בידוד, תרבית ואפיון פיברובלסטים עוריים ראשוניים מרקמת קלואיד אנושית

הבידוד והתרבית של פיברובלסטים ראשוניים שמקורם ברקמת קלואיד הם הבסיס למחקרים נוספים של קלואידים. פיברובלסטים מרקמה קלואידית ניתן לרכוש בקלות באמצעות פרוטוקול זה, אשר יכול לספק מקור שופע ויציב של תאים במעבדה למחקר קלואיד. התחל על ידי שימוש בפינצטה סטרילית כדי למקם את רקמת הקלואיד בצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מיליליטר המכיל 10 עד 25 מיליליטר של PBS בתוספת 1% PSA.

בינתיים, הוסף ארבעה מיליליטר של תמיסת PBS PSA לכל באר של צלחת שש בארות. כעת הוציאו את הרקמה מהצינור, ושטפו פעמיים בתמיסת PBS PSA. באמצעות זוג מלקחיים סטריליים, להעביר את הרקמה ברצף מבאר אחת לאחרת.

לאחר מכן להסיר את שכבות השומן ואת האפידרמיס עם מספריים כירורגיים, משאיר את הדרמיס ללא פגע. השתמש בזוג מספריים כדי לנתח את הדרמיס החתוך לשלוש עד חמש חתיכות מילימטר מרובע ולהעביר את החתיכות לבאר הבאה עם זוג מלקחיים סטריליים. שטפו את החתיכות בתמיסת PBS PSA.

בעזרת מלקחיים מעוקרים, הניחו בצלחות פטרי 10 עד 30 חתיכות רקמת דרמיס במרווחים של פחות מחמישה מילימטרים זו מזו. מניחים את הכלים הפוכים באינקובטור עד שהנתחים מתייבשים ונדבקים לצלחת. לאחר מכן, להוסיף שבעה מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% PSA, ולדגור את הכלים כמו קודם.

לאחר שלושה ימים, החליפו חצי מהסופרנאטנט במדיום תרבית שלם. יש להתבונן בפיברובלסטים מדי יום תחת הגדלה מיקרוסקופית פי 40. הסר את חתיכות הרקמה במדיום התרבית כאשר הפיברובלסטים מגיעים למפגש של 90%.

שטפו את הפיברובלסטים ב-PBS והוסיפו שני מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA סטרילית. לאחר הדגירה על התאים באינקובטור לח, טפחו בעדינות על צלחת התרבית והתבוננו בה מתחת למיקרוסקופ. מוסיפים שני מיליליטר של מדיום שלם כדי לסיים את העיכול לאחר שרוב התאים התנתקו.

כעת העבירו את מתלה התא לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה את הצינור ב-300G למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הסופרנאטנט בזהירות ולהשהות מחדש את כדורית התא בתווך מלא. זרעו את הפיברובלסטים בצלחת תרבית תאים בגודל תשעה סנטימטרים ודגרו באינקובטור לח.

כדי לבצע אנליזה אימונופלואורסצנטית לאחר תרבית הפיברובלסטים על כיסויים עגולים ודגירתם בנוגדנים ראשוניים ומשניים, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת DAPI למגלשת הזכוכית כדי להכתים את גרעיני התא. הניחו את הכיסויים השטופים על מגלשות זכוכית באמצעות מלקחיים. לבסוף, העבירו את הדגימות לקופסה כהה ורטובה למיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תולדות פיברובלסטים של הרקמה נצפו חמישה ימים לאחר העיבוד. הפיברובלסטים הפגינו שיעורי התפשטות גבוהים והגיעו למפגש לאחר 10 ימים. לפיברובלסטים היו גופי תאים מוארכים ודמויי ציר, שהיו מיושרים בצרורות במפגש גבוה.

צביעה אימונופלואורסצנטית החזירה אימונופלואורסצנטיות אדומה חיובית של הפיברובלסטים ואימונופלואורסצנטיות כחולה של גרעין התא. בדיקות ציטומטריות של זרימה הראו חיוביות CD90 כמעט בכל הפיברובלסטים. מחקר זה תיאר שיטה אופטימלית וסיפק הוראות ברורות לפתרון אתגרים קיימים ולהגדלת סיכויי ההצלחה לבידוד ולתרבית של פיברובלסטים קלואידים.