We are grateful to Chau-Ti Ting (Fly Core in Taiwan) for providing the monoclonal 4D9 antibody, Technology Commons (TechComm) of the College of Life Science NTU for confocal microscopy, Hsiao-Ling Lu for proofreading the manuscript, and Chen-yo Chung for helping filming. CC particularly thanks Charles E. Cook for providing strategic suggestions and for critical editing of the manuscript. This work was supported by the Ministry of Science and Technology (101-2313-B-002-059-MY3 and 104-2313-B-002-022-MY3 for GWL and CC), and the National Taiwan University (NTU-CESRP 101R4602D3 for CC; 103R4000 for GWL).

1. תרבות של כנימות הערה:. זן המעבדה של כנימת אפון המשריצה פרתנוגנטית pisum נאסף במקור בטייוואן המרכזי וכבר גדל על צמחי מארח (sativum Pisum האפונה הגינה או פול שעועית הרחב) תחת photoperiod ארוך יום ליותר מ -300 דורות (דור אחד: ~ 10 ימים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נביטה של ​​זרעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את הזרעים של צמחי מארח במים ברז למשך 3-5 ימים על RT. למלא במים טריים פעם ביום. הערה: לחלופין, לשים זרעים של צמחי מארח ישר לתוך אדמה לחה יכול לגרום לנביטה גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול זרעים נובטים 10 בסיר קטן (בקוטר סנטימטר 9 x 7 ס&quot;מ) עם אדמה בתא הצמיחה תחת photoperiod 16 שעות אור / חושך שעה 8 ב 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ -10 ימים לאחר הצמיחה מתחילה, להעביר כנימות על צמחים שגובהם הוא יותר מ -8 סנטימטרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הכנימות <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור כל סיר של צמחים בתוך כוס זכוכית 1 ליטר, להעביר 8 כנימות בוגרות על צמחים באמצעות מכחול, ולאחר מכן לאטום את הכוס עם חיפוי אווירי חדירה כגון רשת גזה כדי למנוע כנימות לברוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כנימות בתא צמיחה תחת photoperiod 16 שעות אור / חושך שעה 8 ב 20 ° C. מים בכל עציץ של צמחים אחת ליום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת הדור הבא של כנימות, לחזור צעדי 1.1.3-1.2.2 עשרה ימים לאחר העברת הכנימה העיקרית. </li></ol></li></ol> 2. Dissection וקיבוע של השחלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להכין paraformaldehyde% 4 (PFA) ב1x שנאגרו מלוח פוספט (PBS) כחיץ הקיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא גם אחד של צלחת מקום עם PFA (כ -500 μl), למקם את הצלחת תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה נמוכה, ולצלול כנימה בוגרת בתוך PFA לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח השחלות על ידי מחזיק את הראש והבטן עם סט אחד של מלקחיים, חיתוך פתוח הגבציפורן של הבטן, וגורר את השחלות מחלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן שלושה זוגות של השחלות בצינור 1.5 מיליליטר המכיל 1 מיליליטר של PFA ב RT במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ קיבעון למזוג עם טפטפת העברה (או זכוכית או חד פעמי) ולאחר מכן לשטוף השחלות עם 0.2% TritonX-100 ב 1x PBS (PBST) 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד. קל רועד במיקסר / הכתף (זווית סיבוב: 60 ° (F60) מהירות / סיבוב: 8 סל&quot;ד) מומלץ לשני קיבעון וכביסה. </li></ol> 3. טיפול בproteinase K (PK) כדי להגדיל את החדירות של רקמות עובריים הערה: טיפול PK מוחל על עוברים מהארכה ואילך להקה נבט (שלב 11 של פיתוח). לעוברים צעירים, בשלב זה הוא אופציונאלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרתי לדלל את פתרון המניות של PK (10 מ&quot;ג / מיליליטר) עם 1x PBS ל1 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז עבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השחלות עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר של PK (כ -500 μl) במשך 10 דקות עם רעד קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> soluti למזוג PKעל ולאחר מכן לשטוף את השחלות עם 700 μl של גליצין (2 מ&quot;ג / מיליליטר) 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף השחלות עם PBST 0.2% פעמיים במשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן השחלות שוב עם חיץ קיבעון במשך 15 דקות ב RT עם רעד קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולשטוף השחלות עם PBST 0.2% פעמיים במשך 10 דקות כל אחד. </li></ol> 4. מתנול דגירה לפעילות דיכוי peroxidase אנדוגני (POD) הערה: הדגירה מתנול אינה מוחלת על עוברים נתון לאפיטופים מכתים או נוגדן Phalloidin שמתנול רגיש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרנו ליבש השחלות עם אחוז שונה של מתנול בPBST% 0.2 (V / V: 1: 3, 1: 1, 3: 1) על ידי דוגרים השחלות בכל ריכוז של פתרון מתנול במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים השחלות עם מתנול 100% עבור שעה 1 ב RT עם רעד קל. הערה: אפשר עדיין להשיג תוצאות משביעות רצון של מכתים מרקמות כנימה שאוחסנו במתנול 100% ב -20 ו# 176; C למשך חודש אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרנו רעננות השחלות עם אחוז שונה של מתנול בPBST% 0.2 (V / V: 3: 1, 1: 1, 1: 3) על ידי דוגרים השחלות בכל ריכוז של פתרון מתנול במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה. </li></ol> 5. נוגדן מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את פתרון 10x חסימה מסט החיץ מבוסס DIG (DIG-B) ל1x. הערה: פתרון חסימת 1x DIG-B הוא יעילה יותר להפחתת הרקע מכתים מאשר מגיב הסטנדרטי החסימה המורכבת של 5% (V / V) בסרום עז נורמלי (NGS) ו -0.5% (V / V) אלבומין בסרום שור (BSA ) בPBST 0.2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השחלות עם פתרון 1x DIG-B החסימה ל2.5-4 שעות על RT או O / N ב 4 ° C עם רעד קל. הערה: לשלושה זוגות של השחלות בצינור 1.5 מיליליטר, 200 μl הוא הנפח המינימאלי לחסימת מדגם ומכתים נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant ולהחליף עם פתרון 1x DIG-B חסימה טרי המכיל נוגדן ראשוני בdiluti המתאיםעל יחס. להכתים את השחלות ל4 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C עם רעד קל. הערה: לניסוי המתואר כאן, השתמש בדילולים אופטימליים הבאים של נוגדנים עיקריים: (1) נוגדן ApVas1: 1: 500 לצביעת chromogenic, 01:50 למכתים immunofluorescence; (2) נוגדן אנטי-טובולין α: 1: 500; (3) נוגדנים חד שבטי 4D9: 01:25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף השחלות עם PBST 0.2% 4 פעמים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השחלות עם פתרון 1x DIG-B חסימה עבור שעה 1 ב RT עם רעד קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant ולהחליף עם פתרון DIG-B חסימה טרי 1x המכיל נוגדנים משני ביחס דילול מתאים. להכתים את השחלות ל4 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C עם רעד קל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ביחסי הדילול הבאים של נוגדנים משני: (1) למכתים immunofluorescence: 1: 500 לIgG אלקסה פלואוריד 633 עיזים נגד ארנב או אלקסה פלואוריד 488 עיזים אנטי העכבר IgG; (2) לצביעה chromogenic: 1: 200 לIgG נגד ארנב העז biotinylated. הערה: הנוגדנים משני biotinylated מוחל לאינטראקציה עם avidin ביוטין-המורכב (ABC) בזיהוי מבוסס המצע (chromogenic), שדרכו אותות הצביעה מוגברים באופן משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים immunofluorescence, לבצע צביעה בחושך כי הנוגדנים משני הוא רגיש לאור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את נוגדנים משני עם PBST 0.2% 4 פעמים במשך 10 דקות כל אחד. </li></ol> 6. מכתים גרעיני וF- אקטין הערה: זו מיושמת רק למכתים immunofluorescence. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם השחלות עם PBST 0.2% המכיל DAPI (2 ng / μl) וPhalloidin-TRITC (100 ננומטר) לשעה 2 ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף השחלות עם PBST 0.2% 4 פעמים במשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השחלות עם O ההרכבה הבינוני / N ב 4 ° C עם רעד קל. </li></ol> 7. איתותים פיתוח הערה: זו מיושמת רק לצביעת chromogenic. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן של 100 μlמגיב avidin ביוטין-מורכב (ABC) לשיפור האותות על ידי הוספת 1 μl של מגיב (avidin) בμl 98 של PBST 0.2%, ערבוב ביסודיות באמצעות pipetting העדין, והוספת 1 μl של מגיב B (ביוטין מצומדות עם peroxidase חזרת ), ואחריו ערבוב מיידי. דגירה את התערובת למשך 30 דקות ב RT עם רעד קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השחלות (כולל תאי ביצה משויך) בתערובת של חומרים כימיים ו- B במשך 30 דקות ב RT עם רעד קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התערובת של חומרים כימיים ו- B עם PBST 0.2% 4 פעמים במשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את השחלות שקועות בPBST לטוב על צלחת המקום עם טפטפתי פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מצע של 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB): לפזר לוח DAB אחד ועוד אחד אחרת מי מכיל אוריאה מימן ב 1 מיליליטר של DDH 2 O באמצעות vortexing הנמרץ דקות 1. הערה: DAB, מצע מזרז של peroxidase, הוא אַב צֶבַע פופולרי עבור immunostaining. היא מייצרת brמשקע שלו ולא מסיס לאחר שמתחמצן על ידי peroxidase. ניתן לשפר אותות חלשים על ידי הוספת כלוריד ניקל לפתרון המצע (ריכוז סופי 0.05-.08%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון PBST שנותר בבאר ולמלא עם פתרון מצע DAB לפיתוח אות 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג עוצמת האותות תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור תגובות על ידי הסרת פתרון DAB, ואחרי מילוי עם 1x PBS באופן מיידי. חזור על לשטוף פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את השחלות חזרה לצינור 1.5 מיליליטר ולאחר מכן לשטוף עם 1x PBS או PBST פעמיים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השחלות בהרכבה בינונית מבוסס גליצרול O (70% גליצרול) / N ב 4 ° C עם רעד קל. </li></ol> 8. הרכבה עוברים בכנימות הערה: העובי של עוברי כנימה משתנה בין שלבי התפתחות. אסטרטגיות ההרכבה ובכך שונה כדי להתאים מוקדם (germaria ושלבים 0-10), אמצע (שלבים11-18), ומאוחר עוברים (שלבים 19-20), שהם הפגינו באיור 2 - D. בימוי עובריים ואחרי מיורה et al. 12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את השחלות יחד עם הרכבה בינונית למגש התא עם טפטפתי פלסטיק ולבחון דגימות תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את calyces קשור עם oviduct לרוחב באמצעות סיכות חרקים ולאחר מכן להעביר ovariole מבודד לכוס ריקה גם עם טפטפתי. מרכיבים את הנפח הסופי 50-100 μl באמצעות הרכבה בינונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את ovariole לשקופית עם טפטפתי זכוכית ולאחר מכן לנתח תאי ביצה באמצעות סיכות חרקים. הערה: לעוברים מבוגרים משלב 6 של פיתוח, הפרדת תאי ביצית הציעה; לgermaria ושני תאי הביצה הראשונים צעירים מן השלב 6, הפרדה היא אופציונלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תא ביצה גזור לשקופית נקייה באמצעות טפטפתי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים coverslip (גודל: 22 x 22מ&quot;מ) מעל germaria גזור או תאי ביצה (המכיל עובר בשלבי 1-10 של פיתוח) לאט כדי למנוע בועות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי ביצת ההר (המכילים עוברים בשלבי 11-18 פיתוח) בשקופית עם גשר coverslip חד-צדדי ומניחים coverslip אחר (גודל: 18 x 18 מ&quot;מ) בחלק העליון של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי ביצת ההר (המכילים עוברים מעל גיל 19 שלב של פיתוח) בשקופית עם גשר דו צדדי coverslip ומניחים coverslip אחר (גודל: 18 x 18 מ&quot;מ) בחלק העליון של המדגם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את החלל מתחת לcoverslip העליון עם תקשורת הרכבה כדי למנוע התייבשות המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במתינות לגלגל את העובר על ידי הזזה coverslip להשיג את הכיוון הנכון להסתכלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום מסביב לקצה של coverslips (כולל coverslips הגשר) עם לק. </li></ol> ניתוח 9. הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התערבות ההפרש לעומת זאת תצלום (DIC) תמונות של כל הר עובר עם compouND מיקרוסקופ מצויד באופטיקה דסק&quot;ש ועדשה אובייקטיבית יבשה (10X, 20X, 40X) מחוברת למצלמה. התקן את התוכנה להעברת תמונה בין המצלמה והמחשב באמצעות הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תחזיות של העוברים שכותרתו fluorescently עם מיקרוסקופ confocal לייזר סריקה 14. עקוב אחר ההוראות של היצרן לצילום, Z-ערימה, ו3D מקרין עם תוכנת הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את השקופית הפוכה, למצוא את המדגם רכוב עם 10X אובייקטיבי, ומקיף את אזור הדגימה עם עט מבוסס משומן בסדר. הערה: זה עושה את זיהוי המדגם קל יותר כאשר הוא מחפש את זה דרך יעדים של מיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף טיפה של שמן על החלק העליון של אזור coverslip שהצד נגדי מתויג כמתואר ב9.2.1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את מישור המוקד ב40X מטרת נפט טבילה ואז לשנות למטרת נפט טבילה 63X. באופן ידני להעביר את השליטה להתמקד בסדר ולעשותwn כדי ללכוד את מישור המוקד הטוב ביותר. הערה: להתבוננות פרטים מבניים של germaria ועוברים מוקדמים, אנו ממליצים להשתמש 40X יעדים או אלה עם הגדלה גבוהה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את העובר בערוצי עירור שונים ולקבל תמונת Z- מחסנית. הערה: לרקמות כנימת אפון, להפחית את עוביו של כל סעיף אופטי עד 1.5 מיקרומטר או פחות. </li></ol>

<ol>
	<li>Blackman, R. L., Minks, A. K., Harrewijn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproduction,+cytogenetics+and+development.">Reproduction, cytogenetics and development.</a> Aphids: their biology, natural enemies. , 163-195 (1987).</li><li>Davis, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclical+parthenogenesis+and+viviparity+in+aphids+as+evolutionary+novelties.">Cyclical parthenogenesis and viviparity in aphids as evolutionary novelties.</a> J. Exp. Zool. 318, 448-459 (2012).</li><li>The International Aphid Genomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum.">Genome sequence of the pea aphid Acyrthosiphon pisum.</a> PLoS Biol. 8 (2), e1000313 (2010).</li><li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+there+yet?+Tracking+the+development+of+new+model+systems.">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends Genet. 24 (7), 353-360 (2008).</li><li>Chang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apvasa+marks+germ-cell+migration+in+the+parthenogenetic+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum+(Hemiptera:+Aphidoidea)).">Apvasa marks germ-cell migration in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea)).</a> Dev. Genes Evol. 217 (4), 275-287 (2007).</li><li>Chang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+identification+of+gene+transcripts+in+aphids:+Protocols+and+evaluation+of+probe+accessibility.">Whole-mount identification of gene transcripts in aphids: Protocols and evaluation of probe accessibility.</a> Arch. Insect Biochem. 68 (4), 186-196 (2008).</li><li>Chung, C. Y., Cook, C. E., Lin, G. W., Huang, T. Y., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+protocols+for+whole-mount+fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+in+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum:+a+comprehensive+survey+and+analysis.">Reliable protocols for whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) in the pea aphid Acyrthosiphon pisum: a comprehensive survey and analysis.</a> Insect Sci. 21 (3), 265-277 (2014).</li><li>Mutti, N. S., Park, Y., Reese, J. C., Reeck, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+knockdown+of+a+salivary+transcript+leading+to+lethality+in+the+pea+aphid,+Acyrthosiphon+pisum.">RNAi knockdown of a salivary transcript leading to lethality in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum.</a> J. Insect Sci. 6, 38 (2006).</li><li>Jaubert-Possamai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knockdown+by+RNAi+in+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum.">Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum.</a> BMC Biotechnol. 7, 63 (2007).</li><li>Sapountzis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insight+into+the+RNA+interference+response+against+cathepsin-L+gene+in+the+pea+aphid,+Acyrthosiphon+pisum:+Molting+or+gut+phenotypes+specifically+induced+by+injection+or+feeding+treatments.">New insight into the RNA interference response against cathepsin-L gene in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum: Molting or gut phenotypes specifically induced by injection or feeding treatments.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 51, 20-32 (2014).</li><li>Braendle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin+and+evolution+of+bacteriocytes+in+the+aphid-Buchnera+symbiosis.">Developmental origin and evolution of bacteriocytes in the aphid-Buchnera symbiosis.</a> PLoS Biol. 1 (1), e21 (2003).</li><li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+parthenogenetic+and+sexual+embryogenesis+of+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum+(Hemiptera:+Aphidoidea).">A comparison of parthenogenetic and sexual embryogenesis of the pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea).</a> J. Exp. Zool. 295 (1), 59-81 (2003).</li><li>Chang, C., Lee, W. C., Cook, C. E., Lin, G. W., Chang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-plasm+specification+and+germline+development+in+the+parthenogenetic+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum:+Vasa+and+Nanos+as+markers.">Germ-plasm specification and germline development in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum: Vasa and Nanos as markers.</a> Int. J. Dev. Biol. 50 (4), 413-421 (2006).</li><li>Koshy, A. A., Cabral, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+imaging+and+analysis+of+neurons+infected+in+vivo+with+Toxoplasma+gondii.">3-D imaging and analysis of neurons infected in vivo with Toxoplasma gondii.</a> J. Vis. Exp. (94), e52237 (2014).</li><li>Brisson, J. A., Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pea+aphid,+Acyrthosiphon+pisum:+an+emerging+genomic+model+system+for+ecological,+developmental+and+evolutionary+studies.">The pea aphid, Acyrthosiphon pisum: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies.</a> Bioessays. 28 (7), 747-755 (2006).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In-situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Method. Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li><li>Wolff, C., Sommer, R., Schroder, R., Glaser, G., Tautz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+divergent+expression+aspects+of+the+Drosophila+segmentation+gene+hunchback+in+the+short+germ+band+embryo+of+the+flour+beetle+Tribolium.">Conserved and divergent expression aspects of the Drosophila segmentation gene hunchback in the short germ band embryo of the flour beetle Tribolium.</a> Development. 121 (12), 4227-4236 (1995).</li><li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+in+situ+hybridization+techniques+in+zebrafish.">Double in situ hybridization techniques in zebrafish.</a> Methods. 23 (4), 345-358 (2001).</li><li>Lin, G. W., Cook, C. E., Miura, T., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+localization+of+ApVas1+positions+the+preformed+germ+plasm+in+the+sexual+oviparous+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum.">Posterior localization of ApVas1 positions the preformed germ plasm in the sexual oviparous pea aphid Acyrthosiphon pisum.</a> Evodevo. 5, 18 (2014).</li><li>Straus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+peroxidase+by+methanol+and+by+methanol-nitroferricyanide+for+use+in+immunoperoxidase+procedures.">Inhibition of peroxidase by methanol and by methanol-nitroferricyanide for use in immunoperoxidase procedures.</a> J. Histochem. Cytochem. 19 (11), 682-688 (1971).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

זיהינו תנאים אופטימליים קריטיים לimmunostaining המוצלח בכנימת האפונה. Pisum, אורגניזם מודל מתעורר ללימודים הגנומי והתפתחותיים 3,15. תנאים אופטימליים להגדלת חדירות רקמות והפחתת מכתים רקע משופר העצמה וספציפיות של אותות. הם שונים מפרוטוקולים סטנדרטיים לimmunostaining במודל...

כנימות הן חרקים hemipteran עם גופים רכים (1-10 מ&quot;מ) קטנים. הם ניזונים צמחים על ידי מציצת לשד השיפה עם איברי פה פירסינג. בנוסף, הם מסתמכים על חיידק endosymbiotic לחייב, aphidicola Buchnera, לסנתז חומצות אמינו חיוניות שחסרות בתזונת SAP השיפה. יש כנימות היסטורית חיים מורכבות הכוללת רבייה משריצה פרתנוגנטית במהלך האביב וphotoperiods ארוך ביום הקיץ ורבייה מינית מֵטִיל בֵּיצִים מופעלת על ידי photoperiods קצר-היום שבמהלכו הם שכבו במספר מוגבל של ביצי overwintering 1,2. באביב ביצים אלה בוקעים לייצר הדור הראשון של כל הנקבה הכנימות (fundatrices), הבאות סיבובים רבים של רבייה פרתנוגנטית עד סתיו. רביית הבתולים המחזוריות בכנימות, שם חלופי שלבים מיניים ומיניים במחזור החיים השנתי, כבר נחשבו 1,2 חידוש אבולוציוני. בכנימות המשריצות פרתנוגנטית, עובר מתרחש בתוך תאי ביצה של צינוריות השחלות (ovarioles). לעומת זאת, עובר מֵטִיל בֵּיצִים מיני לפתח בביציות המופרות. מלבד פלסטיות רבייה, כנימות יכולות להציג polyphenism אגף הבין דור: בתגובה לאותות צפיפות ואיומי טורף, הנקבות מיניות unwinged יכולות viviparously לייצר צאצאים מכונפים להגירה למרחקים ארוכים. פרסום רצף הגנום של כנימת אפון Acyrthosiphon pisum חור&#39; רצף הגנום הראשון לבסיס חרקים מאפשר hemimetabolous חקירה נוספת של פלסטיות רבייה, polyphenism אגף, ותכונות אחרות כוללים אינטראקציות חרקים צמח, vectoring הנגיפי וסימביוזה בכנימות על מולקולרי בסיס 3. בנוסף להגנום רצף, כלים לאפיון ביטוי גנים ותפקוד נדרשים לקידום כנימת האפונה כאורגניזם מודל בוגר 4. שתארנו פרוטוקולים חזקים של כל הר <em&gt; הכלאה באתר לאיתור ביטוי של mRNA בעוברי כנימה 5-7. התערבות RNA (RNAi) באמצעות הזרקת RNA פעמיים תקועים והאכלה שמשה במשך השתקת גנים בנימפות כנימה ומבוגרים, אבל תנאים יציבים לגן מציאה בעוברים לא דווחו 8-10 עדיין. Immunostaining, גישה מבוססת נוגדנים שיכולים לזהות ביטוי חלבון בדגימות לפני ואחרי מציאה RNAi, שבוצע בעוברי כנימת האפונה 11-13. עם זאת, גידול בשיעור של חדירות וחיסול מכתים רקע רקמה הוא עדיין לא מספק תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים לimmunostaining בעוברים המשריצים מיניים של כנימת האפון. לדוגמא, מצאנו כי החדירה של נוגדן לרקמות ירידה בעוברי gastrulating (שלבי 8-10) ושעובר עם ניצני איבר מורפולוגית לזיהוי (שלבי 13-14) היו בקושי חדיר לנוגדן. בנוסף, מכתים רקע היה דמיין בviviparo מינישלנו עובר כנימת אפונה מוכתמת באמצעות נוגדנים נגד סמן germline Vasa כמו גם שנגד חלבון Engrailed / Invected הביע במגזרים העובריים 12,13. למעשה מכתים רקע עדיין היה נראה בבירור בעוברים מוכתמים עם הנוגדנים משני בלבד. על מנת להגדיל את החדירות מבלי לפגוע שלמות רקמות כנימה, אנחנו טיטרציה זהירות ריכוז proteinase K ונקבעו תנאים אופטימליים לעיכול רקמה על עוברי כנימה. על מנת להימנע מהכתמה אינה ספציפית בכנימת האפון, חיפשנו תרכובות שיכולים לחסום ביעילות עוברים ולדכא פעילות של peroxidase אנדוגני (POD), אנזים מועסק להגברת אותות במהלך immunostaining. מגיב חסימה הניתן על ידי קבוצת חיץ מבוססת digoxigenin (DIG), ולא עז בסרום הנורמלי משמש באופן מסורתי (NGS) / אלבומין בסרום שור (BSA), צמצם באופן משמעותי מכתים רקע. יתר על כן, מתנול נמצא inhiנשך את פעילות POD אנדוגני בצורה יעילה יותר מאשר מי חמצן (H 2 O 2). פרטים בדבר תנאי כנימה ספציפית אלה לimmunostaining על עוברים יהיו מתוארים בסעיפים הבאים.

<table><tbody><tr><td>30% hydrogen perxidase (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18304</td><td>For bleaching endogenous peroxidase of embryos.</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td></tr><tr><td>4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody</td><td>Developmental studies hybridoma bank</td><td>AB_528224</td><td>For labeling the developing segments of embryo.</td></tr><tr><td>ApVas1 rabbit polyclonal antibody</td><td>Our laboratory</td><td>N/A</td><td>For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Austerlitz Insect pins</td><td>ENTOMORAVIA</td><td>N/A</td><td>For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>For blocking the non-specific binding of antibodies.</td></tr><tr><td>Camera connted to compound microscope</td><td>Canon</td><td>EOS 5D</td><td>For photographing of aphid embryos.</td></tr><tr><td>Colorimetric 8 cell tray</td><td>Kartell Labware</td><td>357</td><td>For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.</td></tr><tr><td>Compound microscope with DIC optics</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMR</td><td>For photographing of aphid embryo mounted on the slides.</td></tr><tr><td>DIG Wash and Block Buffer Set</td><td>Sigma-Aldrich (Roche)</td><td>11585762001</td><td>For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Ideal-tek</td><td>N/A</td><td>For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass dropper</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4&quot; of tip length.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>For clearing of aphid embryos and mounting.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>N/A</td><td>For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>For detection of primary antibody from mouse.</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>For detection of primary antibody from rabbit.</td></tr><tr><td>Intelli mixer</td><td>ELMI laboratory equipment</td><td>RM-2M</td><td>For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.</td></tr><tr><td>Laser-scanning confocal microscopy</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.</td></tr><tr><td>methanol&amp;nbsp;</td><td>Burdick and Jackson</td><td>AH2304</td><td>For bleaching endogenous peroxidase of embryos.</td></tr><tr><td>Microscope slides&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>10143560</td><td>For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.</td></tr><tr><td>Microscope Cover glasses</td><td>Marienfeld</td><td>0101030</td><td>For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)</td></tr><tr><td>Microscope Cover glasses</td><td>Marienfeld</td><td>0101050</td><td>For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)</td></tr><tr><td>mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32293</td><td>For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.</td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For sealing the coverslips on the slides.</td></tr><tr><td>Normal goat serum (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>For blocking the non-specific binding of antibodies.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td>For fixation of aphid ovaries.</td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td>For labeling the distrbution of F-actin on embryos.</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>As isotonic solution for aphid ovaries.</td></tr><tr><td>Plastic dropper</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Merck</td><td>124678</td><td>For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pyrex spot plate</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and&amp;nbsp; depth 7 mm.</td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3&amp;rsquo;-diaminobenzidine (DAB) tablets&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4168</td><td>For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>EZ4</td><td>For dissection and observation of aphid ovaries.</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>For creating pores (punching) on the cell membrane.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)</td><td>Vector laboratories</td><td>PK-6101</td><td>For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.</td></tr><tr><td>VECTASHIELD mounting medium</td><td>Vector laboratories</td><td>H1000</td><td>For clearing of aphid embryos and mounting.</td></tr></tbody></table>

identification of critical conditions for immunostaining in the pea aphid embryos: increasing tissue permeability and decreasing background staining

Pisum Acyrthosiphon כנימת האפון, עם הגנום רצף וגמישות פנוטיפית שפע, הפך מודל מתעורר ללימודים הגנומי והתפתחותיים. כמו כנימות אחרות,. Pisum להפיץ במהירות באמצעות רבייה משריצה פרתנוגנטית, שבו עובר לפתח בתוך תאי ביצה באופנת פס ייצור בovariole. בעבר הקמנו פלטפורמה חזקה של כל הר הכלאה באתר המאפשרת זיהוי של ביטוי mRNA בעוברי הכנימה. לניתוח הביטוי של חלבון, אם כי, הוקם פרוטוקולים לimmunostaining ovarioles של כנימות משריצות מיניות לא הניב תוצאות משביעות רצון. כאן אנו מדווחים תנאים מותאמים להגדלת חדירות רקמות ולהפחית מכתים רקע, אשר שניהם היו בעיות בעת החלת גישות הוקמו. אופטימיזציות כוללות: (1) דגירה של K (1 מיקרוגרם / מיליליטר, 10 דקות) proteinase, שנמצא F החיוניאו חדירת נוגדן בעוברי אמצע וכנימה בשלב מאוחר; (2) החלפה של אלבומין בסרום סרום עז / שור הרגיל עם מגיב חסימה מסופק על ידי digoxigenin (DIG) מבוסס חיץ להגדיר ו( 3) יישום של מתנול ולא מי חמצן (H 2 O 2) להלבנת peroxidase אנדוגני; אשר הקטין באופן משמעותי את מכתים הרקע ברקמות הכנימה. תנאים אלה קריטיים מותאמים לimmunostaining יאפשר איתור יעיל של מוצרי גן בעוברים של. pisum וכנימות אחרות.

במחקר זה, ביצענו שלם ההר-immunostaining על עוברים של כנימות מיניות אפונה (איור 1 א). נקבות אלה לייצר צאצאי רביית בתולים וviviparously. נקבת עוברים אלה מתפתחים בתוך תאי ביצה של צינוריות השחלות (ovarioles) (איור 1 ואיור 2 א). לפני מיקרוסקופיה, ovario...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining at JoVE.c

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

זיהוי של תנאים קריטיים לImmunostaining באפונה בכנימות עוברים: הגדלת רקמות חדירות והפחתת מכתים רקע

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

identification-critical-conditions-for-immunostaining-pea-aphid

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K Views.  National Taiwan University. A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Video: Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול ב<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biology

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; עובר

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of genetic manipulations with this model has supplanted pharmacological approaches that are commonplace in other animal models and cell-based assays. Here we describe recent advances in a protocol that enables application of small molecules to the developing fruit fly embryo. The method details steps to overcome the impermeability of the eggshell while maintaining embryo viability. Eggshell permeabilization across a broad range of developmental stages is achieved by application of a previously described d-limonene embryo permeabilization solvent (EPS1) and by aging embryos at reduced temperature (18 &#176;C) prior to treatments. In addition, use of a far-red dye (CY5) as a permeabilization indicator is described, which is compatible with downstream applications involving standard red and green fluorescent dyes in live and fixed preparations. This protocol is applicable to studies using bioactive compounds to probe developmental mechanisms as well as for studies aimed at evaluating teratogenic or pharmacologic activity of uncharacterized small molecules.

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Introduction of small molecules to the developing Drosophila embryo offers great potential for characterizing biological activity of novel compounds, drugs, and toxins as well as for probing fundamental developmental pathways. Methods described herein outline steps that overcome natural barriers to this approach, expanding the utility of the Drosophila embryo model.

שיטה של ​​permeabilization של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים למבחנים של מולקולה קטנה פעילות

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

זיהוי של תנאים קריטיים לImmunostaining באפונה בכנימות עוברים: הגדלת רקמות חדירות והפחתת מכתים רקע

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ'יק

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

הר שלם

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב

שיטה של permeabilization של

זיהוי של תנאים קריטיים לImmunostaining באפונה בכנימות עוברים: הגדלת רקמות חדירות והפחתת מכתים רקע

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ'יק

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

הר שלם

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב

שיטה של ​​permeabilization של

שיטה של permeabilization של