Name: rna purification from intracellularly grown listeria monocytogenes in macrophage cells
Uploaded: 2016-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells at JoVE.com

The research in the Herskovits lab is supported by 335400 ERC and R01A/109048 NIH grants.

הערה: במהלך הניסוי כולו, תאי מקרופאג מודגרת על 37 מעלות צלזיוס חממת 5% CO 2 כפיית אוויר ונלקחו מתוך האינקובטור רק מניפולציות ניסיון, אשר מבוצעות בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class II. עבודה עם L. חיידקי חיידקים הם בהתאם לרמת 2 תקנות בטיחות ביולוגית. Cell 1. הכנת זיהום חיידקים (יום 1 ו -2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 2.0 x 7 מח עצם נגזר 10 תאים מקרופאג (BMDM) על צלחת 145 מ&quot;מ 30 מ&quot;ל התקשורת BMDM + עט סטרפטוקוקוס (טבלה 2). צלחות זרע 3 עבור כל זן חיידקים להיות מנותחות. דגירה לילה בשעה 37 ° C באינקובטור 5% CO 2 נאלץ באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל תרבית חיידקי לילה של wild-type (WT) ל חיידקי 10403S זן ב 10 מיליליטר של עירוי לב המוח בינוני (BHI), ב 30 מעלות צלזיוס חממה סטנדרטית. צינורות תרבות מקום מלוכסנים בלי לרעוד. הערה:תנאי גידול אלה עד להסדיר את הביטוי של הגנים שוטונים, המקדמת זיהום יעיל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני טרום חמים BMDM (ללא אנטיביוטיקה פן-סטרפטוקוקוס) (לוח 2) ופוספט בופר (PBS) ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף monolayer מקרופאג פעמיים עם 25 מ&quot;ל של PBS מחומם מראש להסיר אנטיביוטיקה. הוסף 30 מ&quot;ל בינוני BMDM טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 1.5 מ&quot;ל של תרבית החיידקים לילה עם PBS על ידי צנטריפוגה החיידקים&gt; 14,000 XG דקות 1, השלכת supernatant, ו resuspending חיידקים בעדינות ב 1.5 מ&quot;ל של PBS על ידי pipetting. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק כל צלחת מקרופאג עם 0.5 מ&quot;ל של תרבות הלילה שטף של wild-type L. חיידקים. אם אתה משתמש הצלחות מרובות, להדביק כל דקות צלחת 15 זה מזה. מרווח זמן זה יאפשר קצירה כל צלחת בנפרד בסוף הזיהום. הערה: ריבוי של זיהום (משרד הפנים) הוא assayed ידי ציפוי דילול סדרתיים של תרבית החיידקים המשמשים זיהום על צלחות אגר BHI ויחידות המושבה להרכיב לספור (CFU) לאחר 24 שעות הדגירה של צלחות על 37 מעלות צלזיוס. באמצעות 0.5 מ&quot;ל של WT ל חיידקי להתאמץ תוצאות 10403S בתוך משרד הפנים של ~ 100 (100 חיידקים CFU לכל תא מקרופאג). כשמנתחי חיידקי מוטציות פגומות בצמיחה תאית, גבוה יותר משרד פנים צריך להיחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות 0.5 דגירת שעות ב 37 ° C, לשטוף את התאים הנגועים פעמים עם PBS, להסיר חיידקים פנויים, ולהוסיף 30 מיליליטר מחומם מראש בינוני BMDM. חיידקים מצורפים יפנימו במהלך 0.5 השעות הבאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה 1 זיהום hr לכתוב, להוסיף 30 μl של גנטמיצין (1: 1,000 להגיע לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) כדי להרוג חיידקים חוץ תאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את מנגנון הסינון על ידי הצבת ראש מסנן על בקבוק נוזל איסוף עם יציאת ואקום. אז במקום מסנן (0.45 מיקרומטר) על ראש המסנן, ואחריו משפך גליל ולאבטח את החלקים השונים עם ג מתכתמנורה. הכן מים קרים כקרח RNase חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 6 שעות לאחר הדבקה, חיידקי אסיף תאים נגועים כדלקמן. פנקו כל צלחת בנפרד. הערה: בדרך כלל, L. חיידקי משלים 1-יומן של צמיחה במהלך 6 שעות של זיהום בתאים מקרופאג. incubations יותר עלול לגרום לצמיחת יתר של חיידקים ומות תא של מקרופאגים, ואילו תקופות דגירה קצרות יכול לגרום המון חיידקים נמוכים משמעותי. משרד הפנים ואת הזמן של זיהום יכולים להיות שונים כדי להגיע תנאים אופטימליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים נגועים עם PBS פעם. הוסף 20 מ&quot;ל מים RNase ללא קרים כקרח כדי lyse התאים מקרופאג. באמצעות מגרד תא, לגרד את התאים את הצלחת במהירות אך בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים lysed צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. וורטקס למשך 30 שניות. צנטריפוגה ב 800 XG 3 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את supernatant דרך מכשירי סינון באמצעות שואב אבק. בעזרת פינצטה, לגלגל את מסנן ובמהירות ולהעביר אותו 15 מ&quot;ל Coniצינור קאל. צמד להקפיא את הצינורות עם המסננים בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את מנגנון סינון עם מסנן חדש למדגם הבא, כמתואר 1.2.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את המסננים קפואים ב -80 מעלות צלזיוס במשך למחרת. לחלופין, להמשיך ישירות מיצוי חומצות גרעין. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. הפקת חומצות גרעין (יום 3) הערה: בצע את כל המניפולציות עם פתרונות פנול כלורופורם במנדף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1: תערובת 1 של פנול acidified: כלורופורם, 400 μl עבור כל דגימה. מערבבים צינורות נפרדים, ולאחר מכן למשוך את השכבה המימית וכתוצאה מכך על ידי שאיפה. הוסף 40 μl של 10% SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את צינורות המכילים מסנן על קרח כדי לשמור אותם קרים. צינור אחד המכיל מסנן להוסיף 650 μl של אצטט-EDTA (AE) חיץ (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים הבאים מהר ככל האפשר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוקף מערבולת הצינור המכיל מסנן כךשמסנן whisks לפריפריה של הצינור ואת החיץ מלא רוחץ את המסנן. תמיד לשמור על צינור קר על ידי הצבת אותו בחזרה על הקרח. הערה: ייתכן שיהיה צורך גם מערבולת הצינור בעוד הפוכה כדי לשטוף את החיידקים באופן מלא את המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה עבור כל הצינורות. זה עשוי להיות שימושי כדי לסובב למטה ההשעיה זמן קצר (1 דקות ב 120 XG) בסוף התהליך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את חיץ חיידקים המכילים לצינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge המכיל את SDS ותמהיל פנול / כלורופורם (כפי שהוכנו 2.1). חזור על הפעולה עבור כל הצינורות. זה עשוי להיות נחוץ כדי לסובב את הצינורות המכילים מסנן (1 דקות ב 120 XG) שוב כדי לקבל חיץ שיורית מהמסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את כל צינורות 1.5 מ&quot;ל במכשיר מערבולת רב-צינור, מערבולת במלוא המהירות למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצינורות בתוך גוש חום C 65 מעלות במשך 10 דקות. צנטריפוגה במהירות המרבית (&gt; 14,000 XG) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השכבה המימית (כ -400 μl) מכל tUbe לצינור 1.5 מיליליטר חדש המכיל 40 μl של 3 M נתרן יצטט (5.2 pH) ו 1.0 מיליליטר של 100 אתנול%. וורטקס כל צינור ביסודיות. הערה: גליקוגן ניתן להוסיף בשלב זה כדי לשפר להדמיה של הגלולה זרזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הדגימות ב -80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לחלופין, דגירת דגימות ב -20 ° C הלילה. ואז, צנטריפוגה דגימות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות במהירות המרבית (&gt; 14,000 XG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב את אתנול (שכבה עליונה) מצינור כל. הוסף 500 μl קר 70% אתנול לטעום כל מערבולת ביסודיות. צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות במהירות מרבית (&gt; 1 4,000 XG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב את אתנול מן צינור אחד. ייבש את הדגימות עבור כ 2 דקות באמצעות מאייד ואקום ללא חום. אל מעל לייבש את הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl מים RNase ללא מדגם זה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. מערבולת ספין למטה בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ריכוז רנ&quot;א tהוא דוגם באמצעות microvolume UV-Vis ספקטרופוטומטר. מצפה לחלץ כ -0.5 - 1 מיקרוגרם של חומצות גרעין לכל צלחת. הערה: משכפל טכני ניתן לשלב בשלב זה. </li></ol> 3. DNase טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התגובה לפי טבלה 1 בתוך שפופרת microfuge. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. להוסיף 450 מים μl RNase ללא ו 500 μl של תערובת פנול-כלורופורם-רשות העתיקות (טבלה 2), שלבים נפרדים על ידי צנטריפוגה במשך 2 דקות במהירות מקסימלית (&gt; 14,000 XG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את השכבה המימית לצינור חדש ולהוסיף 500 μl תמהיל כלורופורם-רשות עתיקות (טבלה 2), מערבולת שלבים נפרדים על ידי צנטריפוגה 2 דקות במהירות מקסימלית (&gt; 14,000 XG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השכבה המימית לצינור חדשה ולהוסיף 1 מ&quot;ל של אתנול 50 μl של 3 נתרן אצטט M (pH 5.2). מְעַרבּוֹלֶת. הערה: גליקוגן ניתן להוסיף בשלב זה כדי לשפר להדמיה של הגלולה זרזה. </li><li&gt; דגירה במשך שעה 1 ב -80 ° C. לחלופין, דגירת דגימות ב -20 ° C הלילה. צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות במהירות מקסימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב את אתנול מן צינור אחד. הוסף 500 μl קר 70% אתנול לטעום כל מערבולת ביסודיות. צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות במהירות מרבית. בזהירות לשאוב את אתנול מן צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את הדגימות עבור כ 2 דקות באמצעות מאייד ואקום ללא חום. אל מעל לייבש את הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 12 μl של RNase ללא מים, דגירה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, מערבולת, ו-למטה ספין. הדגימות מכילות RNA המטוהר, ולשמור אותם על קרח. לחלופין, לפזר רנ&quot;א RNase ללא H 2 O עם 0.1 mM EDTA או חיץ TE (10 מ&quot;מ טריס, 1 mM EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ריכוזים RNA באמצעות microvolume UV-Vis ספקטרופוטומטר. צפה ~ 100 ננוגרם של רנ&quot;א לדגימה (אם משכפל טכני משולבים). הערה: RNA חילוץ על פי פרוטוקול זה מתאים FOניתוח r שעתוק הגנים על ידי מספר רב של טכניקות. אנחנו בדרך כלל להעסיק ניתוח RT-qPCR ללמוד L. חיידקי שעתוק גנים במהלך ההדבקה של תאי מקרופאג 1-4. </li></ol>

<ol>
	<li>Lobel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+regulator+CodY+links+Listeria+monocytogenes+metabolism+to+virulence+by+directly+activating+the+virulence+regulatory+gene+prfA.">The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA.</a> Mol Microbiol. , (2014).</li><li>Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomic+analysis+identifies+isoleucine+and+CodY+as+regulators+of+Listeria+monocytogenes+virulence.">Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence.</a> PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).</li><li>Kaplan Zeevi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+multidrug+resistance+transporters+and+cyclic+di-AMP,+which+contribute+to+type+I+interferon+induction,+play+a+role+in+cell+wall+stress.">Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress.</a> J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).</li><li>Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophage+excision+activates+Listeria+competence+genes+that+promote+phagosomal+escape+and+virulence.">Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence.</a> Cell. 150, 792-802 (2012).</li><li>Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+human+listeriosis.">The epidemiology of human listeriosis.</a> Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).</li><li>Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes:+a+multifaceted+model.">Listeria monocytogenes: a multifaceted model.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).</li><li>Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+listeria+monocytogenes+virulence.">Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence.</a> Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).</li><li>Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+Listeria+monocytogenes+infection:+the+intersection+of+bacterial+pathogenesis+and+cell-mediated+immunity.">The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity.</a> J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).</li><li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).</li><li>Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Mycobacterium+tuberculosis+RNAs+synthesized+in+response+to+phagocytosis+by+human+macrophages+by+selective+capture+of+transcribed+sequences+(SCOTS).">Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).</li><li>Toledo-Arana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Listeria+transcriptional+landscape+from+saprophytism+to+virulence.">The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence.</a> Nature. 459, 950-956 (2009).</li><li>Schnappinger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+Macrophages:+Insights+into+the+Phagosomal+Environment.">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment.</a> J Exp Med. 198, 693-704 (2003).</li><li>Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing-based+discovery+of+the+Chlamydia+trachomatis+transcriptome.">Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).</li><li>La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+whole+bacterial+pathogen+transcription+within+infected+hosts.">Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts.</a> FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).</li><li>Rienksma, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+insights+into+transcriptional+adaptation+of+intracellular+mycobacteria+by+microbe-enriched+dual+RNA+sequencing.">Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing.</a> BMC Genomics. 16, 34 (2015).</li><li>Afonso-Grunz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+3'Seq+using+deepSuperSAGE+uncovers+transcriptomes+of+interacting+Salmonella+enterica+Typhimurium+and+human+host+cells.">Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells.</a> BMC Genomics. 16, 323 (2015).</li><li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells.">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).</li><li>Becavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+widely+used+Listeria+monocytogenes+strains+EGD,+10403S,+and+EGD-e+highlights+genomic+variations+underlying+differences+in+pathogenicity.">Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity.</a> MBio. 5, e00969-e900914 (2014).</li><li>Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+gamma-interferon+receptor+that+regulates+macrophage+tumoricidal+activity.">Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity.</a> J Exp Med. 160, 55-74 (1984).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הפרוטוקול המתואר כאן מייצג שיטה אופטימיזציה עבור בידוד של RNA חיידקי L. חיידקי חיידקים הגדלים intracellularly בתאים מקרופאג. פרוטוקול זה מבוסס על תמוגה תא הפרש וכולל שני שלבים עיקריים להעשרת RNA חיידקים: שקיעת גרעינים מקרופאג באמצעות צנטריפוגה ואוסף מהיר של חיידקים על יד?...

חיידקים פתוגנים תאיים ─ חיידקים גורמי מחלות זיהומיות מסוגלים לגדול והתחילו להתרבות תאים בתוך צבאות האדם ─ הם דאגה בריאותית משמעותית ברחבי העולם 5. כדי לפלוש לשכפל בתוך תאים יונקים, פתוגנים תאיים רכשו מנגנוני ארסיות מתוחכמים גורמים. בעוד מנגנונים אלה הם יסוד את היכולת לגרום מחלה, אנו יודעים מעט מאוד על רגולצית הדינמיקה שלהם. מאז פרופילי ביטוי גנים של חיידקי גדלי תקשורת נוזלת אינם משקפים את הסביבה בפועל בתוך תאי מארחים, יש צורך הולך וגדל transcriptome המנתח של חיידקים הגדלים נישות התאיות שלהם. ניתוחים כאלה ייאפשרו הפיענוח של עיבודים ספציפיים חיידקים מופעלים על ידי המארח יעזרו לזהות מטרות חדשות עבור עיצוב טיפולי. ניתוח transcriptome של חיידקים גדלו intracellularly הוא מאתגר מאוד מאז RNA יונק במספרם RNA חיידקים ידי בפי עשרה לפחות. בכתב היד הזה, אנו מתארים שיטה ניסיונית לבודד RNA חיידקים מחיידקי חיידקים ליסטריה גדלו בתוך תאי מקרופאג בעכברים. רנ&quot;א החילוץ יכול לשמש כדי לחקור עיבודים תאיים ומנגנונים ארסיים של חיידקים פתוגניים על ידי טכניקות שונות של ניתוח שעתוק, כגון RT-PCR, RNA-seq, microarray וטכנולוגיות מבוססות הכלאה אחרות. ל חיידקים הוא הגורם הסיבתי של ליסטריה בבני אדם, מחלה עם ביטויים קליניים מיקוד אנשי מדוכאי חיסון בעיקר, קשישים ונשים בהריון 6. זה הוא פתוגן התאי פקולטטיבי גראם חיובי כי פולש מגוון רחב של בתאי יונק כי שמשו במשך עשרות שנים כמודל באינטראקציות מארח הפתוגן לומד 7. לאחר הפלישה, הוא שוכן בתחילה בתוך vacuole או phagosome (במקרה של תאים phagocytic), שממנו הוא חייב לברוח לתוך tהוא לארח cytosol התא כדי לשכפל. מספר גורמים ארסיים הוכחו לתווך בתהליך הבריחה, ובעיקר המוליזין יוצרים הנקבובי, Listeriolysin O (LLO) ושני 8 נוסף phospholipases. ב cytosol החיידקים משתמשים במכונות פילמור אקטין המארח כדי להניע את עצמם על סיבי אקטין בתוך התא להתפשט מתא לתא (איור 1). כל הגורמים הארסיים הגדולים של L. חיידקי מעורבי פלישה, הישרדות שכפול תאיים, מופעלים על ידי רגולטור תעתיק ארסיות מאסטר, PrfA. 8-10. בעשור האחרון, מספר מחקרים שנערכו על ידינו ואחרים יישמו בהצלחה שיטות לניתוח transcriptome של חיידקים גדל intracellularly בתוך התאים המארחים 2,11-15. שתי גישות עיקריות משמשות להפריד RNA חיידקים מ-RNA המארח אשר מבוססים על: 1) עשרה סלקטיבית של RNA חיידקים ו -2) בידוד RNA על ידי diffeתמוגה התא rential. הגישה הראשונה מתבססת על כלת תוסף של תמציות RNA סכו למולקולות רנ&quot;א יונקות (למשל באמצעות ערכות זמינות מסחרי) או ללכוד סלקטיבית של רצפים עבדו בקטריאלי (סקוטים) 11. הגישה השנייה מתבססת על תמוגה הפרש של חיידקים ותאי מארח, שבו תאי המארחים הם lysed בעוד תאים חיידקיים נותרו על כנן. תאים חיידקיים אז מופרדים lysate התא המארח, בדרך כלל על ידי צנטריפוגה, ואת RNA מופק באמצעות טכניקות סטנדרטיות. הבעיה העיקרית בגישה זו היא כי יחד עם החיידקים השלמים, גרעיני תאים לארח גם מבודדים, ובכך הכנות RNA עדיין מכילות RNA היונק. אחת דרכים להתגבר על בעיה זו היא להפריד חיידקים שלמים מגרעיני תאי מארחים באמצעות צנטריפוגה הפרש, אבל פרוצדורה בדרך כלל לוקחת זמן שדווח על החשש משינויי פרופיל ביטוי גנים במהלך חילוץ. במאמר זה אנו מציגים ba משופרת ומהירהפרוטוקול חילוץ cteria RNA, אשר מבוסס על גישת תמוגה הפרש תא. ראשית, L. חיידקים נגועים בתאי מקרופאג הם lysed עם מים קרים. לאחר מכן, גרעינים מקרופאג יוסרו על ידי צנטריפוגה קצר וחיידקים שלמים נאספים במהירות על מסננים, שממנו RNA הוא מבודד באמצעות מיצוי פנול-SDS חמים של חומצות גרעין חיידקים.

<table><tbody><tr><td>Listeria monocytogenes 10403S</td><td></td><td></td><td>&lt;sup&gt;20&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice</td><td></td><td></td><td>&lt;sup&gt;21&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, RNAse free</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977-015</td><td>DEPC-treated water can be used</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360-088</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline-PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Brain heart infusion (BHI)</td><td>Merckmillipore</td><td>1104930500</td><td></td></tr><tr><td>Phenol saturated pH 4.3</td><td>Fisher</td><td>BP1751I-400</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Iso-amyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W205702</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302406</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>SDS 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>Merck Millipore</td><td>1070174000</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; forced-air incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model 3111</td><td></td></tr><tr><td>Cell scrapers</td><td>Nunc</td><td>179693</td><td></td></tr><tr><td>Kontes glass holder for 45 mm filters</td><td>Fisher</td><td>K953755-0045</td><td></td></tr><tr><td>MF-Millipore filters 45&amp;nbsp;mm, 0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac system</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>Model G560E</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>145 mm cell culture dishes</td><td>Greiner</td><td>639 160</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml tubes, RNase-free</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;deg;C incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>65 &amp;deg;C heat block</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C table centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Sterile pipettes, 25 ml</td><td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes, 50 ml</td><td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rna purification from intracellularly grown listeria monocytogenes in macrophage cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

מערכת המודל מוצגת באיור 1 וכוללת תאי מקרופאג נגועים ל חיידקי חיידקים, אשר לשכפל cytosol מקרופאג. איור 2 מייצגים את מערך הניסוי. איור 3 מייצג תוצאות אופייניות של ניתוח RT-qPCR כגון גנים ארסיים במהלך WT ל חיידקי צמיחה מקרופ?...

Watch this Scientific Journal Video about RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells at JoVE.com

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA טיהור מן intracellularly Grown<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; בתאי Macrophage

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

rna-purification-from-intracellularly-grown-listeria-monocytogenes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

9.1K Views.  Tel Aviv University. Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

Video: RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

מדידת עומס בקטריאלי ותגובות החיסון של עכברים נגועים עם חיידקי ליסטריה</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe pneumonia "Legionnaires' disease"1. In protozoan and mammalian phagocytes, L. pneumophila employs a conserved mechanism to form a specific, replication-permissive compartment, the "Legionella-containing vacuole" (LCV). LCV formation requires the bacterial Icm/Dot type IV secretion system (T4SS), which translocates as many as 275 "effector" proteins into host cells. The effectors manipulate host proteins as well as lipids and communicate with secretory, endosomal and mitochondrial organelles2-4.
The formation of LCVs represents a complex, robust and redundant process, which is difficult to grasp in a reductionist manner. An integrative approach is required to comprehensively understand LCV formation, including a global analysis of pathogen-host factor interactions and their temporal and spatial dynamics. As a first step towards this goal, intact LCVs are purified and analyzed by proteomics and lipidomics.
The composition and formation of pathogen-containing vacuoles has been investigated by proteomic analysis using liquid chromatography or 2-D gel electrophoresis coupled to mass-spectrometry. Vacuoles isolated from either the social soil amoeba Dictyostelium discoideum or mammalian phagocytes harboured Leishmania5, Listeria6, Mycobacterium7, Rhodococcus8, Salmonella9 or Legionella spp.10. However, the purification protocols employed in these studies are time-consuming and tedious, as they require e.g. electron microscopy to analyse LCV morphology, integrity and purity. Additionally, these protocols do not exploit specific features of the pathogen vacuole for enrichment.
The method presented here overcomes these limitations by employing D. discoideum producing a fluorescent LCV marker and by targeting the bacterial effector protein SidC, which selectively anchors to the LCV membrane by binding to phosphatidylinositol 4-phosphate (PtdIns(4)P)3,11 . LCVs are enriched in a first step by immuno-magnetic separation using an affinity-purified primary antibody against SidC and a secondary antibody coupled to magnetic beads, followed in a second step by a classical Histodenz density gradient centrifugation12,13 (Fig. 1).
A proteome study of isolated LCVs from D. discoideum revealed more than 560 host cell proteins, including proteins associated with phagocytic vesicles, mitochondria, ER and Golgi, as well as several GTPases, which have not been implicated in LCV formation before13. LCVs enriched and purified with the protocol outlined here can be further analyzed by microscopy (immunofluorescence, electron microscopy), biochemical methods (Western blot) and proteomic or lipidomic approaches.

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

This article describes a method for the isolation and purification of intact Legionella-containing vacuoles (LCVs) from amoeba and macrophages. The two-step protocol comprises LCV enrichment by immuno-magnetic separation using an antibody against a bacterial LCV marker and further purification by density gradient centrifugation.

טיהור vacuoles הפתוגן מ<em&gt; הלגיונלה</em&gt; נגועים phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the gastrointestinal phase of listeriosis due to the lack of a small animal model that closely mimics human disease. This paper describes a novel mouse model for oral transmission of L. monocytogenes. Using this model, mice fed L. monocytogenes-contaminated bread have a discrete phase of gastrointestinal infection, followed by varying degrees of systemic spread in susceptible (BALB/c/By/J) or resistant (C57BL/6) mouse strains. During the later stages of the infection, dissemination to the gall bladder and brain is observed. The food borne model of listeriosis is highly reproducible, does not require specialized skills, and can be used with a wide variety of bacterial isolates and laboratory mouse strains. As such, it is the ideal model to study both virulence strategies used by L. monocytogenes to promote intestinal colonization, as well as the host response to invasive food borne bacterial infection.

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

This paper describes a novel method for oral infection of mice using Listeria monocytogenes-contaminated food. The protocol can readily be adapted for use with other food borne bacterial pathogens.

הילוכים אוראלי של<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; בעכברים באמצעות בליעה של מזון מזוהם

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

ההדמיה InlC הפרשה לחקר זיהום נייד על ידי פתוגן החיידקים<em&gt; חיידקי ליסטריה</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...

Flow Cytometry Analysis of Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes In Vitro

Source: Gayle, P. et al., <a href="https://app.jove.com/v/58775">Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we quantify intracellular and extracellular Listeria monocytogenes, an intracellular pathogenic bacteria, following their infection of cultured macrophages in vitro using flow cytometry.

ניתוח ציטומטריית זרימה של מונוציטוגנים ליסטריה חוץ-תאיים תוך תאיים ומתפתחים במבחנה

Source: Gayle, P. et al., Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses. J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we ...

RNA טיהור מן intracellularly Grown

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

מדידת עומס בקטריאלי ותגובות החיסון של עכברים נגועים עם חיידקי ליסטריה

טיהור vacuoles הפתוגן מ

הילוכים אוראלי של

ההדמיה InlC הפרשה לחקר זיהום נייד על ידי פתוגן החיידקים

באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי

ניתוח ציטומטריית זרימה של מונוציטוגנים ליסטריה חוץ-תאיים תוך תאיים ומתפתחים במבחנה