Name: rna purification from intracellularly grown listeria monocytogenes in macrophage cells
Uploaded: 2016-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells at JoVE.com

The research in the Herskovits lab is supported by 335400 ERC and R01A/109048 NIH grants.

주 : 전체 실험 동안, 대식 세포는 5 % CO 2 강제 공기 인큐베이터에서 37 ℃에서 인큐베이션 단지 클래스 II 생물학적 안전 캐비넷에서 수행되는 실험 조작을위한 인큐베이터 취출. L. 작업 모노 사이토 박테리아는 생물 안전 수준이 규정에 따라입니다. 1. 셀 준비 및 세균 감염 (주 1, 2) <ol><li> 1 일 <ol><li> 30 ml의 BMDM + 펜 연쇄상 구균 미디어 (표 2)에서 145mm 접시에 씨앗 2.0 × 10 (7) 골수 유래 대 식세포 세포 (BMDM). 각 균주에 대한 종자 3 판을 분석한다. 5 % CO 2 강제 공기 인큐베이터에서 37 ℃에서 밤새 인큐베이션. </li><li> 야생형 (WT) L.의 하룻밤 세균 배양을 시작합니다 표준 인큐베이터에서 30 ° C에서 뇌 심장 주입 (BHI) 배지 10ml에 변형 10403S 모노 사이토 겐. 지역 문화 튜브는 흔들림없이 경사. 노트:이러한 성장 조건은 효율적인 감염을 촉진 편모 유전자의 발현을 상향 조절한다. </li></ol></li><li> 2 일 <ol><li> 37 ° C에서 사전 따뜻한 BMDM의 (펜 연쇄상 구균의 항생제없이) 매체 (표 2)와 인산염 완충 생리 식염수 (PBS). </li><li> 항생제를 제거하기 위해 미리 예열 PBS의 25 ㎖로 두 번 대식 세포 단층을 씻으십시오. 30 ml의 신선한 BMDM 매체를 추가합니다. </li><li> 1 분&gt; 14,000 XG에 박테리아를 원심 분리 상층 액을 폐기하고, 피펫 팅에 의해 PBS 1.5 ㎖에 부드럽게 박테리아를 재현 탁하여 PBS에 밤새 박테리아 문화의 1.5 ml를 씻으십시오. 두 번 반복합니다. </li><li> 야생형 L.의 세척 하룻밤 문화의 0.5 ml의 각 식세포 판을 감염 모노 사이토. 여러 판을 사용하는 경우, 따로 따로 각 플레이트 15 분을 감염. 이 시간 간격은 감염​​의 끝에 개별적 플레이트를 수확있게된다. 참고 : 감염 다중도 (MOI)가 직렬 희석 도금에 의해 분석된다세균 배양의 37 ° C에서 플레이트의 24 시간 배양 후 BHI 한천 플레이트와 계산 집락 형성 단위 (CFU)의 감염에 사용됩니다. WT L. 0.5ml를 사용 모노 사이토는 ~ 100 MOI에서 10403S 결과 (대식 세포 당 100 세균 CFU)을 변형. 세포 성장 결함 세균의 돌연변이를 분석 할 때, 높은 MOI 고려되어야한다. </li><li> 37 ° C에서 0.5 시간 배양 후, 부착 균을 제거하고, PBS로 두 번 감염된 세포를 씻어, 30 ml의 미리 예열 BMDM 매체를 추가 할 수 있습니다. 첨부 박테리아는 다음 0.5 시간 동안 내면화한다. </li><li> 세포 외 박테리아를 죽일 : (50 μg / ML의 최종 농도에 도달하는 1000 1) 1 시간 후 감염에서, 겐타 마이신의 30 μl를 추가합니다. </li><li> 진공 배출구가있는 플라스크에 수집 액체 필터 헤드를 배치하여 필터 장치를 조립한다. 이어서 실린더 깔때기 다음 필터 헤드에 필터 (0.45 μm의)를 배치하고, 금속 코팅과 다른 부분을 확보램프. 얼음처럼 차가운의 RNase없는 물을 준비합니다. </li><li> 다음과 같이 감염된 세포에서 6 시간 후 감염, 수확 박테리아에서. 개별적으로 각각의 판을 취급합니다. 참고 : 일반적으로, L.를 모노 사이토는 대식 세포에서 감염 6 시간 동안 성장의 한 로그를 완료합니다. 짧은 배양 기간이 상당히 낮은 세균 부하를 초래할 수있는 동안 더 배양은 세균 증식 및 대 식세포의 세포 사망을 초래할 수 있습니다. MOI 및 감염 시간은 최적의 조건에 도달하기 위해 수정 될 수있다. <ol><li> 한 번 PBS에 감염된 세포를 씻으십시오. 대식 세포 용균 할 빙냉의 RNase가없는 물 20 ㎖를 추가한다. 셀 스크레이퍼를 사용하여, 신속하지만 신중 판 떨어져 세포를 긁어. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 용해 세포를 수집합니다. 30 초 동안 소용돌이. 4 ℃에서 3 분 800 XG에 원심 분리기. </li><li> 진공 시스템을 이용한 필터 장치를 통해 상청액을 통과한다. CONI ml의 필터를 출시하고 신속하게 (15)로 전송, 핀셋을 사용하여칼 튜브. 액체 질소의 필터 튜브를 스냅 동결. </li><li> 1.2.7에 설명 된 것처럼, 다음 샘플을 위해 새로운 필터로 여과 장치를 조립한다. </li><li> 다음날 -80 ° C에서 냉동 필터를 저장합니다. 대안 적으로, 핵산 추출 진행할. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 핵산 추출 (3 일) 참고 : 흄 후드에서 페놀과 클로로포름 솔루션으로 모든 조작을 수행합니다. <ol><li> 1 산성화 페놀의 혼합 : 클로로포름, 각 시료 400 ㎕의 1을 준비합니다. 별도의 튜브에 혼합 한 후 흡인에 의해 생성 된 수성 층을 철회. 10 % SDS 40 μl를 추가합니다. </li><li> 감기를 유지하기 위해 얼음에 필터 함유 튜브를 해동. 각 필터 함유 튜브에 아세테이트 - EDTA (AE) 버퍼 (표 2)의 650 μl를 추가합니다. </li><li> 가능한 빨리 다음 단계를 수행한다. <ol><li> 이렇게 적극적으로 필터를 포함하는 튜브를 와동상기 필터는 상기 튜브의 외주에 턴다 버퍼 완전 필터를 세척있다. 항상 얼음에 다시 배치하여 튜브 감기를 유지합니다. 참고 : 완전히 필터 떨어져 박테리아를 씻어 반전하면서 추가로 튜브를 와동하는 것이 필요할 수있다. </li><li> 모든 튜브에 대해 반복합니다. 이는 스핀 다운하는 짧게 현탁액 (120 XG에서 1 분) 프로세스의 마지막에 유용 할 수있다. </li></ol></li><li> SDS 및 (2.1 제조) 페놀 / 클로로포름 혼합물을 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 박테리아 - 함유 버퍼를 옮긴다. 모든 튜브에 대해 반복합니다. 이 필터에서 잔류 버퍼를 얻기 위해 다시 필터를 포함하는 튜브 (120 XG에 1 분) 회전 할 필요가있다. </li><li> 10 분 동안 전속력으로 모든 1.5 ml의 다중 튜브 소용돌이 장치의 튜브 및 소용돌이를 놓습니다. </li><li> 10 분 동안 65 ℃로 가열 블록에서 튜브 부화. 5 분 동안 최대 속도 (&gt; 14,000 XG)에서 원심 분리기. </li><li> 각 t로부터 수층 (약 400 μL)을 전송3M 아세트산 나트륨 (pH5.2) 및 1.0 ml의 100 % 에탄올 40 ㎕를 함유하는 1.5 ml의 새로운 튜브 우베. 철저하게 각 튜브를 소용돌이. 참고 글리코겐 침전 된 펠렛의 시각화를 향상시키기 위해이 단계에서 첨가 될 수있다. </li><li> 1 시간 동안 -80 ° C에서 샘플을 인큐베이션. 또한, C 하룻밤 -20 °에서 샘플을 품어. 그런 다음, 최대 속도 (&gt; 14,000 XG)에서 20 분 동안 4 ° C에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 각 튜브에서 에탄올 (상위 계층)을 대기음. 철저하게 각 샘플 및 와동 500 μL 차가운 70 % 에탄올을 추가합니다. 최대 속도 (&gt; 1 4,000 XG)에서 20 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 각 튜브에서 에탄올을 대기음. 전혀 열을 진공 증발기를 이용하여 약 2 분 동안 샘플을 건조. 샘플을 지나치게 건조하지 마십시오. </li><li> 각 샘플 25 μL의 RNA 분해 효소가없는 물을 추가합니다. 실온에서 20 분 동안 인큐베이션. 조심스럽게 소용돌이와 스핀 다운. </li><li> t에서 RNA의 농도를 측정microvolume UV - 마주 분광 광도계를 사용하여 그 샘플. 접시 당 핵산의 1 μg의 - 약 0.5를 추출 할 전망이다. 참고 기술 복제는이 단계에서 결합 될 수있다. </li></ol> 3. DNase의 치료 <ol><li> 의 microfuge 튜브 표 1에 따라 반응을 설정합니다. 45 분 동안 37 ° C에서 품어. 450 μL의 RNase없는 물과 최대 속도 (&gt; 14,000 XG)에서 2 분 동안 원심 분리하여 페놀 - 클로로포름-IAA 믹스 (표 2), 별도의 단계 500 μl를 추가합니다. </li><li> 새로운 튜브로 수층을 전송 및 최대 속도 (&gt; 14,000 XG)에서 2 분간 원심 분리하여 500 ㎕의 클로로포름을 IAA 혼합물 (표 2), 와류 분리 단계를 추가한다. </li><li> 새로운 튜브로 수층을 전송 및 에탄올 1 ㎖ 3 M 아세트산 나트륨 (PH 5.2)의 50 μL를 추가한다. 와동. 참고 글리코겐 침전 된 펠렛의 시각화를 향상시키기 위해이 단계에서 첨가 될 수있다. </li><l난&gt; -80 ° C에서 1 시간 동안 품어. 또한, C 하룻밤 -20 °에서 샘플을 품어. 최대 속도로 20 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 각 튜브에서 에탄올을 대기음. 철저하게 각 샘플 및 와동 500 μL 차가운 70 % 에탄올을 추가합니다. 최대 속도에서 20 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기. 조심스럽게 각 튜브에서 에탄올을 대기음. </li><li> 전혀 열을 진공 증발기를 이용하여 약 2 분 동안 샘플을 건조. 샘플을 지나치게 건조하지 마십시오. </li><li> 실내 온도, 소용돌이, 스핀 다운에서 2 분 동안 품어의 RNA 분해 효소가없는 물을 12 μl를 추가합니다. 샘플은, 정제 된 RNA를 포함 얼음에 보관하십시오. 대안 적으로, RNA에 용해 된 RNase가없는 H 2 O를 0.1 mM의 EDTA 또는 TE 완충액 (10 mM 트리스, 1 mM의 EDTA)와. </li><li> microvolume UV - 마주 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정한다. (기술 복제가 결합 된 경우) 샘플 당 RNA의 ~ 100 NG를 기대합니다. 참고 : RNA 추출이 프로토콜에 따른 FO 적합여러 기술에 의해 R 유전자 전사 분석. 우리는 일반적으로 L.을 연구하는 RT-qPCR에 분석을 사용 식세포 1-4 감염시 유전자 전사 모노 사이토 겐. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기에 설명 된 프로토콜은 L.에서 세균 RNA의 분리를위한 최적의 방법을 나타냅니다 대식 세포에서 세포 내 성장 세균 모노 사이토 겐. 이 프로토콜은 세포 용해 차분에 기초하여 세균 RNA의 농축을위한 두 가지 주요 단계를 포함한다 : 원심 분리 및 여과에 의해 박테리아의 신속한 수집을 사용하여 대 식세포 핵 침강. 이 단계는 표준 RNA 추출 과정 뒤 따른다. 이 프로토콜은 listerial RNA?...

세포 내 세균 병원체 ─ 전염병 성장과 인간의 호스트의 내부 세포를 재생할 수있는 원인이 박테리아는 ─ 전세계 주요 건강 문제 5입니다. 침입 포유 동물 세포 내에서 복제하는 세포 내 병원체는 병원성 정교한 메커니즘 요인을 취득했다. 이러한 메커니즘은 질병을 일으킬 수있는 능력에 기초하지만, 우리는 그들의 규제와 역학에 대해 조금 알고있다. 액체 배지에서 자란 균의 유전자 발현 프로파일을 숙주 세포 내에서 실제 환경을 반영하지 않기 때문에, 이들의 세포 내 틈새에서 자란 균 사체 분석에 대한 필요가 커지고있다. 이러한 분석은 호스트에 의해 트리거 특정 세균 적응의 해독을 가능하게 할 것이다 및 치료 설계를위한 새로운 목표를 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 포유 동물의 RNA가에 의한 세균의 RNA를 능가하기 때문에 세포 내 성장 세균의 사체 분석은 매우 도전최소 10 배. 이 논문에서 우리는 쥐의 대 식세포의 세포 안에 성장 리스테리아 박테리아에서 세균의 RNA를 분리하는 실험 방법을 설명합니다. 추출 된 RNA는 세포 적응 및 RT-PCR, RNA-SEQ 마이크로 어레이 혼성화 및 다른 기반 기술로서 전사 분석의 다양한 기술에 의해 병원균의 독성 기전을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 리스테리아 모노 사이토 겐은 인간의 리스테리아 증의 원인이되는 에이전트, 주로 면역 개인, 노인과 임산부 (6)를 대상으로 임상 증상을 가진 질환이다. 이것 7 연구 호스트 병원체 상호 작용 모델로서 수십 년 동안 사용 된 포유 동물 세포의 다양한 침입 그람 양성 통성 세포 내 병원체이다. 침입하면, 그것은 t로 탈출 해야하는에서 액포 또는 (식세포의 경우) phagosome, 초기에 상주그는 복제하기 위해 세포의 세포질을 호스팅합니다. 여러 병원성 인자는 이스케이프 프로세스 주로 조공 용혈,리스 테리 오라 O (LLO) 및 포스 포 개의 추가 8을 중재하는 것으로 밝혀진 바있다. 세포질에서 박테리아 (그림 1) 세포 내에서 액틴 필라멘트에 자신을 추진 세포에 세포에서 확산 호스트 액틴의 중합 기계를 사용합니다. L.의 모든 주요 독성 요인 침략, 세포 생존과 복제에 관여하는 모노 사이토는, 마스터 독성 전사 조절에 의해 PRFA. 8-10 활성화됩니다. 지난 10 년 동안 여러 연구는 우리가 수행 등을 성공적으로 숙주 세포 2,11-15 내부 세포 내 성장 세균의 사체 분석 방법을 적용했습니다. diffe에 의한 세균의 RNA의 1) 선택적 농축 및 2) RNA 분리 : 두 가지 주요 접근 방식을 기반으로 호스트 RNA에서 세균의 RNA를 분리하는 데 사용됩니다rential 세포 용해. 첫 번째 방법은 (시판 키트를 사용하여 예를 들어) 포유 동물의 RNA 분자에 총 RNA 추출물의 감산 하이브리드 또는 박테리아 전사 시퀀스 (SCOTS) (11)의 선택적 캡처에 의존합니다. 두 번째 방법은 균체 그대로 유지하면서 숙주 세포가 용해되어있는 박테리아 숙주 세포의 용해 차분에 의존한다. 세균 세포는 일반적으로 원심 분리에 의해, 숙주 세포 용 해물로부터 분리되고, RNA는 표준 기술을 이용하여 추출 하였다. 이 방법을 사용하는 가장 큰 문제는 그 본래의 박테리아가 숙주 세포의 핵은 또한 분리되어 함께, 따라서 RNA 제제가 여전히 포유류 RNA를 포함한다. 이러한 문제를 극복하는 한가지 방법은이 절차는 일반적으로 추출 동안 유전자 발현 프로파일의 변화의 관계를 상승 시간이 필요하지만, 차등 원심 분리를 이용하여 숙주 세포 핵에서 그대로 박테리아를 분리하는 것이다. 본 논문에서는 개선 및 신속한 바 제시셀 차동 용해 방식에 기초 cteria RNA 추출 프로토콜. 첫째, L. 대식 세포를 감염 모노 사이토 겐을 냉수로 용해된다. 다음으로, 대식 세포 핵에 대한 간단한 원심 분리하여 제거하고 그대로 박테리아가 빠르게하는 RNA에서 세균의 핵산의 뜨거운 페놀 SDS 추출을 사용하여 격리, 필터에 수집됩니다.

<table><tbody><tr><td>Listeria monocytogenes 10403S</td><td></td><td></td><td>&lt;sup&gt;20&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice</td><td></td><td></td><td>&lt;sup&gt;21&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, RNAse free</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977-015</td><td>DEPC-treated water can be used</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360-088</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline-PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Brain heart infusion (BHI)</td><td>Merckmillipore</td><td>1104930500</td><td></td></tr><tr><td>Phenol saturated pH 4.3</td><td>Fisher</td><td>BP1751I-400</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Iso-amyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W205702</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302406</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>SDS 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>Merck Millipore</td><td>1070174000</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; forced-air incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model 3111</td><td></td></tr><tr><td>Cell scrapers</td><td>Nunc</td><td>179693</td><td></td></tr><tr><td>Kontes glass holder for 45 mm filters</td><td>Fisher</td><td>K953755-0045</td><td></td></tr><tr><td>MF-Millipore filters 45&amp;nbsp;mm, 0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac system</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>Model G560E</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>145 mm cell culture dishes</td><td>Greiner</td><td>639 160</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml tubes, RNase-free</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;deg;C incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>65 &amp;deg;C heat block</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C table centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Sterile pipettes, 25 ml</td><td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes, 50 ml</td><td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rna purification from intracellularly grown listeria monocytogenes in macrophage cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

모델 시스템은도 1에 도시 L. 감염 대 식세포를 포함 대 식세포의 세포질에서 복제 박테리아, 모노 사이토 겐. (2) 실험 방식을 나타내는 그림. 그림 3은 WT L. 동안 독성 유전자의 예 RT-qPCR에 분석의 전형적인 결과를 나타냅니다 풍부한 실험실 매체 BHI의 성장에 비해 식세포의 성장 모노 사이토 겐....

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RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA 정제는 세포 내에서 재배<em&gt; 리스테리아</em&gt; 식세포 세포에

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

9.1K 조회수.  Tel Aviv University. Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

비디오: RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

연구

면역학 및 감염병학

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe pneumonia "Legionnaires' disease"1. In protozoan and mammalian phagocytes, L. pneumophila employs a conserved mechanism to form a specific, replication-permissive compartment, the "Legionella-containing vacuole" (LCV). LCV formation requires the bacterial Icm/Dot type IV secretion system (T4SS), which translocates as many as 275 "effector" proteins into host cells. The effectors manipulate host proteins as well as lipids and communicate with secretory, endosomal and mitochondrial organelles2-4.
The formation of LCVs represents a complex, robust and redundant process, which is difficult to grasp in a reductionist manner. An integrative approach is required to comprehensively understand LCV formation, including a global analysis of pathogen-host factor interactions and their temporal and spatial dynamics. As a first step towards this goal, intact LCVs are purified and analyzed by proteomics and lipidomics.
The composition and formation of pathogen-containing vacuoles has been investigated by proteomic analysis using liquid chromatography or 2-D gel electrophoresis coupled to mass-spectrometry. Vacuoles isolated from either the social soil amoeba Dictyostelium discoideum or mammalian phagocytes harboured Leishmania5, Listeria6, Mycobacterium7, Rhodococcus8, Salmonella9 or Legionella spp.10. However, the purification protocols employed in these studies are time-consuming and tedious, as they require e.g. electron microscopy to analyse LCV morphology, integrity and purity. Additionally, these protocols do not exploit specific features of the pathogen vacuole for enrichment.
The method presented here overcomes these limitations by employing D. discoideum producing a fluorescent LCV marker and by targeting the bacterial effector protein SidC, which selectively anchors to the LCV membrane by binding to phosphatidylinositol 4-phosphate (PtdIns(4)P)3,11 . LCVs are enriched in a first step by immuno-magnetic separation using an affinity-purified primary antibody against SidC and a secondary antibody coupled to magnetic beads, followed in a second step by a classical Histodenz density gradient centrifugation12,13 (Fig. 1).
A proteome study of isolated LCVs from D. discoideum revealed more than 560 host cell proteins, including proteins associated with phagocytic vesicles, mitochondria, ER and Golgi, as well as several GTPases, which have not been implicated in LCV formation before13. LCVs enriched and purified with the protocol outlined here can be further analyzed by microscopy (immunofluorescence, electron microscopy), biochemical methods (Western blot) and proteomic or lipidomic approaches.

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

This article describes a method for the isolation and purification of intact Legionella-containing vacuoles (LCVs) from amoeba and macrophages. The two-step protocol comprises LCV enrichment by immuno-magnetic separation using an antibody against a bacterial LCV marker and further purification by density gradient centrifugation.

병원체 Vacuoles의 정제에서<em&gt; Legionella</em&gt; - 감염된 Phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the gastrointestinal phase of listeriosis due to the lack of a small animal model that closely mimics human disease. This paper describes a novel mouse model for oral transmission of L. monocytogenes. Using this model, mice fed L. monocytogenes-contaminated bread have a discrete phase of gastrointestinal infection, followed by varying degrees of systemic spread in susceptible (BALB/c/By/J) or resistant (C57BL/6) mouse strains. During the later stages of the infection, dissemination to the gall bladder and brain is observed. The food borne model of listeriosis is highly reproducible, does not require specialized skills, and can be used with a wide variety of bacterial isolates and laboratory mouse strains. As such, it is the ideal model to study both virulence strategies used by L. monocytogenes to promote intestinal colonization, as well as the host response to invasive food borne bacterial infection.

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

This paper describes a novel method for oral infection of mice using Listeria monocytogenes-contaminated food. The protocol can readily be adapted for use with other food borne bacterial pathogens.

경구 전송<em&gt; 리스테리아</em&gt; 오염 된 음식의 섭취를 통해 마우스의

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징<em&gt; 리스테리아</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

레지오넬라 뉴모 필라 외부 막 소포 : 분리 및 대 식세포에 그들의 프로 - 염증 가능성 분석

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

발견 중심의 숙주-병원균 상호 작용을 위한 라벨 프리 정량적 프로테오믹스 워크플로우

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...

Flow Cytometry Analysis of Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes In Vitro

Source: Gayle, P. et al., <a href="https://app.jove.com/v/58775">Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we quantify intracellular and extracellular Listeria monocytogenes, an intracellular pathogenic bacteria, following their infection of cultured macrophages in vitro using flow cytometry.

In vitro에서 Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes의 유세포 분석

Source: Gayle, P. et al., Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses. J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we ...

RNA 정제는 세포 내에서 재배

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성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes

병원체 Vacuoles의 정제에서

경구 전송

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

레지오넬라 뉴모 필라 외부 막 소포 : 분리 및 대 식세포에 그들의 프로 - 염증 가능성 분석

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

발견 중심의 숙주-병원균 상호 작용을 위한 라벨 프리 정량적 프로테오믹스 워크플로우

In vitro에서 Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes의 유세포 분석