פרוטוקול in situ שלנו הוא משמעותי כי הוא מספק דרך פשוטה לדמיין דפוסי ביטוי גנים עם כתמי רקע מינימליים. טכניקה זו הופכת פרוטוקול מסובך וממושך לקל יחסית לביצוע. Benchtop להגדיר הצעות ורשימות פעולות לביצוע בתנאי להפוך פרוטוקול זה אפילו קל יותר לבצע כראוי לשכפל.
בעוד הטכניקות המוצגות כאן הוא ספציפי Astyanax mexicanus, זה יכול להיות מותאם למערכות אחרות של אנשים בגודל יחסית עם התאמות קטנות לפרוטוקול. ראשית, השתמש בקלטת מעבדה צבעונית כדי לייעד בקבוקונים ופיפטות עבור כל גן. באמצעות פיפטה פסטר, למיין את העוברים.
בדרך כלל יש לא יותר מ 12 עוברים לכל בקבוקון, פעם מיון. לאחר מכן, להגדיר אמבט מים רועדים ל 70 מעלות צלזיוס. משוך בזהירות את המתנול בבקבוקונים של עוברים ממוינים, והחלף אותו ב-500 מיקרוליטרים של מתנול טרי של 100%.
לשטוף את העוברים לזמן קצר במשך כדקה על שייקר פלטפורמה. לאחר מכן, rehydrate העוברים בריכוז הולך וגדל של 1x PBS עם Tween 20 על שייקר פלטפורמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל, מניחים אטם קטן עם תחתית רשת לתוך אמבט המים המסתובב שחומם מראש ל 70 מעלות צלזיוס.
מניחים aliquots של חיץ הכלאה מינוס ומאגר הכלאה בתוספת לתוך אטם. הוסיפו בעדינות פתרון PK מוכן לבקבוקונים של עוברים המבטיחים שכל הרקמות מכוסות לחלוטין בתסיסה. מעבירים את הבקבוקונים לשייקר פלטפורמה ותנו להם לעכל את פתרון העבודה של proteinase K במשך כ-12 דקות.
לאחר מכן, משוך בעדינות את פתרון ה- PK והציף בקצרה את הבקבוקון ב- PBT כדי לדלל את ה- PK הנותר. החלף את פתרון PBT עם 500 microliters של PBT טרי ולתת את הפתרון לשטוף על שייקר פלטפורמה במשך חמש דקות. לאחר מכן החלף את פתרון PBT ב-500 מיקרוליטרים של 4%PFA מופשרים. תן לעוברים דגירה על שייקר הרציף בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
כדי להתחיל בהכלאה מראש, הוסף 500 מיקרוליטרים של חיץ הכלאה טרום המלחמה מינוס פתרון לבקבוקונים המכילים עוברים. בזהירות למקם את הבקבוקונים לתוך אטם באמבט המים ב 70 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד במשך חמש דקות. הבא למשוך את חיץ ההכלאה מינוס פתרון להציף את הבקבוקונים עם 500 microliters של מאגר הכלאה מראש המלחמה בתוספת פתרון.
מניחים את הבקבוקונים בחזרה לתוך אטם באמבט המים דגירה עם רועד או במשך ארבע שעות או לילה. כדי להתחיל בהכלאה, משוך את מאגר ההכלאה פלוס מתוך הבקבוקונים והחלף אותו ב-500 מיקרוליטרים של מאגר הכלאה טרי לפני המלחמה פלוס. בזהירות להוסיף שני microliters של בדיקה RNA לכל בקבוקון בעדינות מערבולת כדי להבטיח הפצה שווה של החללית.
דגירה באמבט המים ב 70 מעלות צלזיוס לילה תוך כדי רעידות ב 40 סל"ד. כדי להתחיל, להכין צינורות microcentrifuge שכותרתו מאגר הכלאה פלוס עם הגן של בדיקה RNA עניין כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הגדר שני צינורות חרוט 15 מיליליטר ולהוסיף 0.2 גרם של reagent חסימה ו 10 מיליליטר של MABT.
מניחים את שני הצינורות על מערבל אגוזים עד שהריג'נט מומס לחלוטין בתמיסה. באמצעות פיפטה פסטר זכוכית לצייר את חיץ הכלאה פלוס פתרון בדיקה ולמקום אותו לתוך צינור microcentrifuge סטרילי שכותרתו. אחסן צינור זה במקפיא במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
בזהירות להוסיף 500 microliters של ציטראט נתרן מלוחים חמים חיץ הכלאה מינוס דילול. דגירה בפתרונות רציפים במשך 10 דקות כל אחד באמבט המים הרועדים, ולאחר מכן בטמפרטורת החדר על שייקר פלטפורמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר הדגירה האחרונה, החלף את ה- PBT של 100% מכל בקבוקון ב- 500 מיקרוליטרים של MABT.
חזור על תהליך זה פעמיים במשך חמש דקות כל אחד. ראשית, להסיר את MABT מכל בקבוקון ולהציף אותו עם פתרון חסימה premixed מאחד צינורות חרוט 15 מיליליטר. מניחים את שני הבקבוקונים על מערבל האגוזים במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר.
מוסיפים שני מיקרוליטרים של שברי הנוגדנים לצינור השני של פתרון חסימה מוכן ומערבולת לזמן קצר. לאחר מכן ממלאים כל בקבוקון כמעט לחלוטין בתווית חסימה ומכניסים אותם על מערבל אגוזים לילה במקרר בארבע מעלות צלזיוס. כדי להתחיל, להכין בקבוקון מניות של 10%NGS ב MABT.
החלף את פתרון החסימה בכל בקבוקון ב- 500 מיקרוליטרים של פתרון NGS זה. דגירה בטמפרטורת החדר על שייקר הרציף במשך 25 דקות. לאחר מכן, החלף את תערובת ה- NGS ב- 500 מיקרוליטרים של 100% MABT.
דגירה על שייקר פלטפורמה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. חזור על שטיפה זו 11 פעמים נוספות לאורך כל היום, כל 30 דקות. לאחר מכן ממלאים כל בקבוקון ב-100% MABT ומכניסים אותו למיקסר אגוזי לילה במקרר ב-4 מעלות צלזיוס.
ראשית, החלף את MABT בכל בקבוקון עם מיליליטר אחד של חיץ AP ולתת לו לשטוף במשך חמש דקות. חזור על שטיפה זו פעמיים כדי להסיר לחלוטין את MABT. לאחר מכן החלף את מאגר AP במיליליטר אחד של מאגר AP טרי המכיל 3.5 מיקרוליטר של BCIP ו- 4.5 מיקרוליטר של MBT.
החלף זאת בתערובת טרייה של מאגר AP המכיל את BCIP ו- MBT כל שעה עד להשלמת התגובה, הקפד לעקוב מקרוב אחר התגובה ולבדוק כל 15 דקות עד לרמת הכתמים הרצויה. עצור את תגובת הצבע על ידי שטיפת העוברים בריכוז הולך וגדל של PBT 1X במאגר AP כמתואר בפרוטוקול. שוטפים את העוברים בכ-5 מיליליטר של 100%PBT על מערבל אגוזים עד להכתמת הרקע המינימלית הרצויה.
כאשר השטיפה הושלמה, לשטוף את העוברים ב 500 microliters של PBS סטרילי על שייקר פלטפורמה ו postfix הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר שטיפה העוברים, מניחים אותם בארבעה מיליליטר של 100% PBS סטרילי ואם יש צורך לאחסן אותם לטווח ארוך בארבע מעלות צלזיוס. במחקר זה דגימות Astyanax עובריות מסומנות לניתוח ביטוי גנים באיכות גבוהה.
תהליך זה יושם בהצלחה הן בעוברים של דגי מערות פקון והן בעוברים של דגי שטח. עוברי דגי מערות המסומן בביטוי Sox9 מדגימים תיוג ברור בקשתות הענפיות המתפתחות ובסנפיר החזה. שים לב כי הכתמים נעדרים כמעט בוואק החלמון או בסומיטים המתפתחים באגף.
באופן דומה, ביטוי Tfap2a ניכר בחלקים של הראש המתפתח כמו תאים סמל עצבי הגירה מוקדמת לאורך אזור האגף הגבי של העובר. הגן השלישי המוצג לעוברים של דגי מערות, Phf20a, נראה בחלקים של מסודרם סומטי וראש אחורי שנועדו ללדת רקמה גרמית. עוברי דג פני השטח המסווים ב- CXCR מראים תיוג חיובי באזורים מבודדים של הראש והאגף, כמו גם כמה תאים בודדים המגזים בשי החלמון.
הגן Adcyap1a בא לידי ביטוי באזורים של מערכת העצבים המרכזית כולל תאי יותרת המוח. שים לב לביטוי הספציפי ביותר באשכולות דו-צדדיים משויך של תאים בהיבט הגבי של העובר, כמו גם אזור גדול יותר של ביטוי קו האמצע. הגן האחרון שנבדק לעוברים של דגי מערות, Sox10, ניכר כסמן מוקדם של סמל עצבי בצד שמאל וימין של העובר הגבי.
לאחר השלמת situ, אנחנו בדרך כלל תמונה התוצאות שלנו באמצעות מיקרוסקופ אור. עדיף לעשות זאת בתוך שבועיים לאחר השלמת על מנת למנוע השפלה של כתמים.
