הפרוטוקול הבא מספק הוראות ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים אוטולוגיים הנגרמים על ידי בני אדם באמצעות תכנות מהיר ויעיל של פיברובלסטים עוריים אנושיים המבודדים מביופסיה של פונץ' בעור. ההליכים יכולים להתבצע על ידי חוקרים עם ניסיון מועט או ללא ניסיון בתכנות מחדש של תאים ועם התאמה נכונה, מאפשר את המוצר של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים ללא קסנו. תאי IPS אוטולוגיים עשויים לשמש עבור יישומי רפואה רגנרטיבית עבור מידול מחלות כמו הפרעות גנטיות או סרטן לחקור על מנגנונים מולקולריים הבסיסית ולפתח טיפולים ספציפיים יותר.
עומס העבודה גבוה. זה מאוד מועיל ללמוד את הפרוטוקול לפני בזהירות לתכנן את הניסוי, כולל השלבים שבמהלכם reagents וחומרים צריך להיות מוכן. ההדגמה החזותית של ההליך מסייעת למחקרים עם ניסיון מועט או ללא ניסיון לבצע את בידוד התא ואת התכנות מחדש, תוך הימנעות מטעויות נפוצות הקשורות לזיהום מיקרוביאלי ו- RNA אפשרי.
מתחת למכסה המנוע הסטרילי, שטפו את הדגימה הטרייה של עור אנושי מהבטן בצלחת של 100 מילימטר עם תות HPSS. הסר שיער ושומן באמצעות מלקחיים ומספריים עדינים ול לנתח אותו עם אזמל כדי להשיג שברים בגודל של שני מילימטרים על ידי מילימטר אחד, הימנעות צלקות, אזורים מלוכלכים או שרופים של הרקמה. מניחים ארבעה שברים קטנים בכל צלחת 35 מילימטר, מכסים בזכוכית כיסוי סטרילית ומוסיפים 1.5 מילימטרים של I-DMEM.
הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך כ 15 ימים או עד התאים להגיע 85% confluence. שנה את מדיום התרבות כל שלושה ימים ובדוק את הגידול של תאים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך מדי יום. עכשיו, להרים את כוסות הכיסוי עם ממטרים עדין, למקם אותם במהופך בצלחת 100 מילימטר ולשטוף עם PBS סטרילי 1X.
הסר את שברי הדגימות וזרוק אותם. לשטוף צלחות עם PBS סטרילי 1X. הסר את 1X PBS ולהוסיף שלושה מילימטרים של טריפסין-EDTA לכיסוי כוסות להציב בצלחת 100 מילימטר ולהוסיף מילימטר אחד של טריפסין-EDTA מנות 35 מילימטר גם כן.
דגירה במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, לחסום את טריפסיניזציה על ידי הוספת חמישה מילימטרים של TSS לצלחת 100 מילימטר ושני מילימטרים של TSS לכל צלחת 35 מילימטר. לאסוף את ההשעיה לתוך צינורות סטריליים 15 מילימטר, צנטריפוגה ב 400 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
שאף את העל-טבעי ולחץ מחדש על גלולה ב 12 מילימטרים של I-DMEM. לפצל את ההשעיה התא לשלושה aliquots מילימטר ולהעביר אותם כל אחד לתוך צלחת 60 מילימטר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
לשנות את המדיום מדי יום. שמור תאים בתרבות עד שהם מגיעים להתכנסות של 75%לאחר מכן, חזור על טריפסיניזציה שלוש פעמים כדי להשיג תאים שעברו ארבעה. לאחר מכן, לסנכרן את התאים על ידי החלפת I-DMEM עם S-DMEM ודגירה במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
במהלך סנכרון התאים, הכינו את התרחבות פיברובלסט בינונית וקוקטייל תכנות מחדש של RNA שלא שונה עבור תכנות חופשי פיברובלסט. כדי לפשט את ההכנה של תשעת הצינורות של aliquots RNA לא שונה כי הם מחולקים לאחר מכן ל 36, נהגנו לעקוב אחר תוכנית שאנחנו מחוברים לקיר מכסה המנוע. מעיל צלחת 24 באר על ידי העברת 100 microliters של מטריצת קרום מרתף מופשר על קרח לכל באר כדי לכסות באופן אחיד את החלק התחתון.
דגירה לפחות שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס לפני זריעת התאים. שאפו את המדיום מצלחות עם תאים בתרבות ושטפו במהירות ב-PBS 1X. חזור על טריפסיניזציה כדי להשיג תאים במעבר חמש.
שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש את גלולת הכדור בנפח מתאים של מדיום התרחבות פיברובלסט. מכינים ומנקים את ההמוציטומטר ב-70% אלכוהול. לאחר מכן, להכין פתרון על ידי ערבוב בעדינות 10 microliters של כחול טריפאן ו 10 microliters של השעיית תא בצינור 1.5 מיליליטר, ו דגירה במשך 1-2 דקות בטמפרטורת החדר.
פיפטה 10 מיקרוליטרים של הפתרון לתוך ההמוציטומטר ומ מניחים אותו על הבמה של מיקרוסקופ ניגוד פאזה הפוך לספור. תאים שאינם בני קיימא הם כחולים בעוד תאים בני קיימא אינם נגועים. לספור את התאים לפחות שני ריבועים של תא hemocytometer.
בצע דילול כדי לקבל צפיפות של 2.5 פעמים 10 לתאים הרביעיים לכל 500 microliters של פיברובלסט התפשטות בינונית resuspend את גלולת התא. פיפטה 500 מיקרוליטרים של ההשעיה התא לתוך כל באר של צלחת 24 באר. דגירה תאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
בבוקר, הסר את המדיום הישן מכל באר והחלף אותו ב-500 מיקרוליטרים של מדיום תרבות נטול פקטורים נטול קסנו. דגירה ב 37% מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני לפחות שש שעות. להפשיר חמישה 15.4 aliquots microliter של קוקטייל תכנות מחדש nmRNA הכולל בטמפרטורת החדר ואז למקם אותם בקרח.
הוסף 234.6 microliters של מדיום סרום מופחת לכל aliquot, בעדינות פיפטה שלוש עד חמש פעמים ולתייג כל אחד כמו צינור A.Label חמישה צינורות סטריליים RNase 0.5 מיליליטר כמו צינור B ומערבבים שישה microliters של RNA קטן סינטטי מפריע RNA תמיר ריאגנט עם 244 microliters של מדיום סרום מופחת. לאחר מכן, השתמש פיפטים כדי להוסיף את התוכן של כל צינור B לצינור טיפה חכם. מערבבים על ידי הקשה על החלק התחתון של הצינור.
דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאחר מכן, כדי להוסיף 125 microliters של פתרון מורכב transfection nmRNA מכל אחד מחמשת aliquots לכל באר, להטות את הצלחת ואת פיפטה טיפה חכם לתוך המדיום. מערבבים את התוכן ב 20 בארות על ידי נדנדה בעדינות.
השתמש בארבע בארות הנותרות כהפניה. דגירה הצלחת במשך 15 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת, שאף את המדיום.
מתחת למכסה המנוע הסטרילי, חזור על הליך ההמרה, כמו ביום הראשון, כל יום במשך שלושה ימים נוספים. ביום החמישי, שאפו את המדיום והחליפו עם מדיום תרבות XF/FF טרי וחומם מראש מתחת למכסה המנוע הסטרילי. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
לפקח על תרבות התא מדי יום על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, עד התבוננות היווצרות מושבות IPSC. מטרת פרוטוקול זה הייתה לתכנת מחדש פיברובלסטים עוריים המבודדים מעור הבטן בשיטת תכנות מחדש שאינה משלבת. פיברובלסטים אנושיים יצאו מדגימות של עור בטן תוך שבוע מתרבות והגיעו ל-85% תוך שבועיים.
התאים התאים התאפיינו בצמיחה דבקית על צלחות תרבות פלסטיק, והמורפולוגיה שלהם השתנתה ממוארכת בצורת ציר לשטח בצורת כוכב. מורפולוגיה Fibroblast וסידור ותרבות השתנו באופן דרמטי לאחר זריעה על BMM, כאשר הם רכשו מורפולוגיה מוארכת מסודרים כדי ליצור מבנים מסועפים דקים. מושבות קטנות כבר נראו בתרבות ביום הראשון מההתמזגות הראשונה וגודלן גדל בהדרגה עם הזמן, בעוד שמספרן גדל עד היום השביעי ולאחר מכן נותר יציב בין היום השביעי ליום ה-14, ככל הנראה כתוצאה מהתמזגות מושבות קטנות יותר כדי ליצור מושבות גדולות יותר.
מאז הליך תכנות מחדש בוצע באמצעות מדיה ללא אנטיביוטיקה, במקרה שבו תנאים סטריליים לא הובטחו, זיהום מיקרוביאלי הפך לנושא מרכזי. שיעור ההתפשטות וצפיפות הציפוי משפיעים על יעילות התכנות מחדש, ולכן חשוב לתכנן את מעבר התאים ולהגדיר את צפיפות הציפוי על בסיס שיעור התפשטות התאים. פרוטוקול זה, המחליף ריאגנטים שמקורם בבעלי חיים בריאגנטים מתאימים נטולי קסנו, מאפשר תכנות מחדש של פיברובלסטים אנושיים בוגרים לתאי IPS בסביבה תרבותית שלמה נטולת קסנו שלא היו השימוש הקליני שלהם.
תאים אנושיים הם מקור פוטנציאלי של זיהום עם פתוגנים המועברים בדם, ומכאן, ציוד מגן אישי צריך להיות משוחק לאורך כל ההליך.
