פרוטוקול זה מדגים הליך חדשני עבור immunofluorescence רציף אימונוהיסטוכימיה על cryosections מן embroys דגי זברה בשלב מוקדם, המאפשר ניתוחי לוקליזציה מדויקת באוכלוסיות תאים ספציפיות. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא הגמישות שלו. הוא משלב טכניקות אימונופלואורסצנטיות ואימונוהיסטוכימיה באמצעות קריוסקופיה אחת כדי למקסם את מורפולוגיה של רקמות, לוקליזציה שותף של ביטוי ותאימות נוגדנים.
פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על דגים אחרים או מודלים אמפיביים כמו חוקרים אלה לעתים קרובות להתמודד עם סיבוכים דומים עם זמינות נוגדנים ולעתים קרובות לבצע סוגים דומים של ניסויים. עבודה עם cryosections עובר בשלב מוקדם יכול להיות מסובך שכן הם קטנים cryosectioning יכול להיות מאתגר, אבל הכנה מתקדמת ותרגול יעזור להקל על כל מאבקים בשיטה זו. ישנם שלבים מרובים בפרוטוקול שלנו הדורשים טיפול וטיפול מסוימים והוא יכול להיות קשה לשלוט מבלי לראות מישהו להדגים את הטכניקות.
כדי להתחיל, להעביר הקודם קבוע ומוכן ארבעים ושמונה שעות לאחר הפריה עוברי זברה כימרית מצינור עם 15 25 OCT תערובת לתבנית פלסטיק באמצעות מדפים למזער כל העברה של התערובת. ממלאים את התבנית כמחצית עם מדיום OCT ומערבבים בעדינות את העוברים בה. הכינו תבניות פלסטיק מסומנות והעבירו את העוברים הרצויים לתבניות הפלסטיק הריקות המסומן, תוך מזעור השאיבה של מדיום OCT.
ואז בעדינות למלא עם מדיום OCT לראש התבניות עם עוברים. עבודה תחת מיקרוסקופ סטריאו אור עבור הדמיה, להשתמש במחטים כדי לארגן עוברים בכיוון הרצוי. לאחר מכן מניחים את התבניות המוכנות במיכל מבודד עם פלטפורמת מתכת ומקפיאים אותן על קרח יבש.
מניחים דלי קרח בעדינות על פלטפורמת המתכת כדי ליצור תא קר להקפיא במשך כ 30 דקות. באמצעות קריוסטט להגדיר מינוס 20 מעלות צלזיוס, לחתוך את העוברים מוטבע 10 כדי 12 micrometer קריוסקופים עבים תוך בדיקת עומק החלק מעת לעת על מיקרוסקופ כדי לפקח על מיקום ורקמות. מניחים את החלקים על מגלשות זכוכית טעונות ואוויר לייבש אותם בטמפרטורת החדר לילה.
לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך חמש דקות ב 1X PBS במיכל מתאים. הניחו את השקופיות על משטח שטוח בתא לח. השתמש בעט מחסום כדי לחלק לרמות את המקטעים כדי לשמור נוזל על השקופיות.
פיפטה 200 מיקרוליטרים של מאגר בלוקים לכל מקטע ודגירה במאגר בלוקים למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. מכינים את דילול הנוגדנים העיקרי וחוגרים ומערבבים היטב על ידי צינורות. להטות בעדינות את השקופיות כדי לנקז את מאגר הבלוק ולחזור לתא הלח.
פיפטה 200 microliters של פתרון נוגדנים ראשוני לכל קטע על השקופיות ו 200 microliters של חיץ בלוק אל החלקים המתאימים כבקרה. הדגירה את המגלשות בארבע מעלות צלזיוס לילה בתא לח מלא במים deionized הקפד לאטום את הקצוות של התא כדי לעזור לשמור על לחות. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך חמש דקות ב 1X PBS במיכל מתאים.
מכינים את דילול הנוגדנים המשני במהלך הכביסה וחוגרים ומערבבים היטב על ידי צינורות. לאחר הנחת השקופיות על משטח שטוח בתא לח, להוסיף 200 microliters של פתרון נוגדנים משני לכל קטע. הדגירה את המגלשות בתת פתרון נוגדנים משני בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות.
לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך חמש דקות ב 1X PBS במיכל מתאים. לאחר הנחת השקופיות על משטח שטוח, מוסיפים את תטגם הכתמים הגרעיני על כל קטע ומכסים אותו במשך 10 דקות. לאחר ניקוז פתרון הויטראז' הגרעיני, הר את המגלשות עם מדיה פלורסנטית לא מקשיחה ותפתק כיסוי זכוכית.
הקפד לשמור אותם בחושך בארבע מעלות צלזיוס עד הדמיה. מניחים את השקופיות במיכלים בודדים עם PBS 1X ולאחסן שטוח בארבע מעלות צלזיוס לילה, תוך תסיסה בעדינות כדי לשחרר את הכיסוי מחליק מספיק כדי שהם ירדו כאשר נסער. הקפד לא ללחוץ על תלוש הכיסוי או לנסות להסיר את החלקת הכיסוי באופן ידני, אך המתן עד שהם יורדים עם תנועה כפויה מינימלית.
לאחר הסרת תלושי הכיסוי, העבר בעדינות את השקופיות למיכל עם PBS 1X טרי. הסירו את ה-PBS 1X והדקירו את השקופיות בתמיסת מלח עם חיץ טריס 1X עם 0.1% של חומר שטח לא יוני שלוש פעמים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הדגירה את המגלשות בתסמת מי חמצן של 3% בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
לאחר מכן להניח את השקופית שטוחה ולהוסיף מאגר בלוק טיפה חכם על פני השטח. הקצה בעדינות את השקופיות כדי לנקז את מאגר החסימות. מייבשים את האזור סביב החלקים ומ מניחים את המגלשות בתא לח.
מוסיפים 200 מיקרוליטרים של תותב נוגדנים ראשוני לכל חלק על המגלשות ודגירה בתא לח בארבע מעלות צלזיוס בן לילה. בעדינות להטות את השקופיות כדי לנקז את פתרון הנוגדנים העיקרי לשטוף פעמיים במשך חמש דקות ב 1X TBST. לאחר מכן להחיל מוכן להשתמש ברקע הפחתת חסימת רגנט טיפה חכם לכל קטע, ו דגירה בתא לח בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
הקצה בעדינות את השקופיות כדי לנקז את מאגר החסימות. ייבשו בזהירות את האזור סביב החלקים והצבו את המגלשות שטוחות בתא לח. יש למרוח תסימון נוגדנים משני לכל חלק ולהדגור בתא לח בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
בעדינות להטות את השקופיות כדי לנקז את פתרון הנוגדנים המשני לשטוף פעמיים במשך חמש דקות ב 1X TBST. לאחר ייבוש האזור סביב המקטעים, מניחים את השקופיות על משטח שטוח ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של המצע הכרומוגני HRP לכל מקטע. התחל שעון משנה כאשר המצע הוחל על השקופית הראשונה ודגירה בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות.
רוקן את פתרון המצע. שוטפים את השקופיות בקצרה במיכל מתאים עם PBS 1X ולשטוף אותם במים deionized פעמיים במשך חמש דקות עם תסיסה עדינה. נטרל את השקופיות על ידי הצבתן בתווית הכתמת המטוקסילין למשך עד 30 שניות ושטף שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת במים מיונים.
להדק את המגלשות במיכל המכיל טאפווטר של סקוט במשך דקה אחת ולאחר מכן לשטוף שוב שלוש פעמים במשך חמש דקות במים deionized. לייבש את המגלשות דרך סדרה של ציוני אתנול מדולל במים deionized וקצילן במכסה המנוע כימי. לאחר הסרת השקופיות מ xylene מיד להוסיף מדיום הרכבה מבוסס toluene ולהמקם להחליק כיסוי.
כדי להבטיח הצלחה בעת כיסוי מחליק, חשוב לעבוד מצד אחד של השקופית לצד השני תוך הורדת לאט את החלקת הכיסוי כדי למנוע בועות אשר לטשטש את הרקמה. לבסוף, דמיינו ודמיין את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ אור מורכב ומצלמה דיגיטלית בהגדלה של פי 100. נוגדנים ספציפיים המשמשים כאן לגילוי בו זמנית של תאים מתרבים ותאי תורם שזוהו וכמתו תאים תורמים המתרבים באופן פעיל.
לאחר שפעת חיסונית ואימונוהיסטוכימיה חיוני ליצור תמונות באיכות גבוהה על מנת לזהות במדויק תאים בודדים. תוכנית לניתוח תמונות שימשה לביצוע שכבת-על של תמונה. בעת ניסיון הליך זה חשוב ביותר כראוי כתם נגד כתמים שקופיות במהלך אימונוהיסטוכימיה.
לאחר הליך זה ניתן לבצע שיטות נוספות כשינויים בפרוטוקול המקורי, כגון שימוש בשילובי נוגדנים שונים, סוגי רקמות או מינים שונים. ניתן גם לנתח תמונות במגוון דרכים להשגת נתונים רלוונטיים. טכניקה זו אפשרה לנו להסתכל על לוקליזציה שותף ורקעים גנטיים מרובים כדרך לחקור אינטראקציות בין תאים לתאים ונוכל ליישם באופן דומה לטכניקות אחרות הדורשות ניתוח מפורט של לוקליזציה.
רבים מהריגנטים באימונוהיסטוכימיה מסוכנים ויש לטפל בהם בהתאם. עבודה עם אתנול, קסילן, הרכבה נוקשה צריך להתבצע בשכונה. פסולת DAB יש להיפטר כמו פסולת מסוכנת ושטיפת דואר DAB צריך להיות מולבן.
