Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la Santé / Institut national des troubles neurologiques et des maladies (NIH / NINDS) accorde R01-NS074387, R01-R21 et NS057711-NS091555 à MGC; NIH / NINDS accorde R01-NS061107, R01-NS076991, R01-R21 et NS082311-NS084275 à PRL; subventions de Happy Hearts de Léa, Université du Michigan Comprehensive Cancer Center attribué à MGC et PRL; du département de neurochirurgie de l&#39;Université du Michigan School of Medicine; l&#39;Institut du Michigan pour clinique et de recherche en santé, soutenu par NIH subvention 2UL1-TR000433; la Subvention de formation de biologie Université du Michigan Cancer soutenu par NIH / NCI (National Cancer Institute) subvention T32-CA009676; l&#39;Université du Michigan de formation en neurosciences cliniques et fondamentales soutenu par NIH / NINDS accorder T32-NS007222; et l&#39;Université de Programme de formation scientifique médicale Michigan soutenu par NIH / NIGMS (Institut national de médecine générale Sciences) accorder T32-GM007863. Les auteurs d&#39;unre reconnaissants pour le leadership universitaire et le soutien reçu du Dr Karin Muraszko et le Département de neurochirurgie; M. Dahlgren, D. Tomford, et S. napolitaine pour le soutien administratif superbe; M. Dzaman pour l&#39;assistance technique exceptionnelle; et Phil F. Jenkins pour le soutien généreux envers l&#39;achat d&#39;un microscope électronique à balayage Zeiss 3D. Nous reconnaissons également le laboratoire Kuchroo à la Harvard Medical School à partir de laquelle une version modifiée de la stratégie de médiation de médias centrifugation de densité pour l&#39;isolement de cellules mononucléaires du cerveau a été prélevé.

<ol>
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Les auteurs ont rien à révéler.

Ce protocole décrit un procédé robuste et reproductible pour l&#39;isolement et l&#39;analyse cytométrique en flux de cellules PBMC qui ont infiltré le micro-environnement de la tumeur du cerveau de la souris au début. Des suspensions de cellules de gliome sont générées à une concentration spécifiée par l&#39;expérimentateur qui sont greffées stéréotaxique dans le striatum du cerveau de la souris. Les souris sont ensuite euthanasiés à des points de temps prédéterminés spécifiés par le protocole ex...

Les gliomes sont une classe de cancers du cerveau résultant de la glie neuro-épithéliales transformées dans le système nerveux central (SNC). De tous les gliomes, Organisation mondiale de la Santé (OMS) de grade IV gliome, ou le glioblastome (GBM), est la plus fréquente et mortelle 1. GBM est hautement réfractaire au traitement standard-de-courant qui se compose de résection de la tumeur dans la mesure du possible, plus suivie d&#39;une radiothérapie chimiothérapie concomitante et adjuvante avec 2 témozolomide. Ces cancers mortels portent un pronostic sombre de seulement 15-18 mois de survie à partir du moment du diagnostic initial avec seulement 5% des patients survivent à la maladie après 5 ans 3. La présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE), le manque de cellules présentatrices d&#39;antigène professionnelles (APC), et l&#39;existence non identifiés auparavant des structures lymphatiques de bonne foi dans le cerveau 4 ont conduit à la notion de GBM comme immunitaire privilégié. Cependant, de nombreuses études sho maintenantw que ces cancers du cerveau engendrent en effet le recrutement de cellules immunitaires périphériques qui sont principalement à l&#39;origine myéloïde incluant les monocytes, les macrophages et les cellules myéloïdes suppressives (MDSC dérivés 5). GBM influe également sur ​​l&#39;activité de cerveau-résident microglie à devenir pro-tumorigènes 6,7. Les cellules lymphoïdes telles que les cellules T CD8 + 8 et cellules CD56 + tueuses naturelles 9 sont également présents dans le microenvironnement de la tumeur, mais en beaucoup moins grand nombre, un fait semble être due à la fonction immunosuppressive incité par des facteurs de gliome dérivés sur les macrophages associés aux tumeurs ( TAM) 10. Lymphocytes T CD4 + sont également présents dans GBM, mais une grande partie de cette population exprime également CD25 et FoxP3, les responsables de immunosuppresseur T régulatrices (T reg) cellules 11. L&#39;état immunosuppresseur globale de GBM culmine dans la promotion de l&#39;évasion immunologique et la progression de la tumeur 12. <p class= &quot;jove_content&quot;&gt; Une meilleure compréhension des mécanismes de la GBM immunosuppression est essentielle à l&#39;élaboration de stratégies immunothérapeutiques efficaces conçus pour stimuler le système immunitaire contre la tumeur. Au cours des 15 dernières années, notre laboratoire a travaillé à surmonter les mécanismes de immunosuppresson de tumeur au cerveau afin de développer de nouveaux produits immunothérapeutiques efficaces anti-GBM 13-19. Le point culminant de ce travail a conduit à un essai clinique visant à évaluer un cytotoxique combinée et thérapeutique immuno-stimulation pour les patients nouvellement diagnostiqués (identificateur ClinicalTrials.gov: NCT01811992) GBM. Notre travail le plus récent montre que GL26 de la souris et de rat SNC-1 des cellules de glioblastome bloquent anti-tumorale des cellules NK surveillance immunitaire en produisant de grandes quantités de la β-galactoside lectine liant la galectine-1 (gal-1) 20. Cela a été démontré par la suppression de l&#39;expression de gal-1 dans les cellules de gliome utilisant knockdown de gènes shRNA médiation. In vitro expérits ont montré que les cellules de gliome Gal-1 déficient prolifèrent normalement dans la culture, mais ont subi un rejet rapide, peu après la prise de greffe intracrânienne dans des souris C57BL / 6J ou RAG1 souris - / -, établissant ainsi l&#39;indépendance de T ou cellules B sur cette forme de rejet de la tumeur. NK immunodéplétion de la cellule avec un anticorps anti-asialo GM1 anti-sérum ou des anticorps NK1.1 monoclonaux dirigés à la restauration complète de l&#39;évolution de gliome gal-1-deficient intracrânienne, en établissant le rôle des cellules NK en gal-1-deficient rejet de gliome. Nous montrons maintenant que immunodéplétion des cellules myéloïdes Gr-1 + / CD11b + est suffisante pour prévenir le rejet d&#39;un gliome gal-1 déficiente en dépit de la présence de cellules NK, révélant ainsi un rôle d&#39;auxiliaire indispensable pour les cellules myéloïdes dans l&#39;aide apportée à l&#39;gal NK médiée lyse tumorale -1 déficiente (données non publiées). Ce résultat inattendu nous a conduit à développer un protocole détaillé pour l&#39;isolement et l&#39;analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) quiinfiltrer le microenvironnement d&#39;une tumeur cérébrale, peu après la prise de greffe intracrânienne afin que nous puissions mieux caractériser les événements d&#39;infiltration immunitaires qui prédicat rejet de gliome gal-1 déficient. La méthode est démontré ici en utilisant des cellules de gliome de GL26 de souris qui expriment constitutivement mCitrine protéine fluorescente, appelée GL26-Cit, qui autorisent la visualisation de la cellule tumorale directe par microscopie à fluorescence 21. Ces cellules sont greffées stéréotactique dans le cerveau de souris C57BL / 6J et syngéniques sont laissées se développer pendant 24, 48 ou 72 heures avant l&#39;euthanasie des souris. PBMC de gliome infiltrant sont ensuite isolés et immunomarquées utilisant des anticorps anti -CD45, -GR-1, et -CD11b -NK1.1 anticorps de surface cellulaire conjointement avec immunomarquage intracellulaire de granzyme B (GZMB). Cette combinaison permet d&#39;anticorps spécifique pour l&#39;identification des Gr-1 + / + CD11b cellules myéloïdes infiltrant les tumeurs et NK1.1 +, les cellules NK, les types de cellules, nous avons been impliqué dans le rejet de la tumeur gal-1 déficient. Le profil d&#39;infiltration immunitaire de Gal-1-deficient GL26-Cit gliome, appelé ici GL26-Cit-gal1i, est ensuite comparée à celle des gliomes exprimant des taux normaux de Gal-1 appelé GL26-Cit-NT qui contiennent une non- ciblant le contrôle shRNA épingle à cheveux. Le protocole commence par une description sur la façon de la culture des cellules GL26-Cit gliome in vitro, qui est suivie d&#39;une explication sur la façon de greffer orthotopiquement ces cellules dans le striatum de souris C57BL / 6J syngéniques. Il procède ensuite à énumérer les étapes impliquées dans l&#39;isolement et l&#39;immunomarquage des PBMC de gliome infiltrant pour l&#39;analyse par cytométrie en flux. Le protocole se termine par une explication de l&#39;analyse de données standard et de représentation graphique. La démonstration révèle que les deux Gr-1 + / + CD11b cellules myéloïdes et les cellules NK NK1.1 + accumuler de préférence dans le microenvironnement tumeur cérébrale gal-1 déficient dans les 48h d&#39;implantation de la tumeur, un résultat qui contribue à expliquer pourquoi ces tumeurs subissent rapidement lyse tumorale complète d&#39;environ 1 semaine de prise de greffe tumorale post-20. Le procédé est facilement adaptable à un certain nombre de différents modèles expérimentaux in vivo dans lequel des données temporelles sur infiltration immunitaire dans le cerveau est nécessaire. Un seul expérimentateur peut effectuer le protocole de récolte cerveau analyse cytométrique de flux de PBMC de gliome infiltrant en environ 4-6 heures en fonction du nombre d&#39;échantillons à analyser. Le procédé peut également être combiné avec des expériences visant à caractériser le profil de circulation des PBMC chez les souris porteuses de tumeur pour la comparaison avec ceux qui infiltrent le cerveau afin d&#39;identifier les phénotypes d&#39;immunosuppression spécifiquement induites par le micro-environnement de la tumeur. Application de la présente et des méthodes similaires devrait faciliter une meilleure compréhension des facteurs impliqués dans le trafic de cellules immunitaires périphériques dans le microenvironnement de la tumeur du cerveau.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modification of Eagles Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430-054</td>
			<td>with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25mM HEPES and phenol red&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144&#160;</td>
			<td>without calcium chloride or Magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Omega Scientific Inc.</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10,000U/ml Penicillin; 10,000&#956;g/ml Streptomycin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>200mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 sulfate&#160;</td>
			<td>Omega Scientific Inc.</td>
			<td>GN-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td>from Streptomyces alboniger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SV30030.01</td>
			<td>in DPBS with EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>0.1mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 0.9% NaCl injection, USP</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC: 0409-4888</td>
			<td>10ml vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6ml conical polypropylenemi microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride injection</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>NDC: 52483-6298</td>
			<td>5mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td>Fort Dodge</td>
			<td>NDC: 0409-2051</td>
			<td>100mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexmedetomidine hydrochloride injection</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>NDC: 54771-2805</td>
			<td>0.5mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride injection</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>NDC: 61311-481</td>
			<td>100mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen injection</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>NDC: 61106-8501</td>
			<td>50mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine hydrochloride injection</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>NDC: 12496-0757</td>
			<td>0.3mg/ml ampuls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml tuberculin syringes&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881501400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x &#189; (0.45mm x 13mm) syringe needles&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical clippers</td>
			<td>3M</td>
			<td>9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-iodine solution</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>82-217</td>
			<td>NDC: 52380-1905</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petrolatum ophthalmic ointment&#160;</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>NDC: 17033-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol prep pads</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8044</td>
			<td>non-woven, 4&#34; x 4&#34;, 4-ply&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7ml conical polypropylene microtubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse stereotactic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lamp</td>
			<td>Philips Burton</td>
			<td>CS316W</td>
			<td>Coolspot II Variable Spotlight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved dissecting forceps</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>5431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri retractors&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>17000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless precision power drill</td>
			<td>Dremel&#160;</td>
			<td>1100-01</td>
			<td>Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engraving Cutter</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>105</td>
			<td>1/32&#34; or 0.8 mm bit diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>75</td>
			<td>Hamilton Microliter&#174; Syringes 700 series; 5&#956;l volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7762-06</td>
			<td>33G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures&#160;</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74950-296</td>
			<td>7.9mm diameter x 50mm length (5/16&#34; diameter x 2&#34; length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1L glass screw-cap storage bottle</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1395</td>
			<td>Type 1, Class A borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium&#160;</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400</td>
			<td>1,000U/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole Parmer Instruments Group</td>
			<td>77200-60</td>
			<td>Master Flex Easy Load II console drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2)</td>
			<td>available from local vendor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A-type, large cylinder&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G x 1 &#189;&#34; aluminum hub blunt needles</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>8881202363</td>
			<td>0.9mm x 38.1mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane ice bucket</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-591-45</td>
			<td>Capacity: 0.152 oz. (4.5L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type I-S)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1639</td>
			<td>from Clostridium histolyticum&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS002007</td>
			<td>&#62;2,000 Kunitz units per mg dry weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>20157-3</td>
			<td>top I.D. 115mm, base I.D. 85mm, 203ml volume&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel single edged razor blades&#160;</td>
			<td>Garvey</td>
			<td>40475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone rongeurs</td>
			<td>FST</td>
			<td>16001-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>FST</td>
			<td>13014-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large dissection scissors</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small dissection scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end forceps</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>13250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7ml glass Dounce tissue grinder</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>KT885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll Density Centrifugation Media&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>12-104</td>
			<td>single use; sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70&#956;m sterile nylon mesh cell strainers&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136)</td>
			<td>eBiosciences&#160;</td>
			<td>17-5941-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: RTK4530) isotype control&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG2a, &#954; (clone: eBM2a) isotype control&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: eB149/10H5) isotype control&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, &#954; (clone: RTK4530) isotype control</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>515403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, &#954; (Clone: MOPC-21) isotype control&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-103</td>
			<td>conical bottom&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td>conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x75mm round-bottom polypropylene FACS tubes&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-956-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>650033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG603</td>
			<td>model: SterilGARD III Advance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells

Notre laboratoire a démontré récemment que les cellules tueuses naturelles (NK) sont capables d&#39;éradiquer GL26 de souris orthotopique implanté et rat CNS-1 gliomes malins peu de temps après la prise de greffe intracrânienne si les cellules cancéreuses sont rendues déficientes dans l&#39;expression de la lectine galectine β-galactoside liaison -1 (gal-1). Des travaux plus récents montre maintenant que une population de GR-1 des cellules myéloïdes + / CD11b + est essentiel à cet effet. Pour mieux comprendre les mécanismes par lesquels les NK et les cellules myéloïdes coopèrent pour conférer rejet de tumeur gal-1-deficient nous avons mis au point un protocole détaillé pour l&#39;isolement et l&#39;analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant (PBMC). La méthode est mise en évidence en comparant les PBMC ici infiltration dans le microenvironnement tumoral de Gal-1 exprimant GL26 gliomes avec ceux-gal rendu déficient par une shRNA-knockdown. Le protocole commence par une description de la façon dont la culture et de préparer GL26 CElls pour l&#39;inoculation dans le cerveau de souris C57BL / 6J syngénique. On explique ensuite les étapes impliquées dans l&#39;isolement et l&#39;analyse par cytométrie flux de PBMC de gliome infiltrant du micro-environnement de la tumeur cérébrale précoce. Le procédé est adaptable à un certain nombre de modèles expérimentaux in vivo dans lequel des données temporelles sur infiltration immunitaire dans le cerveau est nécessaire. La méthode est sensible et hautement reproductibles, comme des PBMC de gliome infiltrant peuvent être isolées à partir de tumeurs intracrâniennes dès que la prise de greffe de post-tumeur 24 h avec le nombre de cellules observées similaires de points appariés de temps tout au long de tumeurs expériences indépendantes. Un seul expérimentateur peut réaliser le procédé à partir de cerveau de récolte de circuler analyse cytométrique des PBMC de gliome infiltrant dans environ 4-6 heures selon le nombre d&#39;échantillons à analyser. Modèles de gliome alternatifs et / ou de détection des anticorps spécifiques de cellules peuvent également être utilisés à la discrétion des expérimentateurs pour évaluer l&#39;infiltration de plusieurs autres immune types cellulaires d&#39;intérêt sans la nécessité de modification de la procédure globale.

La stratégie de déclenchement suivant est utilisé pour une expérience typique: FSC-A vs SSC-A → SSC-H vs SSC-W → FSC-H vs FSC-W → CD45 vs. comptage → Gr-1 contre CD11b → NK1.1 contre comptage. Gates a mis sur Gr-1 + / + CD11b cellules myéloïdes et les cellules NK NK1.1 + sont ensuite stratifié basé sur l&#39;expression GZMB (figure 5A). Backgating ces cellules identifiées comme des cellules NK et NK1.1 + Gr-1 + / + CD11...

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Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Présenté ici est une méthode simple pour l&#39;isolement et le flux analyse cytométrique de cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant qui donne des données quantitatives en fonction du temps sur le nombre et le statut activation des cellules immunitaires qui entrent dans le microenvironnement de tumeur cérébrale tôt.

L&#39;isolement et la cytométrie en flux analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

isolation-flow-cytometric-analysis-glioma-infiltrating-peripheral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K vues.  University of Michigan.  Présenté ici est une méthode simple pour l'isolement et le flux analyse cytométrique de cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant qui donne des données quantitatives en fonction du temps sur le nombre et le statut activation des cellules immunitaires qui entrent dans le microenvironnement de tumeur cérébrale tôt. 