações felizes de Leah, da Universidade de Michigan Comprehensive Cancer Center atribuído a MGC e PRL; o Departamento de Neurocirurgia da Universidade de Michigan School of Medicine; do Instituto Michigan de Pesquisa Clínica e da Saúde, financiado pelo NIH concessão 2UL1-TR000433; a bolsa de formação Biologia da Universidade de Michigan Cancer financiado pelo NIH / NCI (National Cancer Institute) concessão T32-CA009676; da Universidade de Michigan Treinamento em clínica e básica Neuroscience suportado pelo NIH / NINDS conceder T32-NS007222; e da Universidade de Programa de Formação Médica Cientista Michigan financiado pelo NIH / NIGMS (Instituto Nacional de Medicina Ciências Gerais) conceder T32-GM007863. Os autores de umre grato pela liderança acadêmica e apoio recebido do Dr. Karin Muraszko e do Departamento de Neurocirurgia; a M. Dahlgren, D. tomford, e S. Napolitan para apoio administrativo soberba; a M. Dzaman para a assistência técnica excelente; e Phil F. Jenkins para apoio generoso para a compra de um Microscópio Eletrônico de Varredura Zeiss 3D. Reconhecemos também o laboratório Kuchroo na Harvard Medical School a partir do qual uma versão modificada da estratégia mediada por meios centrifugação de densidade para isolamento de células mononucleares do cérebro foi desenhado.

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+activation+of+Ras+and+Akt+in+neural+progenitors+induces+glioblastoma+formation+in+mice.">Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice.</a> Nat Genet. 25, 55-57 (2000).</li><li>Lynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral-induced+high-grade+gliomas+in+rats:+the+effects+of+PDGFB,+HRAS-G12V,+AKT,+and+IDH1-R132H.">Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H.</a> Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).</li><li>de Vries, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+robust+transgenic+high-grade+glioma+mouse+models+for+therapy+intervention+studies.">Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies.</a> Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).</li><li>Uhrbom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ink4a-Arf+loss+cooperates+with+KRas+activation+in+astrocytes+and+neural+progenitors+to+generate+glioblastomas+of+various+morphologies+depending+on+activated+Akt.">Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt.</a> Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).</li><li>Marumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+mouse+glioma+model+using+lentiviral+vectors.">Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors.</a> Nat Med. 15, 110-116 (2009).</li><li>Assanah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+progenitors+in+adult+white+matter+are+driven+to+form+malignant+gliomas+by+platelet-derived+growth+factor-expressing+retroviruses.">Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses.</a> J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve um método robusto e reprodutível para o isolamento e análise de citometria de fluxo de PBMC que se infiltraram no rato precoce microambiente do tumor cerebral. As suspensões de células de glioma são gerados a uma concentração especificada pelo experimentalista que são enxertados estereotaxicamente no corpo estriado do cérebro do rato. Os ratos são então sacrificados a pontos de tempo pré-determinados especificados pelo desenho experimental e os seus cérebros são colhidas e transfor...

Os gliomas são uma classe de cancros cerebrais gliais que derivam de células gliais transformadas dentro do sistema nervoso central (SNC). De todos os gliomas, Organização Mundial da Saúde (OMS) glioma grau IV ou glioblastoma (GBM), é o mais comum e letal 1. GBM é altamente refractário ao tratamento padrão-de-curso que consiste na ressecção do tumor na medida do possível, seguida por radiação, mais quimioterapia concomitante e adjuvante com temozolomida 2. Estes cancros mortais transportar um prognóstico sombrio de apenas 15-18 meses de sobrevivência a partir do momento do diagnóstico inicial com apenas 5% dos pacientes que sobrevivem a doença depois de 5 anos 3. A presença da barreira hematoencefálica (BHE), a falta de células apresentadoras de antigénios profissionais (APCs), e a existência de estruturas previamente não identificado linfáticos bona fide dentro do cérebro 4 conduziram à noção de GBM como imune privilegiada. No entanto, numerosos estudos agora shoW que estes cancros cerebrais, de facto geram o recrutamento de células imunitárias periféricas que são predominantemente de origem mielóide, que incluem monócitos, macrófagos e células supressoras derivadas de mielóides (MDSCs) 5. GBM também influencia a atividade de microglia cérebro-residente para se tornar pró-tumorigenic 6,7. As células linfóides, tais como as células T CD8 + 8 e células CD56 + assassinas naturais 9 também estão presentes dentro do microambiente do tumor, mas em muito menor número, um facto provavelmente devido à função imunossupressora instigada por factores derivadas de glioma em macrófagos associados a tumores ( TAM) 10. Células T CD4 + também estão presentes no GBM, mas grande parte dessa população também expressa CD25 e FoxP3, fabricantes de imunossupressora T reguladoras (reg T) as células 11. O estado imunossupressora total do GBM culmina com a promoção da fuga imunológica e progressão tumoral 12. <p class= &quot;jove_content&quot;&gt; Uma melhor compreensão dos mecanismos de GBM imunossupressão é crítico para o desenvolvimento de estratégias eficazes imunoterapêuticas concebidas para estimular o sistema imunitário contra o tumor. Ao longo dos últimos 15 anos, nosso laboratório tem trabalhado para superar os mecanismos do cérebro immunosuppresson tumor, a fim de desenvolver novas immunotherapeutics eficazes anti-GBM 13-19. O culminar deste trabalho tem levado a um ensaio clínico destinado a avaliar um citotóxico combinada e terapêutica imuno-estimulante para os pacientes com diagnóstico recente de GBM (ClinicalTrials.gov Identificador: NCT01811992). O nosso trabalho mais recente mostra que o GL26 de ratinho e rato de CNS-1 células GBM bloquear antitumoral vigilância imunitária das células NK através da produção de grandes quantidades de a lectina de ligação a β-galactósido galectina-1 (Gal-1) 20. Isto foi demonstrado através da supressão da expressão de Gal-1 em células de glioma de knockdown utilizando shRNA gene mediada. In vitro experiments mostraram que as células de glioma Gal-1 deficiente proliferaram normalmente na cultura, no entanto, sofreu rejeição rápida logo após o enxerto intracraniana em singï¿½ico C57BL / 6J ou RAG1 - / - ratos, estabelecendo assim a independência do T ou células B sobre esta forma de rejeição de tumor. Imunodepleção de células NK com anticorpos anti-asialo GM-1 anti soro ou anticorpos monoclonais NK1.1 conduziram à recuperação completa do crescimento de glioma Gal-1-deficiente intracraniana, estabelecendo o papel das células NK em Gal-1-deficiente rejeição glioma. Mostramos agora que imunodepleção de células mielóides Gr-1 + / CD11b + é suficiente para impedir que o glioma rejeição Gal-1-deficiente apesar da presença de células NK, revelando assim um papel auxiliar indispensável para células mielóides no favorecimento de Gal NK mediada lise tumoral -1 com deficiência (dados não publicados). Este resultado inesperado nos levou a desenvolver um protocolo abrangente para o isolamento e análise de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), queinfiltrar no microambiente do tumor cerebral logo após o enxerto intracraniana para que possamos melhor caracterizar os eventos de infiltração do sistema imunológico que predicado glioma rejeição gal-1-deficiente. O método é demonstrado aqui, usando células de glioma do rato GL26 que a proteína fluorescente mCitrine constitutivamente expresso, chamado GL26-Cit, que permitem a visualização de células tumorais direta por microscopia de fluorescência 21. Estas células são enxertados estereotacticamente no cérebro de singeneicos C57BL / 6J e são deixadas a crescer durante 24, 48, ou 72 horas antes do rato eutanásia. PBMC infiltrantes de glioma são então isolados e immunolabeled usando anti -CD45, -GR-1, -CD11b -NK1.1 e anticorpos de superfície da célula, juntamente com imunomarcação intracelular para a granzima B (GzmB). Esta combinação específica de anticorpos permite a identificação de Gr-1 + / + CD11b células mielóides infiltrantes tumorais e NK1.1 +, células NK, os tipos de células que temos been implicados na rejeição de tumor Gal-1-deficiente. O perfil imunológico infiltração de Gal-1-deficiente GL26-Cit glioma, referido aqui como GL26-Cit-gal1i, é então comparada com a de gliomas que expressam níveis normais de Gal-1 chamado GL26-Cit-NT que contêm uma não- segmentação controle hairpin shRNA. O protocolo começa com uma descrição de como a cultura de células de glioma GL26-Cit in vitro, que é seguido por uma explicação sobre como ortotopicamente enxertar essas células para o corpo estriado de singï¿½icos camundongos C57BL / 6J. Em seguida, prossegue para enumerar as etapas envolvidas no isolamento e imunomarcação de PBMCs infiltrantes de glioma para análise de citometria de fluxo. O protocolo termina com uma explicação de análise de dados padrão e representação gráfica. A demonstração revela que tanto a Gr-1 + / + CD11b células mielóides e células NK NK1.1 + preferencialmente se acumular dentro do microambiente do tumor cerebral Gal-1-deficiente dentro 48hr de implantação do tumor, um resultado que ajuda a explicar por que esses tumores rapidamente sofrer lise tumoral completa aproximadamente 1 semana enxerto pós-tumoral 20. O método é facilmente adaptável a um número de diferentes modelos experimentais in vivo em que os dados temporais de infiltração imune no cérebro é necessária. Uma única experimentalista podem executar o protocolo de colheita cérebro para análise citométrica de fluxo de PBMCs infiltrantes de glioma em cerca de 4-6 horas, dependendo do número de amostras a serem analisadas. O método pode também ser combinado com experiências destinadas para caracterizar o perfil de PBMCs em circulação em ratinhos portadores de tumor em comparação com aqueles que se infiltrar no cérebro, de forma a identificar os fenótipos imunossupressão especificamente induzidas pelo microambiente do tumor. Aplicação desta e de semelhantes métodos deverá facilitar uma melhor compreensão dos fatores envolvidos no tráfico de células imunes periféricas no microambiente do tumor cerebral.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modification of Eagles Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430-054</td>
			<td>with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25mM HEPES and phenol red&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144&#160;</td>
			<td>without calcium chloride or Magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Omega Scientific Inc.</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10,000U/ml Penicillin; 10,000&#956;g/ml Streptomycin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>200mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 sulfate&#160;</td>
			<td>Omega Scientific Inc.</td>
			<td>GN-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td>from Streptomyces alboniger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SV30030.01</td>
			<td>in DPBS with EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>0.1mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 0.9% NaCl injection, USP</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC: 0409-4888</td>
			<td>10ml vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6ml conical polypropylenemi microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride injection</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>NDC: 52483-6298</td>
			<td>5mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td>Fort Dodge</td>
			<td>NDC: 0409-2051</td>
			<td>100mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexmedetomidine hydrochloride injection</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>NDC: 54771-2805</td>
			<td>0.5mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride injection</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>NDC: 61311-481</td>
			<td>100mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen injection</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>NDC: 61106-8501</td>
			<td>50mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine hydrochloride injection</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>NDC: 12496-0757</td>
			<td>0.3mg/ml ampuls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml tuberculin syringes&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881501400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x &#189; (0.45mm x 13mm) syringe needles&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical clippers</td>
			<td>3M</td>
			<td>9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-iodine solution</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>82-217</td>
			<td>NDC: 52380-1905</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petrolatum ophthalmic ointment&#160;</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>NDC: 17033-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol prep pads</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8044</td>
			<td>non-woven, 4&#34; x 4&#34;, 4-ply&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7ml conical polypropylene microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse stereotactic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td>Philips Burton</td>
			<td>CS316W</td>
			<td>Coolspot II Variable Spotlight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved dissecting forceps</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>5431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri retractors&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>17000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless precision power drill</td>
			<td>Dremel&#160;</td>
			<td>1100-01</td>
			<td>Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engraving Cutter</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>105</td>
			<td>1/32&#34; or 0.8 mm bit diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>75</td>
			<td>Hamilton Microliter&#174; Syringes 700 series; 5&#956;l volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7762-06</td>
			<td>33G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures&#160;</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74950-296</td>
			<td>7.9mm diameter x 50mm length (5/16&#34; diameter x 2&#34; length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L glass screw-cap storage bottle</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1395</td>
			<td>Type 1, Class A borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium&#160;</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400</td>
			<td>1,000U/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole Parmer Instruments Group</td>
			<td>77200-60</td>
			<td>Master Flex Easy Load II console drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2)</td>
			<td>available from local vendor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A-type, large cylinder&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G x 1 &#189;&#34; aluminum hub blunt needles</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>8881202363</td>
			<td>0.9mm x 38.1mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane ice bucket</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-45</td>
			<td>Capacity: 0.152 oz. (4.5L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type I-S)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1639</td>
			<td>from Clostridium histolyticum&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS002007</td>
			<td>&#62;2,000 Kunitz units per mg dry weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>20157-3</td>
			<td>top I.D. 115mm, base I.D. 85mm, 203ml volume&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel single edged razor blades&#160;</td>
			<td>Garvey</td>
			<td>40475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone rongeurs</td>
			<td>FST</td>
			<td>16001-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>FST</td>
			<td>13014-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large dissection scissors</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small dissection scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end forceps</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>13250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7ml glass Dounce tissue grinder</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>KT885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll Density Centrifugation Media&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>12-104</td>
			<td>single use; sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70&#956;m sterile nylon mesh cell strainers&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136)</td>
			<td>eBiosciences&#160;</td>
			<td>17-5941-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: RTK4530) isotype control&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG2a, &#954; (clone: eBM2a) isotype control&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: eB149/10H5) isotype control&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: RTK4530) isotype control</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>515403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, &#954; (Clone: MOPC-21) isotype control&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-103</td>
			<td>conical bottom&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td>conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x75mm round-bottom polypropylene FACS tubes&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-956-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>650033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG603</td>
			<td>model: SterilGARD III Advance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells

Nosso laboratório tem demonstrado recentemente que natural killer (NK) são capazes de erradicar GL26 rato ortotopicamente implantado e rato CNS-1 gliomas malignos logo após o enxerto intracraniana se as células cancerosas se tornam deficientes em sua expressão da galectina lectina β-galactoside de ligação -1 (Gal-1). Um trabalho mais recente mostra agora que uma população de células mielóides + / CD11b + GR-1 é essencial para este efeito. Para melhor compreender os mecanismos pelos quais NK e células mielóides cooperam para conferir rejeição tumoral Gal-1 deficiente em temos desenvolvido um protocolo detalhado para o isolamento e análise de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma (PBMC). O método é demonstrado aqui pela comparação PBMC infiltração no microambiente tumoral de Gal-1 que expressam GL26 gliomas com aqueles preparados Gal-1-deficiente através shRNA knockdown. O protocolo começa com uma descrição de como a cultura e preparar GL26 cells para inoculação no singï¿½ico C57BL / 6J cérebro do rato. Em seguida, explica as etapas envolvidas no isolamento e análise de citometria de fluxo de PBMCs infiltrantes glioma do microambiente do tumor cerebral precoce. O método é adaptável a um número de modelos experimentais in vivo em que os dados temporais de infiltração imune no cérebro é necessária. O método é sensível e altamente reprodutível, como PBMCs infiltrantes glioma pode ser isolado a partir de tumores intracranianos, logo que 24 hr pós-enxerto de tumor com contagens de células semelhantes observadas em tumores de pontos de tempo ao longo combinado experiências independentes. Uma única experimentalista pode executar o método de colheita cérebro para análise citométrica de fluxo de PBMCs infiltrantes de glioma em cerca de 4-6 horas, dependendo do número de amostras a serem analisadas. Modelos de glioma alternativos e / ou de detecção de anticorpos específicos de células também podem ser utilizados à discrição dos experimentalistas para avaliar a infiltração de vários outros Immune tipos de células de interesse, sem a necessidade de alterações no procedimento geral.

A estratégia de gating seguinte é usada para uma experiência típica: FSC vs. SSC-A-A → SSC-H vs. SSC-W → FSC-H vs. FSC-W → CD45 vs. contagem → Gr-1 vs. CD11b → NK1.1 vs. contagem. Gates, colocado em Gr-1 + / + CD11b células mielóides e células NK NK1.1 +, em seguida, são estratificados com base na expressão GzmB (Figura 5A). Backgating células identificadas como células NK NK1.1 + e Gr-1 + / + CD11b células mielóide...

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Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Apresentado aqui é um método simples para o isolamento e análise de citometria de fluxo de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma que produz dados quantitativos tempo-dependente do número e estado de activação das células do sistema imunológico que entram no microambiente do tumor cerebral precoce.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

isolation-flow-cytometric-analysis-glioma-infiltrating-peripheral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K visualizações.  University of Michigan.  Apresentado aqui é um método simples para o isolamento e análise de citometria de fluxo de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma que produz dados quantitativos tempo-dependente do número e estado de activação das células do sistema imunológico que entram no microambiente do tumor cerebral precoce. 