Name: immunostaining phospho-epitopes in ciliated organs of whole mount zebrafish embryos
Uploaded: 2016-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק הקרן הלאומית למדע IOS-0,817,658.

הנהלים דג הזברה בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) באוניברסיטת וירג&#39;יניה. 1. הכנת ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4% PFA / PBS. לשקול 8 גרם של paraformaldehyde (PFA) ב למכסה המנוע קטר. עוד בזמן שהיה במנדף, לפזר את PFA היבשים ~ 80 מ&quot;ל מזוקקים H 2 O עם ערבוב וחימום עד 50 ° C. תוך ערבוב, מוסיפים 3 - 10 טיפות של 1N NaOH טריים עד PFA נמס לגמרי פתרון מבהיר. מסירים מהאש ומוסיפים 100 מ&quot;ל 2x פוספט בופר (PBS). תביאו נפח 200 מ&quot;ל עם מזוקקים H 2 O. מגניב RT ולאשר pH של 7.4 לפני השימוש. חנות בחושך על 4 מעלות צלזיוס אבל להשתמש בתוך שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש 100% מתנול ללא כל תוספות. השתמש 95% אתנול ללא כל תוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן Tween פוספט שנאגר (PBT). מוסף מלוח פוספט שנאגר (PBS) עם 0.1% Tween-20. להוסיף 0.5 מ&quot;ל של פתרון המניה 20% Tween-20 עד 100 מ&quot;ל 1x PBS. חנות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פוספט שנאגר Triton-X (PBTx). מוסף PBS עם 0.1% Triton X-100. הוסף 0.5 מ&quot;ל של המניה 20% טריטון X-100 ל -100 מ&quot;ל של PBS. חנות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10% NGS / PBTx. סרום עיזים רגיל (NGS) בלוקים הלא ספציפי אתרי קישור. NGS חנות aliquots ב -20 ° C. כדי להשתמש, להוסיף 1 מ&quot;ל ל 9 מ&quot;ל PBTx. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 50% גליצרול / PBS. מערבבים היטב בחלקים שווים של PBS 2x ו -100% גליצרול. חנות ב RT. </li></ol> קיבוע העובר 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . (. למשל, β-יקטין: CAAX-GFP) גידול השג סוג בר (AB ו WIK) או מהונדס עוברי דרך הזדווגויות טבעיות. אם תרצה, להזריק עוברים עם בונה או morpholinos, כמתואר. 15,16 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם עוברים. איסוף עוברים דגירה על 28.5 מעלות צלזיוס בנוכחות 0.003% 1-פניל-2-thiourea (PTU) לחסום פיגמנטציה כמתואר. 17 </su<html> p&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן. כאשר עובר הגיע לשלב ההתפתחותי הרצוי, 18, &#160; להרדים את העוברים באמצעות MESAB, להוציא מים מערכת כמה שיותר ולהוסיף PFA / PBS 4% טרי במשך 3 - 4 שעות ב RT. הערה: לפעמים פחות מ -20 שעות שלאחר ההפריה (hpf), לתקן לפני dechorionation. לפעמים אחרי 20 hpf, dechorionate לפני קיבוע באמצעות שני זוגות מלקחיים נקודת קנס תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי פתרונות. העבר עוברים באמצעות pipet נשא רחב, כמתואר. 17 פתרונות שינוי 1.5 מ&quot;ל כתרים צינורות microcentrifuge, פשוט בכך שהוא מאפשר עוברים להתיישב על ידי כוח המשיכה ללא צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט מקבע לאחר 3 -. 4 שעות, להסיר PFA / PBS, להחליף עם 100% מתנול ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך שעה 48 לפחות. הערה: לקבלת immunoreactivity מקסימלי P-CaMK-II, להגביל את זמן אחסון מתנול הכולל לשבוע אחד. </li></ol>&quot;&gt; 3. עובר פריטי Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מינימום של 10 עוברי עבור כל תנאי הניסוי ב צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge כתרים, תווית אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר העוברים להתיישב. סר וזורק מתנול רעננותם עם שטיפות מתקדמות המכילות 0.5 מיליליטר של הפחתה ריכוזית אתנול, כמצוין לשלב הבא. כל צעד הוא לשטוף 5 דקות עם נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהדרגת רעננותם עם 5 פתרונות אלה: 66% אתנול / 33% PBTx, 33% אתנול / 66% PBTx, 100% PBTx, 100% PBTx (זהו החוזרים הראשונים של PBTx), 100% PBTx (זהו חוזר שני של PBTx). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לשטוף PBTx האחרון. הוסף 0.5 מ&quot;ל 10% NGS / PBTx. דגירה במשך שעה 1 לפחות ב RT עם נדנדה עדין ולאחר מכן להסיר ולסלק פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון נוגדן ראשוני על ידי דילול ב 10% NGS / PBTx. אם שיתוף immunostaining, השתמש נוגדן זיקה חזקה יותר הראשון. לצורך המחקר, דגירה עם נוגדנים חד שבטיים טובולין אנטי acetylated עכבר מדולל 1: 500. לקבלת examplדואר, אם יש 10 דגימות, לשלב 6 μl של פתרון נוגדן המניה עם 3 מ&quot;ל של 10% NGS / PBTx ולאחר מכן להפיץ 0.3 מ&quot;ל של זה לתוך צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.2 - 0.5 מ&quot;ל של נוגדן ראשוני מדולל על צינור אחד לטבול כל העוברים. דגירה עם נדנדת O / N העדין ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר, להסיר ולסלק פתרון נוגדנים. הוסף 0.5 מ&quot;ל 2% NGS / PBTx לשטוף נוגדן ראשוני עודף. נער בעדינות במשך 5 דקות. סר וזורק פתרון. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דים האורות תקורה לדלל את נוגדנים משני fluorescently- מצומדות המתאים 10% NGS / PBTx כך שכל מצב מכיל 0.5 מ&quot;ל לפחות. עם נוגדן ראשוני טובולין אנטי acetylated העכבר, השתמש עז צבע ירוק ניאון IgG אנטי עכבר ביחס של 1: דילול 500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה נוגדנים משני למשך 4 שעות עם נדנדה עדין ב RT בחושך. מעתה ואילך, תהליך דגימות תחת אורות מעומעמים דגירה במיכל כהה או על ידי לפפה בנייר אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">בסוף הדגירה, להסיר ולסלק את פתרון נוגדנים משני. הוסף 0.5 מ&quot;ל 2% NGS / PBTx לשטוף. נער בעדינות במשך 5 דקות. סר וזורק פתרון. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם-immunostaining שיתוף, להשיג את הנוגדן הראשוני השנייה מזן שונה הנוגדן הראשוני הראשון. במחקרים אלה, בצע את נוגדן אנטי phospho CaMK-II ארנב ידי נוגדנים משני IgG נגד ארנב עז צבען מצומדות אדום ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל ארנב נגד phospho CaMK-II נוגדן 1:20. עבור כל צינור של עוברים, להשעות ב 0.3 מ&quot;ל 10% NGS / PBTx, ולאחר מכן להוסיף 15 μl של פתרון נוגדן המניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי עוברי שקועים ואורות מעומעמים. דגירה עם נדנדת O / N העדין ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר תחת אורות עמומים, להסיר ולסלק פתרון נוגדנים. הוסף 0.5 מ&quot;ל 2% NGS / PBTx. נער בעדינות במשך 5 דקות. סר וזורק פתרון. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור אורות תקורה עמומות לדלל מספיק של fluorescently-conju המתאיםנוגדנים משני מגודרים כך שכל מצב בו לפחות 0.5 מיליליטר. במחקר זה, לדלל את נוגדנים משני IgG נגד ארנב עיזים אדומות ניאון מצומדות צבע (מסלול אדום) 1: 500 ב 10% NGS / PBTx. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה נוגדנים משני השני למשך 4 שעות עם נדנדה עדין ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה זה ותחת אורות עמומים, להסיר ולסלק את פתרון נוגדנים משני. הוסף 0.5 מ&quot;ל PBTx. נער בעדינות במשך 5 דקות. סר וזורק פתרון. חזור פעמיים. חנות באחת PBTx או 50% גליצרול / PBS תלוי ההליך הדמיה. </li></ol> 4. הדמיה Confocal ועיבוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר עובר הדמיה. מניחים 1 - 5 עוברים בשקופית זכוכית. ליצור תא בין coverslip הראשי לשקופית באמצעות שברי coverslip בכל צד של החדר. בדרך כלל, ארבעה # 1 coverslips משמש כדי להפוך ערימות spacer אלה ללא הדבקה. הערה: אין הרכבה בינונית הכרחית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש טבילת שמן 100Xהמטרה להביא עובר יחיד אל המוקד באמצעות האור המועבר. כבה האור. הפעל מיקרוסקופ confocal. ודא לייזרים מתאימים (ירוק ו / או אדום) מופעלים accessary מוקד מרחוק עוסק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תוכנית confocal. ב &quot;הבר הרוכש&quot;, בחר את המטרה הנכונה. ב &quot;בסיסי XY&quot; בר, להגדיר את גודל התמונה 1,024 על ידי לחיצה על כפתור 1,024. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב &quot;לייזר וגלאים&quot; בר, לחץ על התיבה האדומה 488 ותיבת 568 ירוק להפעיל לייזר גלאי עבור כל ערוץ. גדר החריר עד בינוני ולהתאים את הרווח הבר &quot;הרווח&quot; של כל ערוץ לדמיין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשורת &quot;רוכשת הגדרות&quot;, לחץ על &quot;חי&quot; כדי להתחיל רכישת תמונות. בשורת &quot;הגדרות תצוגה&quot;, בטל את &quot;כוח אינטגרל זום&quot; תיבת למרכז בחלון &quot;חי&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשורת &quot;רוכש הגדרות&quot;, תחת לשונית &quot;Z&quot;, צעד דרך שכבות של תמונה. לאחר בחירה נוmber סעיפים אופטי לשלב לתוך התמונה, לעבור בשלב כלשהו &quot;המרכז&quot; של מטוס- z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &quot;Z&quot;, לחץ על התיבה &quot;הפניה&quot; אדום קטן. זה יהיה לאפס את RFA בנקודה נבחרה &quot;המרכז&quot;. בתיבת הדו שכותרתו &quot;גודל שלב&quot;, לבחור את עובי השכבות (בין 0.25 מיקרומטר ו -2.0 מיקרומטר הוא אידיאלי). שימו לב בתיבה &quot;קובץ הגודל&quot; ולנסות להגביל ל -1 GB. הערה: בדרך כלל, עד 40 חלקים אופטיים של 0.5 - 1.0 מיקרומטר מתקבלת, אך מספר סעיפים יכולים להיקבע באופן אמפירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למצוא את קיצוני העליון של התמונה, לחץ על העיגול שליד &quot;למעלה&quot; ולעבור דרך שכבות z. כעת לחץ על העיגול שליד &quot;תחתית&quot;, המחשב ייקח את התמונה בחזרה שכבת כמרכז. שוב לעבור דרך שכבות כדי למצוא את הקיצוני התחתון של התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;Live&quot; שוב &quot;ההגדרות רוכשות&quot; תיבה כדי לעצור את הליזררְכִישָׁה. בלוח זה, לחץ על התיבות האדומות שכותרתו הממוצעת מחסנית Z. תיבות אלה יהפכו לירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתיבת &quot;רוכשת הגדרות&quot;, לחץ על &quot;יחיד&quot; כדי לרכוש את סדרת תמונות כולו. אתה יכול לעקוב אחר התקדמות כפי שהוא סורק בשני ערוצים ודרך z-הערימה כולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור, לחץ על החלון נפח ולחץ על &quot;שמירה בשם&quot; ואת שם הקובץ. שמור כקובץ &quot;.ids&quot;. נפח לעבד את הקובץ בעוד Z- מחסנית הוא עדיין פתוח, בחר את הנתונים לנתץ התפריט ולחץ על &quot;נפח לדקלם&quot;. שמור את הקובץ שניתן כקובץ TIFF. זהו הדימוי המוקרן המוצגים בפרסום זה. </li></ol>

<ol>
	<li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+during+embryonic+development.">Calcium signalling during embryonic development.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).</li><li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signalling+and+early+embryonic+patterning+during+zebrafish+development.">Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).</li><li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+at+fertilization+and+in+early+development.">Calcium at fertilization and in early development.</a> Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).</li><li>Yuen, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ca(2+)+signaling+in+the+external+yolk+syncytial+layer+during+the+late+blastula+and+early+gastrula+periods+of+zebrafish+development.">Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).</li><li>Tombes, R. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+free+calcium+and+mitosis+in+mammalian+cells:+anaphase+onset+is+calcium+modulated,+but+is+not+triggered+by+a+brief+transient.">Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient.</a> J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).</li><li>Hudmon, A., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Ca2+/Calmodulin-Dependent+Protein+Kinase+II:+The+Role+of+Structure+and+Autoregulation+in+Cellular+Function.">Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).</li><li>Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+Evolution+of+Multifunctional+Ca2+/CaM-dependent+Protein+Kinase+(CaMK-II).">Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II).</a> Gene. 322, 17-31 (2003).</li><li>Braun, A. P., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multifunctional+Calcium/Calmodulin-Dependent+Protein+Kinase:+From+Form+to+Function.">The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function.</a> Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).</li><li>Rich, R. C., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-directed+function+of+calmodulin+in+autophosphorylation+of+Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II.">Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).</li><li>Rothschild, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx5-mediated+expression+of+Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+is+necessary+for+zebrafish+cardiac+and+pectoral+fin+morphogenesis.">Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis.</a> Dev Biol. 330, 175-184 (2009).</li><li>Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+CaMK-II+genes+during+early+zebrafish+embryogenesis.">Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis.</a> Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).</li><li>Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activation+of+membrane+targeted+CaMK-II+in+the+zebrafish+Kupffer's+vesicle+is+required+for+left-right+asymmetry.">The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry.</a> Development. 137, 2753-2762 (2010).</li><li>Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMK-II+is+a+PKD2+target+that+promotes+pronephric+kidney+development+and+stabilizes+cilia.">CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia.</a> Development. 138, 3387-3397 (2011).</li><li>Rothschild, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMK-II+activation+is+essential+for+zebrafish+inner+ear+development+and+acts+through+Delta-Notch+signaling.">CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling.</a> Dev Biol. 381, 179-188 (2013).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , e1113 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. , e1115 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Obara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystin-2+immunolocalization+and+function+in+zebrafish.">Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).</li><li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+whole+mount+in+situ+hybridization+within+zebrafish+embryos+to+study+gene+expression+and+function.">High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function.</a> J Vis Exp. , e50644 (2013).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature. 3, 59-69 (2008).</li><li>Harris, P., Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+tubulin-containing+structures+in+the+egg+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus+from+fertilization+through+first+cleavage.">Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage.</a> J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השיטה PFA / מתנול פותחה במעבדה זה במטרה העיקרית של אופטימיזציה של immunolocalization של epitope phospho-T 287 -CaMK-II במהלך ההתפתחות דג הזברה. שיטה זו מקומי בהצלחה P-CaMK-II במהלך היווצרות של מספר איברים ריסי כולל KV דג הזברה, 12 האוזן הפנימית 14 וכליות. 13 במיוחד בשלב KV, טכני?...

The techniques described here are the outcome of studies that have sought to define downstream targets of Ca2+ signals during events that occur during early development, including fertilization, gastrulation, somitogenesis and trunk, eye, brain and organ formation.1-3 The original discoveries of embryonic Ca2+ signaling were dependent on the use of natural and engineered Ca2+ indicators, such as aequorin4 and fura-2.5 Even with current technology, the detection of transient elevations of Ca2+ requires cumbersome analytical tools and does not reveal the targets of such Ca2+ signals. 
This laboratory investigates Ca2+ signals that act through the Ca2+/calmodulin-dependent (multifunctional) protein kinase known as CaMK-II, an enzyme that is enriched in the central nervous system and originally identified as a regulator of long-term potentiation.6 CaMK-II is not brain-specific, is widely expressed and highly conserved throughout the entire lifespan and bodies of species throughout the animal kingdom, including invertebrates.7,8 CaMK-II has the unique capability of sustaining its own activity even after Ca2+ levels have diminished due to its ability to autophosphorylate at Thr287. In this autophosphorylated state, CaMK-II remains active in a Ca2+/CaM-independent manner, until dephosphorylated.6 Thus, the localization of phosphorylated CaMK-II (Thr287) can identify cells in which natural, relevant Ca2+ elevations have occurred. 
An antibody against autophosphorylated (P-Thr287) mammalian CaMK-II has been well-characterized and was initially used to localize activated CaMK-II in brain tissue.9 Zebrafish (Danio rerio) have seven CaMK-II genes10,11 whose protein products contain a sequence of MHRQE[pT287]VECLK in this region.10,11 This sequence is very similar to the phosphopeptide antigen used to create this rabbit polyclonal antibody (MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore) and therefore it was not a complete surprise that this antibody cross-reacted with zebrafish CaMK-II. This laboratory showed that this antibody reacts with zebrafish CaMK-II in proportion to autophosphorylation and Ca2+/CaM-independent activity.12 Additional pan-specific CaMK-II antibodies have also been shown to cross-react with zebrafish CaMK-II.13
This antibody has been used to demonstrate that zebrafish CaMK-II is preferentially activated in cells on one side of the zebrafish Kupffer's Vesicle (KV), the ciliated organ necessary for establishment of left/right asymmetry.12 This antibody was used to demonstrate that CaMK-II is transiently activated in four adjacent cells on the left side of the KV during the exact same developmental phase that organ positioning is determined.12 In addition to the Kupffer's Vesicle (KV), autophosphorylated (P-T287) was also located in specific intracellular sites in other ciliated tissues including the kidney, neuromasts, and inner ear.12,13 In the zebrafish kidney, P-T287-CaMK-II is enriched along the apical border of ciliated ductal cells and within cloacal cilia where it influences their assembly.13 Finally, in the developing inner ear, P-T287-CaMK-II is intensely concentrated at the base of cilia and influences cell differentiation through the Delta-Notch signal pathway.14 In summary, the detection of activated CaMK-II has pinpointed sites of intracellular Ca2+ release and illuminated potential new signaling pathways.
These discoveries were completely dependent on developing a sensitive and accurate method to localize activated (P-T287-autophosphorylated) CaMK-II. The methods to fix and immunostain the zebrafish KV, kidney and inner ear are described. The limitations of this technique are also described. These techniques should be useful to any investigator who seeks to obtain high-resolution images in two fluorescent channels of not just phospho-epitopes, but any epitope, during early vertebrate development.

<table><tbody><tr><td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P-7629</td><td>0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water</td></tr><tr><td>Alexa488 anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>Goat polyclonal, use at 1:500</td></tr><tr><td>Alexa488 anti-rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>Goat polyclonal, use at 1:500</td></tr><tr><td>Alexa488 phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td>Preferentially binds to F-actin</td></tr><tr><td>Alexa568 anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11004</td><td>Goat polyclonal, use at 1:500</td></tr><tr><td>Alexa568 anti-rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>Goat polyclonal, use at 1:500</td></tr><tr><td>anti-acetylated &amp;#945;-tubulin</td><td>Sigma</td><td>T7451</td><td>Mouse monoclonal, use at 1:500</td></tr><tr><td>anti-phospho-T&lt;sup&gt;287&lt;/sup&gt; CaMK-II</td><td>EMD Millipore</td><td>06-881</td><td>Rabbit polyclonal, use at 1:20</td></tr><tr><td>anti-total CaMK-II</td><td>BD Biosciences</td><td>611292</td><td>Mouse monoclonal, use at 1:20</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>S96857</td><td>Lab grade, 95% denatured</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>VWR</td><td>16004-330</td><td>#1&amp;nbsp; thickness</td></tr><tr><td>Glass microscope slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>Standard glass slides</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A411</td><td>Store in freezer</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td>capped tubes, not sterile</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td>Aliquot 1 ml tubes, store in freezer</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P-6148</td><td>Reagent grade, crystalline</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-131</td><td>10x stock solution or made in lab</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>BP-151</td><td>10% solution in water, store at RT</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Life Technologies</td><td>85113</td><td>10% solution in water, store at RT</td></tr><tr><td>Compound microscope</td><td>Nikon</td><td>E-600</td><td>Mount on vibration-free table</td></tr><tr><td>C1 Plus two-laser scanning confocal</td><td>Nikon</td><td>C1 Plus</td><td>Run by EZ-C1 program, but upgrades use &quot;Elements&quot;</td></tr></tbody></table>

immunostaining phospho-epitopes in ciliated organs of whole mount zebrafish embryos

ההתפשטות מהירה של תאים, ביטוי ספציפי הרקמות של גנים ואת הופעתה של רשתות איתות לאפיין התפתחות עוברית מוקדמת של כל בעלי החוליות. קינטיקה ומיקום של אותות - אפילו בתוך תאים בודדים - בעובר המתפתח משלים זיהוי של גנים התפתחותיים חשובים. טכניקות Immunostaining מתוארים כי הוכחו להגדיר את קינטיקה של אותות בעלי חיים תאיים ושלמים במבנים קטנים כמו cilia העיקרי. טכניקות לתיקון, הדמיה ועיבוד תמונות באמצעות מיקרוסקופ מתחם confocal-סריקת לייזר ניתן להשלים כמה כמו 36 שעות. דג הזברה (Danio rerio) הוא אורגניזם רצוי חוקרים המבקשים לבצע מחקרים בתוך בעלי החוליות היא הזולה רלוונטי מחלות אנושיות. knockouts או knockdowns הגנטיים חייב להיות מאושר על ידי האובדן של מוצר החלבון בפועל. אישור כזה של אובדן חלבוןיכול להיות מושג באמצעות הטכניקות המתוארות כאן. רמזים לתוך מסלולי איתות ניתן לפענח גם באמצעות נוגדנים כי הם תגובתי עם חלבונים ששונו שלאחר translationally ידי זרחון. שמירה ואופטימיזציה של המדינה פוספורילציה של אפיטופ לכן זה קריטי כדי קביעה זו לבין מושגת על ידי פרוטוקול זה. מחקר זה מתאר שיטות לתקן עוברים במהלך 72 שעות של פיתוח הראשון שיתוף בתרגום במגוון אפיטופים רלוונטי עם cilia בתוך שלפוחיות (KV) של Kupffer, הכליה ואת האוזן הפנימית. טכניקות אלו הם ישירים, אינם דורשים דיסקציה יכול להסתיים בתוך פרק זמן קצר יחסית של זמן. הקרנת ערימות תמונת confocal לתוך תמונה אחת היא אמצעי שימושי של הצגת נתונים אלה.

תנאים אופטימליים חזותי phospho-אפיטופים שיטות המתארות את immunolocalization של אפיטופים חלבון עוברי דג זברה כבר דלילות יחסית בהשוואה לאלו ללוקליזציה mRNAs באמצעות כלאה באתרה. Fixatives המשמשים לא?...

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos at JoVE.com

Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

טכניקות מתוארים כדי immunostain-אפיטופים phospho כולן עוברי דג הזברה ולאחר מכן לנהל לוקליזציה confocal ניאון בשני צבעים במבנים הסלולר קטן כמו cilia העיקרי. טכניקות לתיקון והדמיה יכול להגדיר את המיקום ואת קינטיקה של המראה או הפעלה של חלבונים ספציפיים.

Phospho-אפיטופים Immunostaining באיברים ריסי של עוברי דג הזברה שלמים הר

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development ...

immunostaining-phospho-epitopes-ciliated-organs-whole-mount-zebrafish

Research

JoVE Journal

Chemistry

8.0K Views.  Virginia Commonwealth University.  טכניקות מתוארים כדי immunostain-אפיטופים phospho כולן עוברי דג הזברה ולאחר מכן לנהל לוקליזציה confocal ניאון בשני צבעים במבנים הסלולר קטן כמו cilia העיקרי. טכניקות לתיקון והדמיה יכול להגדיר את המיקום ואת קינטיקה של המראה או הפעלה של חלבונים ספציפיים. 

Video: Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

High Precision Zinc Isotopic Measurements Applied to Mouse Organs

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn and 70Zn) which are naturally fractionated between mouse organs. We first show how to dissolve the different organs in order to free the Zn atoms; this step is realized by a mixture of HNO3 and H2O2. We then purify the zinc atoms from all the other elements, in particular from isobaric interferences (e.g., Ni), by anion-exchange chromatography in a dilute HBr/HNO3 medium. These first two steps are performed in a clean laboratory using high purity chemicals. Finally, the isotope ratios are measured by using a multi-collector inductively-coupled-plasma mass-spectrometer, in low resolution. The samples are injected using a spray chamber and the isotopic fractionation induced by the mass-spectrometer is corrected by comparing the ratio of the samples to the ratio of a standard (standard bracketing technique).&#160;This full typical&#160;procedure produces an isotope ratio with a 50 ppm (2 s.d.) reproducibility.

We present the technique to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs.

מדידות דיוק אבץ איזוטופי גבוהות יישומים לאיברי עכבר

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Developmental Biology

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Biology

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. Despite a broad genetic heterogeneity, germline gain-of-function mutations in key regulators of the RAS-MAPK pathway underlie the majority of the cases, and, thanks to advanced sequencing techniques, potentially pathogenic variants affecting the RAS-MAPK pathway continue to be identified. Functional validation of the pathogenicity of these variants, essential for accurate diagnosis, requires fast and reliable protocols, preferably in vivo. Given the scarcity of effective treatments in early childhood, such protocols, especially if scalable in cost-effective animal models, can be instrumental in offering a preclinical ground for drug repositioning/repurposing. 
Here we describe step-by-step the protocol for rapid generation of transient RASopathy models in zebrafish embryos and direct inspection of live disease-associated ERK activity changes occurring already during gastrulation through real-time multispectral F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging. The protocol uses a transgenic ERK reporter recently established and integrated with the hardware of commercial microscopes. We provide an example application for Noonan syndrome (NS) zebrafish models obtained by expression of the Shp2D61G. We describe a straightforward method that enables registration of ERK signal change in the NS fish model before and after pharmacological signal modulation by available low-dose MEK inhibitors. We detail how to generate, retrieve, and assess ratiometric FRET signals from multispectral acquisitions before and after treatment and how to cross-validate the results via classical immunofluorescence on whole embryos at early stages. We then describe how, via examining standard morphometric parameters, to query late changes in embryo shape, indicative of a resulting impairment of gastrulation, in the same embryos whose ERK activity is assessed by live FRET at 6 h post fertilization.

RASopathies are multisystem genetic syndromes caused by RAS-MAPK pathway hyperactivation. Potentially pathogenic variants awaiting validation emerge continuously while poor preclinical evidence limits therapy. Here, we describe our in vivo protocol to test and cross-validate RASopathy-associated ERK activation levels and its pharmacological modulation during embryogenesis by live FRET imaging in Teen-reporter zebrafish.

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

Biochemistry

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a model for human diseases. Gene function study is based on the detection of gene expression patterns. Although immunohistochemistry offers a powerful way to assay protein expression, the limited number of commercially available antibodies in zebrafish restricts the application of costaining. In situ hybridization is widely used in zebrafish embryos to detect mRNA expression. This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish embryo sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. Immunohistochemistry and the imaging of a single cryosection were performed after in situ hybridization. The protocol is helpful to unravel the expression pattern of two genes, first by in situ transcript detection and then by immunohistochemistry against a protein in the same section.

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry of zebrafish embryonic sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. It is useful to detect the expression patterns of two genes in zebrafish if there is a paucity of antibodies.

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Neuroscience

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish embryo is an excellent tool for examining such interactions with an in vivo model. Whole-mount immunohistochemical and immunofluorescence assays are frequently applied in zebrafish embryos to assess protein expression. However, it can be difficult to achieve accurate mapping of co-localized proteins in three-dimensional space. In addition, some studies may require the use of two antibodies that are not compatible with the same technique (e.g., antibody 1 is only suitable for immunohistochemistry and antibody 2 is only suitable for immunofluorescence). The purpose of the method described herein is to perform sequential immunofluorescence and/or immunohistochemistry on individual cryosections derived from early-stage zebrafish embryos. Here we describe the use of sequential rounds of immunofluorescence, imaging, immunohistochemistry, imaging for a single cryosection in order to achieve precise identification of protein expression at the single-cell level. This methodology is suitable for any study in early-stage zebrafish embryos that requires accurate identification of multiple protein targets in individual cells.

This protocol demonstrates sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosections from early-stage zebrafish embryos enabling precise colocalization analyses in specific cell populations.

מרפאוולוגיה רציפה ואימונוהיסטוכימיה על קריוסינות עוברי דג

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...