Name: isolation of cd 90+ fibroblast/myofibroblasts from human frozen gastrointestinal specimens
Uploaded: 2016-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).

הפרוטוקול לקבלת רקמה אנושית שהושלכה מחולים כירורגי והקמת התרבויות העיקריות אושר על ידי אוניברסיטת טקסס רפואית הסניף ואוניברסיטת ניו מקסיקו לוחות סקירה מוסדית. הדרישות הכלליות לרכש של דגימות רקמה אנושיות מתוארת להלן. שים לב כי מאז MFS עשוי להיות מבודד מהרקמה קפוא, biobanks וספקים מסחריים גם אפשרויות קיימא. 1. השג רקמה אנושית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס פרוטוקול להשיג רקמת מעי גס אנושית למועצה לביקורת המוסדית לאישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסס שיתופי פעולה עם מנתחים כלליים ו / או מנתחי מעי גס על מנת לקבל רקמות אנושיות למחקר. שיתוף פעולה עם המחלקה לפתולוגיה היא גם חובה כפי שהם יהיו קביעת הרקמה שאינו נדרשת לאבחון ויכול להיות מיועדת למחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעץ פתולוג לספק רקמה מneoplasm ולאחר מכן grosslרירית נורמלית y לפחות 5 סנטימטרים מהגידול. מייד למקם את הדגימות בתקשורת לשטוף קר כקרח ומניח על קרח. פתולוג יקבע את כמות הרקמה שיכול להינתן בבטחה למחקר. הרקמה המינימלית הנדרשת לבידוד MF היא 1.5 מ&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ברקמות שהושגו או מייד להקים תרבויות העיקריות או הקפאה והמקום ב -80 ° C עבור בידוד עתיד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הקפאה לבידוד מאוחר יותר, לחתוך את הרקמה לתוך כ 1 - 2 מ&quot;מ 2 חתיכות, מקום לתוך צינור קירור עם 1 מיליליטר של תקשורת הקפאה (ראה להלן), וחנות ב -80 ° C. הערה: ניצול פרוטוקול זה, בידוד מוצלח של MFS מהרקמה קפואה במשך 4 שנים נצפה. </li></ol></li></ol> 2. הכן ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרון Collagenase: הכן 100 U collagenase מיליליטר / I, II ו- IV בתמיסת מלח המאוזן של האנק (HBSS) עם Ca 2 + / 2 + Mg (ראה לוח חומרים </stronז&gt;). זהירות: ריכוז יחידה פעיל Collagenase וטוהר רשאי משתנים מהספק כדי ספק, שעלולה לעכב את היעילות של מערכת עיכול הרקמה ו / או שימור epitope על פני השטח של תאי רירית. כדי למנוע בעיות פוטנציאליות אלה, להשתמש collagenase עם התואר הגבוה ביותר של טוהר (≥95%) ולהכין את פתרון המניות המבוסס על ריכוז יחידות הפעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות DNase על בסיס מים ב 10 מיליליטר / מ&quot;ג (3.55 UA / מ&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת לשטוף: (ממ: 89 מיליליטר, אנטיביוטיקת antimycotic, 100x: 1 מיליליטר; FCS מומת חום: 10 מיליליטר) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פיברובלסטים צמיחת מדיה: ממ: 500 מיליליטר בקבוק; L- גלוטמין (200 מ&quot;מ): 5 מיליליטר; חומצות ממ שאינה חיונית אמינו, 100x פתרון: 5 מיליליטר; ציפרופלוקסצין HCl (10 מ&quot;ג / מיליליטר): 570 μl; אנטיביוטיקה antimycotic, פתרון 100x: 10 מיליליטר; פירובט נתרן (100 מ&quot;מ): 5 מיליליטר; FCS מומת חום: 50 מיליליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת הקפאה: תקשורת צמיחת פיברובלסטים (מגיב 2.4) עם התוספת של 10% דימתיל sulfoxide (DMSO), ואז לסנן-sterilize עם מסנן 0.22 מיקרומטר. </li></ol> רקמות 3. אנזימים Digest אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הרקמה הוקפאה בתקשורת הקפאה, cryovial מקום ב( ~ 37 מעלות צלזיוס) מים חמים עד רקמה ותקשורת מופשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל4 - 5 של 2 מ&quot;מ 2 חתיכות של רקמות, רקמות לשטוף פעמיים עם 10 מיליליטר של HBSS ללא Ca 2 + / Mg 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהרקמה יש התיישבה על ידי כוח הכבידה, להשליך בזהירות supernatant מבלי מסתובב מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של תמיסת collagenase לדוגמא ולהעביר את תערובת רקמות פתרון ל, צינור DNase / RNase ללא סטרילי עם המובנה הרוטורים לניתוק מדגם. השתמש collagenase לנתק את מטריקס המקיף את ההיבט הבסיסי של תאי האפיתל ומהווה את החלק בלתי תאי של propria lamina הרירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוזקה קרוב צינור ולצרף אותו במהופך על השרוול של Dissociator (למשל, gentleMACS). אם אין לו את המעבדה הגישה לtהוא האמור לעיל ציוד, להגדיל את הזמן של כל שלב עיכול כדי להשיג תוצאות דומות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את h_tumor_01 התכנית, פרופיל שנקבע מראש כלול עם המכשיר (משך הזמן הכולל של 36 שניות, עם קטניות לסירוגין החל 1,000 - 4,000 סל&quot;ד, עם 268 כדורים לריצה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סיומה של התכנית, לנתק את הצינור מDissociator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לדוגמה עבור 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת סיבוב רציף על שייקר ב 140 סל&quot;ד. הערה: כמויות משתנות של דגימות רקמה, זמן של עיכול יכול להיות מופחת או מוגבר באופן יחסי (כלומר, כמויות גדולות יותר של רקמה עשויות לדרוש זמן נוסף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינור הפוך על השרוול של Dissociator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ולהפעיל את התכנית h_tumor_02 (משך זמן כולל של 37 שניות, עם קטניות לסירוגין החל 1,000 - 4,000 סל&quot;ד, עם 235 כדורים לריצה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סיומה של התכנית, לנתק את הצינור מDissociator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פתרון מניות DNase. השתמש DNAse לנתק / להסיר תאים מתים וחלק DNA של פסולת הסלולר שמוביל לתא בצעדים כבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מדגם למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת סיבוב רציף על שייקר ב 60 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינור הפוך על השרוול של Dissociator שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ולהפעיל את התכנית h_tumor_03 (משך זמן כולל של 37 שניות, עם קטניות לסירוגין החל 1,000 - 4,000 סל&quot;ד, עם 168 כדורים לריצה). הערה: אם הרקמה אינה מתעכל לגמרי, צנטריפוגות ב × גרם 250 עבור 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס, להשליך supernatant, resuspend ב 2 מיליליטר של תמיסת תא דיסוציאציה ולדגור על RT במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה תא צנטריפוגה ב g × 250 במשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. לשאוב supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה לשטוף תא פעמיים עם 25 מיליליטר של HBSS ללא Ca 2 + / 2 + Mg וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שעבר היהh, לספור את המספר הסלולרי באמצעות מערכת ספירת תאים אוטומטית זמינה במעבדה או באמצעות hemocytometer ידני. עבור דור התרבות העיקרית MF להמשיך לצעד 3.19.1, לניתוח או מיון של MFS באמצעות cytometry זרימה להמשיך לצעד 3.19.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבידוד וצמיחה של תרבות MF הטהורה (איור 1), לבטל את supernatant מצנטריפוגה האחרונה, תא גלולה גלול בכמות המתאימה של תקשורת בידוד פיברובלסטים צריך זרע עד 4 x 10 6 תאים ב 3 מיליליטר של התקשורת לכל גם ב 6 צלחות גם, שטופלה תרבית תאים. המשך לשלב 3.20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח או מיון של MFS באמצעות cytometry זרימה, למקם עד 2 x 10 6 ב 2 מיליליטר של תקשורת בידוד פיברובלסטים ב 24 גם, צלחת נמוכה מחייבת ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. זה הוא להחזיר את epitopes פני תא שעשוי להיות מושפע מההליך האנזימטית. לאחר מכן לאסוף השעיה תא ולספור תאים התאוששו ולהמשיךלimmunostaining וניתוח תזרים cytometry 8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. לשנות תקשורת כל 2 - 3 ימים עד היווצרות ~ monolayer MF מחוברות 80% (איור 1D-E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מעבר בצלוחיות T25 עם מ 6 צלחת גם ביחס 1: 1 ולגדול ל~ 10 - 14 ימים בתקשורת צמיחה פיברובלסטים להשיג 80 - confluency 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב תרבות על ידי passaging תאים מT25 לתאי T75 ביחס 1: 2. ברגע שתאים מגיעים confluency, להשתמש בקבוק אחד לניתוח של טוהר MF המבודד באמצעות ידי cytometry זרימה כפי שתואר לעיל 5. להקפיא או מעבר אחר בקבוק T75 תרבות MF ביחס 1: 3. הערה: כאשר נותחו על ידי cytometry זרימה, צפוי כי במערכת העיכול רירית סטרומה MF ממוצא mesenchymal כאשר גדלו בתרבות יהיה פנוטיפ הבא: EpCAM-, CD31-, CD45-, + vimentin, α-SMA +, CD90 +. </li></ol>

<ol>
	<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+Fibroblasts+Mediate+Extracellular+Matrix+Remodeling+and+Invasion+of+Scirrhous+Gastric+Carcinoma+Cells.">Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells.</a> PLoS ONE. 9, e85485 (2014).</li><li>Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Human+Colonic+Myofibroblasts+Are+Resistant+to+Clostridium+difficile+Toxin+A-Induced,+but+Not+Toxin+B-Induced,+Cell+Death.">Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death.</a> Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).</li><li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Cells+of+the+Intestinal+Lamina+Propria.+Annu+Rev+Physiol.">Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol.</a> Annu Rev Physiol . 73, 213-237 (2011).</li><li>Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., Gaudio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+prevent,+reduce+or+reverse+intestinal+fibrosis+in+IBD?.">Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD?.</a> Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).</li><li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa.">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li><li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2.">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am J Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li><li>Roncoroni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+fibroblasts+from+endoscopic+duodenal+biopsies+of+celiac+patients.">Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients.</a> J Transl Med. 7 (40), (2009).</li><li>Pinchuk, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+Cells+Induce+Th17+during+Helicobacter+pylori+Infection+and+in+the+Gastric+Tumor+Microenvironment.">Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment.</a> PLoS ONE. 8, e53798 (2013).</li><li>Pinchuk, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+chemoattractant+protein-1+production+by+intestinal+myofibroblasts+in+response+to+staphylococcal+enterotoxin+a:+relevance+to+staphylococcal+enterotoxigenic+disease.">Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease.</a> J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).</li><li>Paulsson, J., Micke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+relevance+of+cancer-associated+fibroblasts+in+human+cancer.">Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer.</a> Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).</li><li>Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., Yagi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+carcinoma-associated+fibroblast-derived+proteins+in+clinical+oncology.">Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology.</a> J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).</li><li>Minonzio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+maintain+high+capability+to+grow+and+differentiate.">Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate.</a> Cryobiology. 69, 211-216 (2014).</li><li>Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Myofibroblasts+from+Mouse+and+Human+Esophagus.">Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus.</a> J. Vis. Exp. (95), e52215 (2015).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> J. Vis. Exp. (80), e50611 (2013).</li><li>Schiller, J. H., Bittner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+Tumorigenic+Phenotype+with+in+Vitro,+but+not+in+Vivo,+Passaging+of+a+Novel+Series+of+Human+Bronchial+Epithelial+Cell+Lines:+Possible+Role+of+an+&#945;5/&#946;1-Integrin-Fibronectin+Interaction.">Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an &#945;5/&#946;1-Integrin-Fibronectin Interaction.</a> Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).</li><li>Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells:+a+perspective+from+in+vitro+cultures+to+in+vivo+migration+and+niches.">Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches.</a> Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).</li><li>Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+preservation+and+expansion+of+human+limbal+epithelial+stem+cells+on+amniotic+membrane+cultures.">Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures.</a> Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).</li><li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture.">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).</li><li>Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Macrophage+Migration+Inhibitory+Factor+Exposure+Induces+Mesenchymal+Epithelial+Transition+and+Promotes+Gastric+and+Colon+Cancers.">Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers.</a> PLoS ONE. 9, e98656 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בעוד פרוטוקול זה פותח ליישום המחקר בלבד, לאור גדל חשיבות קריטית של תאי סטרומה כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים סרטן פרוגנוסטיים ויעד טיפולי, היכולת להקפיא biospecimens &quot;פונקציונלי&quot; לשימוש מאוחר יותר מציעה יתרון משמעותי. זה מייצג יתרון ייחודי ליצירת biorepository הקליני, העשוי...

Myofibroblasts / fibroblasts (MFS) מייצג אוכלוסיית שפע של תאים במערכת עיכול רירית (GI). תאי סטרומה אלה ממוקמים ממש מתחת האפיתל ויוצרים רשת ביניהם בתוך propria lamina הרירי במעיים. MFS הוא לא רק אחראי על התצהיר של מטריקס, אבל באמצעות רגולציה אוטוקריני עשויים להשפיע תחבורת אלקטרוליט, השבת, ותפקוד מחסום של האפיתל הסמוך 1, 2. יתר על כן, MFS הוכח לשחק תפקיד מפתח בדלקת ורקמה שיפוץ 3, 4. myofibroblasts הוא חלק קריטי של מייקרו-הסביבה של הגידול, שבו הם ידועים גם בשם fibroblasts הסרטן הקשורים, ולתרום לצמיחת התאים הסרטני ולשמש כנישה לתאי גזע סרטני 3. נתונים חדשים מצביעים על כך שMFS יכול גם לשמש תאי הצגת אנטיגן מקומיים. בנוסף, פונקצית MFS רגולטורים חשובים של תגובה חיסונית מולדת ובעלי כושר הסתגלות, producing מגוון של ציטוקינים וגורמי גדילה 5. באנשים בריאים, הם האמינו תאי MFS להבדיל מתאי גזע mesenchymal ולהביע על פני השטח שלהם התא, סמן mesenchymal, 3 CD90, 5. תאים אלה הם גם חיוביים עבור vimentin, אבל שלילי לאפיתל וסמן תא דם, EpCAM וCD45 , בהתאמה. Myofibroblasts הם הציעו להיות צורה פעילה של fibroblasts וניתן להבחין בין fibroblasts מופעל לא על ידי הביטוי של α-SMA 5. במהלך העשור האחרון, גישות רבות לבידוד של myofibroblasts מרירית מעי הגס אנושית פורסמו-מבוססת בעיקר על השיטה המתוארת במקור על ידי et al Mahida. 5-8. בעוד שמחקרים בודדים לדווח נהלי בידוד מרירית מעי שונים, אין פרוטוקול אוניוורסלי לבידוד של MFS מאזורים מרובים של מערכת העיכול (כלומר, קיבה, קטן וlרירית מעי arge) כבר פורסמה. הפרוטוקול שהוצג במסמך זה נבדק ומשמש בהצלחה לכל שלושת הסוג של רקמה שהוזכר לעיל. . יתר על כן, נהלים לבידוד MFS מרירית מערכת העיכול קפוא לא דווחו. כאן, אנו מציגים שיטה מותאמת, המבוססת על עיכול אנזימטי, ובמקביל מאפשר לבידודה של רירית מעי אדם MFS לתרבות וcytometry זרימת הניתוח בתא בודד, הכנות טריות מתעכלים, רירית. טכניקה זו באופן מהימן מניבה תרבויות עיקריות עם פנוטיפ MF. יתר על כן, ניתן להשתמש באותן השיטות כדי לבודד MFS מדגימות קפואות של רקמות מעי קיבה וקטנות גם כן. בידוד של myofibroblasts מרקמת GI טרי כבר תואר לעיל; עם זאת, השימוש בדגימות קפואות מציג יתרונות רבים. כלומר, חוקרים יוכלו לאסוף ורקמות חנות מכל מספר של משתפי פעולה ברחבי העולם שיש להם capability ספינה דגימות רקמה קפוא. יתר על כן, חוקרים עשויים למצוא את האוסף של רקמות שהושלכו מחדר הניתוח ו / או צמוד אנדוסקופיה והמיידי עיבוד הרקמות לבידוד לסכסוך עם לוח הזמנים של הניסויים הנוכחיים שלהם. כמו כן, בשל האופי הבלתי צפוי של ניתוח, רכש רקמה עלול להתרחש מאוחר מאוד ביום, אשר יגביל את הזמן שנותר לרקמת עיבוד. הקפאת רקמה לעיבוד מאוחר יותר יהיה לשפר באתגרים אלה. לבסוף, שיטות אלה כבר נוצלו בהצלחה בבידוד של myofibroblasts מעי הגס, קיבה וקטנה במצבי מחלה כגון קרצינומה של המעי הגס ומחלות מעי דלקתיות.

<table><tbody><tr><td>MEM, 1x</td><td>Corning</td><td>MT-10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100x</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin HCl</td><td>Corning</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nonessential Amino Acids</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol solution (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from&amp;nbsp;Clostridium histolyticum, Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from&amp;nbsp;Clostridium histolyticum, Type II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1764</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Accumax cell dissociation solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7089</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer (70 &amp;micro;m)</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human Vimentin</td><td>BD Biosciences</td><td>562337</td><td>Clone RV202</td></tr><tr><td>FITC Monoclonal Anti-Actin, &amp;alpha;-Smooth Muscle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3777</td><td>Clone 1A4</td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-Human CD90</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td>Clone 5E10</td></tr></tbody></table>

isolation of cd 90+ fibroblast/myofibroblasts from human frozen gastrointestinal specimens

Fibroblasts / myofibroblasts (MFS) כבר צובר תשומת לב הולכת וגובר לתפקידם בפתוגנזה ותרומתם לשני ריפוי הפצע והקידום של מייקרו-הסביבה של הגידול. אמנם יש כיום טכניקות רבות לבידוד של MFS מרקמות של מערכת העיכול (GI), פרוטוקול זה מציג אלמנט רומן של בידוד של תאי סטרומה אלה מהרקמה קפוא. הקפאת דגימות רקמה במערכת העיכול לא רק מאפשרת לחוקר לרכוש דגימות ממשתפי פעולה ברחבי העולם, biobanks, וספקים מסחריים, זה גם מאפשר עיבוד המאוחר של דגימות טריות. הפרוטוקול המתואר באופן עקבי יניב תאים דמויי כישור אופייניים עם פנוטיפ MF המבטא את הסמנים CD90, α-SMA וvimentin. כאשר התאים אלה נגזרים מדגימות מטופל, השימוש בתאים ראשוניים גם מקנים היתרון של MFS מחקה באופן הדוק ממדינות-כלומר מחלה סרטן ומחלות מעי דלקתיות. טכניקה זו יש דבורהn תוקף בקיבה, מעי דק, ודור התרבות העיקרית הגס MF. תרבויות MF עיקריות ניתן להשתמש במגוון רחב של ניסויים על פני מספר המעבר וטוהר שלהם הוערכו על ידי שני immunocytochemistry וcytometry זרימת הניתוח.

השימוש בפרוטוקול עיכול אנזימטי זה, יש לנו כבר הצליח לבודד ולגדל תאי סטרומה בטן אוכלוסיית MF CD90 + רירית מדגימות כירורגית במערכת העיכול וביופסיות (איור 1) באופן עקבי. התפשטות המושבה MF גלויה יכולה להיבחן ביום 2 - 5 לאחר זריעת השעיות תא mononuclear...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

בידוד של פיברובלסטים / myofibroblasts 90 + CD מאדם דוגמאות במערכת העיכול קפוא


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

isolation-cd-90-fibroblastmyofibroblasts-from-human-frozen

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K Views.  University of Texas Medical Branch. Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production. 

Video: Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast physiology and pathology underlie a spectrum of clinical entities, including fibroses in multiple organs, hypertrophic scarring following burns, loss of cardiac function following ischemia, and the formation of cancer stroma. However, fibroblasts remain a poorly characterized type of cell, largely due to their inherent heterogeneity. Existing methods for the isolation of fibroblasts require time in cell culture that profoundly influences cell phenotype and behavior. Consequently, many studies investigating fibroblast biology rely upon in vitro manipulation and do not accurately capture fibroblast behavior in vivo. To overcome this problem, we developed a FACS-based protocol for the isolation of fibroblasts from the dorsal skin of adult mice that does not require cell culture, thereby preserving the physiologic transcriptional and proteomic profile of each cell. Our strategy allows for exclusion of non-mesenchymal lineages via a lineage negative gate (Lin-) rather than a positive selection strategy to avoid pre-selection or enrichment of a subpopulation of fibroblasts expressing specific surface markers and be as inclusive as possible across this heterogeneous cell type.

Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.

עכברי Dermal פיברובלסטים בידוד על ידי FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have traditionally been attributed to the superficial papillary or lower reticular dermis according to their histological localization. In mouse dermis, papillary and reticular fibroblasts originate from two different lineages with diverging functions regarding physiological and pathological processes and a distinct cell surface marker expression profile by which they can be distinguished.
Importantly, evidence from explant cultures from superficial and lower dermal layers suggest that at least two functionally distinct dermal fibroblasts lineages exist in human skin dermis as well. However, unlike for mouse skin, cell surface markers enabling the discrimination of different fibroblast subsets have not yet been established for human skin. We developed a novel protocol for the isolation of human papillary and reticular fibroblast populations via fluorescence-activated cell sorting (FACS) using the two cell surface markers Fibroblast Activation Protein (FAP) and Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. This method enables the isolation of pure fibroblast subsets without in vitro manipulation, which was shown to affect gene expression, thus permitting accurate functional analysis of human dermal fibroblast subsets in regard to tissue homeostasis or disease pathology.

This manuscript describes a FACS-based protocol for isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin. It circumvents in vitro culture which was inevitable with the commonly used isolation protocol via explant cultures. The emanating fibroblast subsets are functionally distinct and display differential gene expression and localization within the dermis.

הבידוד של העור האנושי על ידי מיון תאים שהופעלו על ידי קרינה פלואורסצנטית ורשתית

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

Genetics

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

בידוד והנצחה של שורות תאים שמקורם בחולה מביופסיה של שריר למחל דוגמנות

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Medicine

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Bioengineering

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Biology

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary fibroblasts cannot divide indefinitely due to myofibroblast differentiation or senescence induction, new cultures must be established regularly. However, there are several obstacles to overcome during the processes of developing a reliable isolation protocol and primary fibroblast isolation itself: the method&#8217;s degree of difficulty (especially for beginners), the risk of bacterial contamination, the required time until primary fibroblasts can be used for experiments, and subsequent cell quality and viability. In this study, a fast, reliable and easy-to-learn protocol to isolate and culture primary adult fibroblasts from mouse heart, lung, liver and kidney combining enzymatic digestion and ultrasonic agitation is provided.

We present a protocol to isolate primary adult fibroblasts in an easy, fast and reliable way, performable by beginners (e.g., students). The procedure combines enzymatic tissue digestion and mechanical agitation with ultrasonic waves to obtain primary fibroblasts. The protocol can easily be adapted to specific experimental requirements (e.g., human tissue).

אולטרה סאונד-מוגבר למבוגרים בידוד פיברוהפיצוץ

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for 25 min. Human esophageal resection specimens are stripped of muscularis propria and adventitia and the remaining mucosa is minced, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for up to 6 hr. Cultured cells express &#945;-SMA and vimentin and express desmin weakly or not at all. Culture conditions are not conducive to growth of epithelial, hematopoietic, or endothelial cells. Culture purity is further confirmed by flow cytometric evaluation of cell surface marker expression of potential contaminating hematopoietic and endothelial cells. The described technique is straightforward and results in consistent generation of non-hematopoieitc, non-endothelial stromal cells. Limitations of this technique are inherent to the use of primary cultures in molecular biology studies, i.e., the unavoidable variability encountered among cultures established across different mice or humans. Primary cultures however are a more representative reflection of the in vivo state compared to cell lines. These methods also provide investigators the ability to isolate and culture stromal cells from different clinical and experimental conditions, allowing comparisons between groups. Characterized esophageal stromal cells can also be used in functional studies investigating epithelial-stromal interactions in esophageal disorders.

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

בידוד של myofibroblasts מעכבר והוושט אדם

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of primary fibroblasts derived from keloid tissue are the basis for further studies of the biological function and molecular mechanisms of keloids, as well as new therapeutic strategies for treating them. The traditional method of obtaining primary fibroblasts has limitations, such as poor cellular state, mixing with other types of cells, and susceptibility to contamination. This paper describes an optimized and easily reproducible protocol that could reduce the occurrence of possible issues when obtaining fibroblasts. In this protocol, fibroblasts can be observed 5 days after isolation and reach nearly 80% confluency after 10 days of culture. Then, the fibroblasts are passaged and verified using PDGFR&#945; and vimentin antibodies for immunofluorescence assays and CD90 antibodies for flow cytometry. In conclusion, fibroblasts from keloid tissue can be easily acquired through this protocol, which can provide an abundant and stable source of cells in the laboratory for keloid research.

This study describes an optimized protocol for establishing primary fibroblasts from keloid tissues that can effectively and steadily provide pure and viable fibroblasts.

בידוד, תרבית ואפיון פיברובלסטים עוריים ראשוניים מרקמת קלואיד אנושית

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...