Name: measurement of carbon dioxide production from radiolabeled substrates in drosophila melanogaster
Uploaded: 2016-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster at JoVE.com

The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).

1. הכנת מזון מרחף שמכיל מצעים radiolabeled מטבולית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור microfuge, לערבב 1 - 2 המצע radiolabeled μCi (D- [6- 14 C] -glucose, D- [1- 14 C] או -glucose [1- 14 C] חומצה -palmitic, 40 - 60 MCI / מס &#39;1 mmol) עם 15 μl FD &amp; C צבע מזון כחול H 2 O שווה בנפח כולל של 25 μl. זהירות: פחמן -14 הוא פולט בטא נמוכה אנרגיה ובעל טווח קצר באוויר. עם זאת, לטפל כדי למנוע הטחת מולקולות רדיואקטיבי או בליעה בשוגג על ידי הנסיין. טוס בקבוקוני מזון להתהפך בקלות; הקפד לשכן אותם במיכל כי ימנע מהם מפנה, במיוחד כאשר radiolabel הוא במצב נוזלי (שלב 1.2) או במזון unsolidified (שלב 1.4). זבובים הם מאכילים או כבר נמאס מצעים radiolabeled תתחיל לנשוף כמויות קטנות של radiolabeled CO 2. זבובים אלה צריכים להישמר בקופסות אקריליק ב מנדף כימי, וצלוחית של ca KOHn להיות מוגדר בתיבה לשימוש בתור scrubber CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet כל המצע radiolabeled ותמהיל הצבע הכחול לתוך החלק התחתון של בקבוקון אוכל לטוס ריק (גובה: 9.4 ס&quot;מ, רוחב: 2.2 ס&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן חום לעוף מזון במיקרוגל עד שהמזון נוזלי פשוט (15 - 20 שניות בהספק גבוה עבור בקבוקון אחד המכיל 10 מ&quot;ל של מזון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 975 μl מזון מותך למצע radiolabeled / תערובת צבע הכחולה ובמהירות מערבולת, ניטור אחידות הצבע הכחול כדי להבטיח ערבוב מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מזון להתקרר לחזק לחלוטין ב RT במשך 20 - 30 דקות. </li></ol> 2. מצעים מטבולית radiolabeled האכלה כדי וזבובי פירות למבוגרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים מבוגר זבובים באמצעות מנגנון הרדמת CO 2 מורכב פוליאתילן נקבובי התמזג בסיס אקרילי ומחובר טנק CO 2 עם ווסת לחץ. זרימת CO 2 לתוך מנגנון ההרדמה ב 5 ליטר / דקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים העברהד טס בקבוקונים המכילים רדיואקטיבי, מזון כחול-צבוע (n = -15 - 30 זבובים בכל בקבוקון). בקבוקונים קאפ עם פקק קצף, ולנוח אופקי עד זבובים להתעורר. העברת צלוחיות למיכל אקריליק עפעפיים (180 ס&quot;מ x 180 ס&quot;מ x 240 ס&quot;מ). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האכלה לטווח קצר, להרעיב זבובים במשך 18 - 24 שעות לפני העברת זבובים לאוכל radiolabeled עבור 2 -. צעד האכלת hr 3 T הוא הצעד רעב חשוב כי זבובים הפד לא לאכול באופן מהימן מקור חדש של מזון שהוצג בפניהם . האכלה לטווח ארוך במשך 5 - 7 ימים, זבובים לא צריכים להיות מורעבים, אבל הנסיין צריך לפקח על תכולת המים של המזון רדיואקטיבי ב צלוחיות זבובים הם שוכנו ולהשתמש מחט ומזרק להוסיף מי בקבוקונים עם מזון יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זבובים למזון ללא תווית על ידי &quot;קשה&quot; אותם לתוך בקבוקון חדש. תקופת מרדף ראשונית של 2 - 4 שעות מאפשרת זבובים לנקות חלקיקי מזון רדיואקטיבי מן העור הקרני שלהם ומאפשרת עיכול של radiolabelמזון ed הנותר במעיים. לעקוב אחר התקדמות של מזון דרך המעיים על ידי בדיקה ויזואלית של זבובים לחפש בטן כחולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך, העברת זבובים לסוגי מזון שונים (12 - 24 שעות על מזון רגיל או אגר 1% למדידת השפעות נמאס מול המדינה צמה ביום נשימה) או כאשר טמפרטורה סביבתית (12 - 96 שעות ב 18 ג או 30 ג עבור גנטי מניפולציות באמצעות GAL80 רגיש לטמפרטורה (GAL80 TS), עבור למשל). הערה: משך תקופת מרדף זו ישתנה בהתאם הניסוי מתבצע. עבור למשל, מרדף 96 שעות ב 30 C עשוי להיות נחוץ בניסויים באמצעות GAL80 ts כדי להפעיל באופן מלא את ביטוי transgene GAL4 תלוי. </li></ol> 3. הכנת מנגנון CO 2 -Collection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב חומרים כדי לבנות &quot;לעוף תרמילים&quot;, צינורות הכתיר רשת שיכיל זבובים שכותרתו עם 14 C-גלוקוז או 14 C-פלמיטית חומצה that יישאר פתוח לאטמוספרה. חותכים את 50 מ&quot;מ העליון של 12 מ&quot;מ x 75 מ&quot;מ צינורות פוליפרופילן, עוזב 25 צינורות מ&quot;מ ארוך, עגול תחתית. כן 35 מ&quot;מ x 35 מ&quot;מ ריבועים של רשת ניילון 130 מיקרומטר. כמו כן, להשיג קלטת שקופה מנפק קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב חומרים עבור מנגנוני -collection 2 CO. לכל לעוף תרמיל, להרכיב בקבוקון הנצנץ זכוכית 20 מ&quot;ל, פקק מכסה גומי עם חור מחוץ למרכז, מרכז גם להיות מוכנס דרך חור פקק העליון, כיתה GF / B זכוכית נייר מיקרופייבר מסנן (2.1 ס&quot;מ קוטר המעגל, 1 נקבובי מיקרומטר). GF / B מסנן נייר משמש בגלל החוזק הרטוב הגבוה וקיבולת טעינה גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 5% KOH טריים ביום שימוש. רגע לפני שלב 3.4, לקפל ולהניח את נייר הסינון GF / B חוזר למרכז היטב כי הוא מושחל דרך החור של פקק גומי העליון להרוות אותו עם 100 μl של 5% KOH. עיין איור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה (ים) על תקשורת ללא תווית,nesthetize זבובים עם CO 2. המברשת עפה לתוך צינור פוליפרופילן גזור, הכובע עם רשת ניילון, ולהשתמש קלטת שקופה לדבוק רשת אל צינור. לעבוד במהירות כדי למנוע זבובים מתעוררים ולברוח לפני הרשת כבר מודבקת היטב הצינור. מספר שווה של זבובים יש להשתמש בכל תרמיל זבוב לניסוי מסוים; 10 - 20 זבובים בכל תרמיל זבוב לייצר מספיק רדיואקטיבי-CO 2 למדידה לפי ספירת נצנץ (שלב 4.1 להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את התרמיל לטוס ל בקבוקון נצנץ זכוכית 20 מיליליטר. כיסוי או בקבוקון זכוכית עם פקק מכסה גומי מחזיק מרכז היטב המכיל נייר KOH-רווי GF / B מסנן. מקפל את הדף הרחב של פקק גומי העליון מעל שפתו של בקבוקון נצנץ זכוכית. עיין איור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלוחיות זכוכית סט המכילות זבובי עפעפיים, מיכל אקריליק, דגירה במשך תקופות שונות של זמן (2 עד 12 שעות עובדות היטב). </li></ol> ניתוח 4. של תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בְּסוף הדגירה, צלוחיות זכוכית uncap, ונייר מסנן GF / B העברת רווי KOH ל בקבוקון הנצנץ פלסטיק 6 מ&quot;ל המכיל קוקטייל נצנץ 4 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, להקפיא זבובים תרמילי זבוב על קרח ולאחסן יבש ב -80 C לקביעת מאוחר של מאוחסנים סובסטרטים. שים לב דגימות אלה הם רדיואקטיביים חייב להיות מאוחסן בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין בקבוקוני נצנץ נוספים: אחד המכיל נייר סינון בשימוש GF / B לשמש רקע ואחד שניים נוספים המכילים 0.1 - 0.5 מצע radiolabeled μCi לקבוע לדקה / μCi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד לדקה עבור כל דגימה באמצעות מונה נצנץ על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב pmol 14 CO 2 / לדקה ו pmol 14 CO 2 לכל זבוב לשעה. הפחת את לדקת הרקע מהערך לדקה עבור כל דגימה. מנתוני מצע radiolabeled המסודרים, לחשב את לדקת רקע תיקן / μCi של מדגם נספרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש ביצרנית שסופק על-ידי פעילות ספציפית וריכוז radiochemical של המצע רדיואקטיבי (למשל, 50 μCi / μmol ו -0.1 μCi / μl, בהתאמה) כדי לחשב pmol / לדקה. השתמש גורם זה כדי להמיר נתוני תרמיל זבוב-תקן רקע לדקה 14 CO 2 / מדגם pmol 14 CO 2 / מדגם. לאחר מכן יש לחלק במספר הזבובים ומספר שעות בתרמיל הזבוב. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruit+flies+in+biomedical+research.">Fruit flies in biomedical research.</a> Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metabolic+homeostasis+and+nutrient+sensing+in+Drosophila:+implications+for+aging+and+metabolic+diseases.">Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases.</a> Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila.">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li><li>Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Drosophila+food+intake:+comparative+analysis+of+current+methodology.">Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology.</a> Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li><li>Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+supports+growth+in+Drosophila+by+regulating+muscle+activity+and+nutrient+uptake+in+the+gut.">AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut.</a> Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).</li><li>Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rate+is+not+reduced+by+dietary-restriction+or+by+lowered+insulin/IGF-1+signalling+and+is+not+correlated+with+individual+lifespan+in+Drosophila+melanogaster.">Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).</li><li>Van Voorhies, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+function+in+Drosophila+melanogaster+in+response+to+hypoxia+and+pure+oxygen.">Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen.</a> J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).</li><li>Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+determinants+of+variation+in+energy+metabolism,+respiration+and+flight+in+Drosophila.">Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila.</a> Genetics. 165 (2), 623-635 (2003).</li><li>Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+metabolic+rate+in+Drosophila+using+respirometry.">Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry.</a> JoVE. (88), e51681 (2014).</li><li>Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+cyclin+D/Cdk4+regulates+mitochondrial+biogenesis+and+aging+and+sensitizes+animals+to+hypoxic+stress.">Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress.</a> Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).</li><li>Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+ability+of+cells+overexpressing+MYC+proteins+to+reduce+peroxide+and+hydroperoxides.">Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides.</a> Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).</li><li>Ontko, J. A., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+rate+of+oxidation+of+fatty+acids+in+animal+tissues.+Effect+of+substrate+concentration,+pH,+and+coenzyme+a+in+rat+liver+preparations.">Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations.</a> J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).</li><li>Vincent, A., Briggs, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=parkin-induced+defects+in+neurophysiology+and+locomotion+are+generated+by+metabolic+dysfunction+and+not+oxidative+stress.">parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress.</a> Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).</li><li>Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occurrence+and+mechanism+of+the+hexose+monophosphate+shunt+in+rat+liver+slices.">The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices.</a> J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).</li><li>Katz, J., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+glucose-C14+for+the+evaluation+of+the+pathways+of+glucose+metabolism.">The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism.</a> J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).</li><li>Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+holidic+medium+for+Drosophila+melanogaster.">A holidic medium for Drosophila melanogaster.</a> Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).</li><li>Sang, J. H., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+Requirements+of+Axenically+Cultured+Drosophila+Melanogaster+Adults.">Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults.</a> J Exp Biol. , (1961).</li><li>Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+and+hepatic+utilization+of+glucose+for+lipogenesis.">Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis.</a> J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).</li><li>Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+"rate+of+living"+model:+further+evidence+that+longevity+and+metabolic+rate+are+not+inversely+correlated+in+Drosophila+melanogaster.">Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster.</a> J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).</li></ol>

The author declares no competing financial interests.

פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת החמצון של מצעים רדיואקטיבי מסוימים תסיסנית מבוגר. טכניקה זו היא פשוטה, כמוני, לשחזור ורגיש, והוא משלים שיטות קיימות מודדות ייצור הכולל CO 2 וצריכה O 2 כי זה יכול לשמש כדי לזהות את המזין (s) being חמצון לייצור ATP. מדידת CO 2 ששוחררה החמצון של מצעי radiolabeled ספציפיים באמצעות השיטה המתוארת כאן היא משלימה טכניקות המודדים ייצור CO 2 בקטגוריה כולה. הייצור הכולל CO 2 (CO2 V) מאפשר הערכה של קצב חילוף החומרים, וכאשר הצריכה הכוללת O 2 (V O2) ידוע, את קצב חילוף החומרים ניתן לחשב ואת מקור דלק עבור חמצון ניתן להעריך על בסיס יחס החליפין הנשימה (V O2 CO2 / V = RER). מתיפחמימות הן המצע בלעדי, RER = 1, אבל כאשר חומצות שומן הם המקור הבלעדי, RER = 0.7, בשל והרכב של התגובות של גלוקוז וחמצון שומנים. בהיעדר ציוד למדידת צריכת חמצן תסיסנית 14, מקור דלק החמצונים לא ניתן לזהות. עם זאת, על ידי תיוג טס עם כמויות זעירות של מצע רדיואקטיבי זו או אחרת ושיעורי מדידה של ייצור radiolabeled CO 2, אפשר להסיק מסקנות לגבי היכולת של זבובים לחמצן מצע נתון בנקודות זמן שונות במהלך גירוי או על ההשפעות של נתון מוטציה על חמצון דלק. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. ראשית, יש לנקוט משנה זהירות בעת שימוש בחומרים רדיואקטיביים כדי שלא יישפכו וזיהום של תחומי מחקר. שנית, כאשר בהרדמת זבובים במהלך השלבים 2.1 ו -3.4, הנסיין צריך לעבוד במהירות כדי למנוע תופעות של CO 2 ממושךחשיפה על חילוף חומרים ועל התנהגות. קבוצה של 20 זבובים יכולה להיות מורדמת והועברה בקבוקון חדש או לתוך תרמיל לטוס ב -20 שניות או פחות. כאשר נגזרים מנגנון הרדמה כדי בקבוקון מזון, הבקבוקון צריך להיות מונח על צידו כדי למנוע זבובים הרדימו מ להיתקע על פני שטח המזון. כאשר הזבובים מזון רדיואקטיבי הפד במהלך כמה ימים כמו בשלב 2.2, הנסיין צריך להבטיח כי המזון לא להתייבש כמו זבובים רגישים להתייבשות. הפד או צם המדינה לפני תיוג, הבחירה של התווית, את משך הזמן תיוג, את משך הזמן בתרמיל לטוס, ואת שיטת ההרדמה הם פרמטרים שיכולים להיות חשוף פתרון בעיות ושינוי בעת שימוש בטכניקה זו. ראשית, זבובים נתונים תקופות תיוג קצרות (2 - 3 שעות) צפויים לצרוך כמויות משמעותיות של מזון רדיואקטיבי, אלא אם כן נתון תקופת צום לפני כן. שנית, הבחירה של ג תוויתלהשפיע מסקנות אחד יכול לצייר על פנוטיפים מטבוליים. לדוגמה, ייצור CO 2 רדיואקטיבי מ D- [1- 14 C] -glucose יכול לשקף חמצון דרך מחזור חומצת לימון או שנט פוספט pentose, בעוד שהייצור CO 2 רדיואקטיבי מ D- [6- 14 C] -glucose משקף חמצון דרך מחזור חומצת לימון בלבד 12,15,16. האכלת זבובים עם נותב רדיואקטיבי עבור חומצת אמינו חיונית 17,18 תהיה אסטרטגיה טובה להערכת חמצון של חומצות אמינו נגזרו חלבונים. לבסוף, תקופות תיוג ממושכות עם גלוקוז רדיואקטיבי גם מעלות את האפשרות של שילוב של מבשר זה למעמדות אחרות של מולקולות כגון טריגליצרידים 19 וחומצות אמינו כגון אלאנין, אשר interconverts בקלות עם פירובט. זה יכול להיות מוערך על ידי מדידת רדיואקטיביות שולבה מעמדות שונות אלה של מולקולות 6. ואכן, קבוצות נפרדות של זבובים יכולות להיות מוזן radiolabeled מצעים באותו אופן ואז המשמשים בניסויים תרמיל זבוב או מדידת radiolabel המאוחסן ונשאר גליקוגן וטריגליצרידים הפד וצם התנאים 6, למשל. אסטרטגיה נוספת היא להשתמש לתקופות קצרות תיוג כי צפויים לחשוף חמצון של הרכיבים התזונתיים radiolabeled עצמם ולא צורות אחסון של חומרים מזינים אלו. שלישית, אפשר גם כי שתי קבוצות של זבובים יכול להיות בשיעורים זהים של 14 ייצור CO 2 על פני פרק זמן נתון, אך בקצב שונה מאוד בתחילה. לכן, שינוי משך הזמן טס לבלות בתרמיל הזבובים עלול להיות פרמטר חשוב לשנות כאשר מעריכים וריאציה פנוטיפי. לבסוף, פרוטוקול זה מחייב שימוש של תקופה קצרה של CO 2 הרדמה כאשר לשים זבובים לתוך המנגנון תרמיל זבוב. יתכן כי הרדמה 2 CO עלול להשפיע על התפקוד המטבולי במהלך הניסוי תרמיל זבוב. ממלא מקוםpproach היא להשתמש הרדמה חנקן אשר אינה משפיעה על קצב חילוף החומרים 20. כמו בכל טכניקה מודדת מערכת מורכבת כגון חמצון דלק קצב חילוף חומרים, השיטה המתוארת כאן יש מגבלות. ראשית, יתכן כי זבובים בקבוצות שונות עשויים לצרוך כמויות שונות של מזון רדיואקטיבי וכך היה נכנס שלב איסוף CO 2 של assay עם כמויות התחלה שונות של מצע. זה יכול להיות נשלט על במידה מסוימת על ידי ביצוע הניסוי עם מדגמים גדולים ועל ידי האכלת זבובים בהמוניהם. לתקופות תיוג קצרות, זבובים עם אומץ בצבע כחול דומה יהיה צרך את radiolabel וניתן להעברת חלק המרדף של הניסוי. כמות radiolabel שנותר קבוצה של זבובים ניתן למדוד גם בסוף הניסוי מתבצע בקבוצות נפרדות של זבובים לאחר תום ההנקה ותקופת מרדף ראשוני. שנית, רמת הפעילות ביןקבוצות של זבובי התרמילים לטוס עשויות להיות שונות. זה יצטרך להיקבע באופן ניסיוני ומובאות כאשר לפרש נתונים. שלישית, טכניקה זו אינה מודדת ייצור הכולל CO 2, ייצור רק מזין תזונתי ספציפי או בצורת האחסון (ים) של המזין. פרוטוקול זה אינו מהווה תחליף אלא הוא משלים מדידות של VCO 2 משום שהוא מספק מידע שונה נוסף. השיטה המתוארת כאן מודד נשף, radiolabeled CO 2 כי הוא תוצר של חמצון של כמויות זעירות של מצעים מטבוליים ספציפיים. על ידי שינוי התווית בשימוש - גלוקוז, חומצות שומן, או חומצת אמינו - אחד יכול לעצב ניסויים מתוחכמים יותר ויותר להעריך את תרומתם של מצעים שונים למטבוליזם בתנאים פיסיולוגיים שונים כגון הרעבה על רקע גנטי שונה. יישומים עתידיים של טכניקה זו כוללים מדידת metabolisמ בשלבי זחל גלמים של פיתוח, שני שלבי מחזור החיים תסיסנית המאופיינות קצוות של אחסון מזין והתמוטטות, בהתאמה.

עבודה באורגניזם מודל תסיסנית תרמה רבות להבנת עקרונות גנטיים, תהליכים התפתחותיים, צמיחה, הזדקנות, התנהגות, חסינות ומחלות של בני אדם 1,2. מספר עצום של גישות ביולוגיות גנטיות תא תסיסנית העלתה התקדמות בתחומים אלה. עם זאת, המחקר של חילוף החומרים זבוב הפירות פיתחה לאט יותר, בין השאר כתוצאה גדול קשיים במדידת פרמטרים מטבוליים חיה קטנה כזאת. העניין באמצעות תסיסנית כמודל לחקר מחלות אנושיות כגון סוכרת להבנת תרומתם של חילוף החומרים כדי פתולוגיות צמיחה שונים דחף בתחום לפתח ולהתאים טכניקות מטבולית אורגניזם הזה 3,4. שיטות אמינות זמינות כעת למדידת מספר הפרמטרים מטבוליים זבוב הפרות. לדוגמה, זה פשוט להעריך את צריכת המזון <sעד&gt; 5, רמות הטריגליצרידים מאוחסנים גליקוגן, כמו גם רמות hemolymph במחזור של גלוקוז והסוכר במחזור מרכזי לטוס, trehalose, שהינה דו סוכר המורכב משתי מולקולות של גלוקוז 4. שימוש קליעים נותבים מטבולית אפשרה בחקר מזין הקליטה מן הדיאטה ואת ההמרה של חומרים מזינים נספגים כגון גלוקוז אל גליקוגן צורות אחסון וטריגליצרידים 6. קצב חילוף החומרים ניתן להעריכם זבוב הפירות באמצעות מדידת צריכת החמצן 7,8 ופחמן דו חמצני (CO 2) ייצור. במעגל החומצה הציטרית מתחמצן יחידות דו-חמצנים שיכולים להיכנס למעגל כמו אצטיל-אנזים (COA), אשר נגזרה מטבוליזם של פחמימות בתזונה ומאוחסן וחומצות שומן. כל סיבוב של מחזור מייצר מולקולה אחת של GTP (או ATP) ואת תורם אלקטרון 2 FADH, שלוש מולקולות של NADH, ואת שתי מולקולות של CO פסולת 2. הפקה משותפת 2 יכוללהשתמש כדי להעריך את קצב חילוף חומרים בסיסי. ייצור הכולל CO 2 ניתן לכמת תסיסנית באמצעות-הזמין מסחרית או בעבודת יד respirometers 9-10,11. מדידת הייצור הכולל CO 2, במיוחד כאשר מצמידים עם מדידת צריכת O 2, מספק תובנה חשובה לחילוף חומרים של אנרגיה לכל הגוף. עם זאת, מדד זה לא יזהה את המזין מלהיות חמצון עבור אדנוזין אדנוזין (ATP) ייצור. שלושה סוגים עיקריים של חומרים מזינים יכול להיכנס ההמרה הבאה מעגל החומצה הציטרית כדי אצטיל CoA: פחמימות, חומצות שומן, וחלבונים. גלוקוז-6-פוספט, נגזר מן הגלוקוז תזונתיים או הגליקוגן, ניתן להמיר ל פירובט כי הוא decarboxylated ידי פירובט דהידרוגנאז לגבש CoA אצטיל. התפלגות חומצות שומן נגזרות הדיאטה או טריגליצרידים מאוחסנים על ידי תשואות-חמצון ß אצטיל CoA כי אז נכנסה במעגל החומצה הציטרית. סוף כל סוף, ברוב של חומצות אמינו יכול להיכנס למעגל חומצת הלימון הבא המרתי ל פירובט, אצטיל ביניים מחזור CoA או חומצת לימון כגון ketoglutarate אלפא. מזין ספציפי תרומה לחילוף אנרגיה במהלך בסיס ותנאי מגורה ניתן לנטר באמצעות קליעים נותבים רדיואקטיביים. הפרוטוקול המובא כאן הוא מותאם לשימוש תסיסנית מתוך פרוטוקול המשמש להערכת חמצון בתאים הגדלים בתרבית 12,13. לפי גישה זו, זבובי פרות ניזונים 14 מצעים מטבולית C-רדיואקטיבי (פחמימות, חומצות שומן, או חומצות אמינו) בתזונה לזמן קצר (שעות) או ארוכים (ימים) דופק, רדפו על מזון ללא תווית, ולאחר מכן נחשף תא המכיל אשלגן הידרוקסידי (KOH) נייר סינון -saturated על השמנת CO ננשף 2 כמו ביקרבונט. ניתן לכמת ביקרבונט radiolabeled ידי ספירת נצנץ. הבדלי radiolabeled-CO 2 ייצור בין הניסויקבוצות אל זבובים עשויות לשקף שימוש בדלקים שונים לייצור ATP במהלך של הבדלים מהר או פנימיים ממושך במטבוליזם דלק בין גנוטיפים, למשל.

<table><tbody><tr><td>PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC075H050UC</td><td></td></tr><tr><td>GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC045X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, D-[1-14C]-, 50&amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC043X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12 x 75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959AA</td><td></td></tr><tr><td>Mesh, nitex nylon, 120 &amp;micro;m</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102</td><td></td></tr><tr><td>20 ml borosilicate glass scintillation vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-15</td><td></td></tr><tr><td>Flask top stopper with off-center hole</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882310-0000</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene center well</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882320-0000</td><td></td></tr><tr><td>Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-874-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps</td><td>National Diagnostics</td><td>SVC-06</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of carbon dioxide production from radiolabeled substrates in drosophila melanogaster

כוחה של הגנטיקה תסיסנית הולכת ומיושמת בהדרגה לשאלות של איתות הורמון ואת חילוף החומרים כדי פיתוח מודלים של מחלות אנושיות באורגניזם זה. רגישות שיטות למדידות של פרמטרים כגון קצב חילוף חומרים נדרשות לנהוג להבנת פיזיולוגיה ומחלות בבעלי חיים קטנים כמו זבוב הפרות. השיטה המתוארת כאן מעריך חמצון דלק במספרים קטנים של זבובים בוגרים נמאס מזון המכיל כמויות זעירות של 14 מצעים C שכותרתו כגון גלוקוז או חומצת שומן. לאחר תקופת ההאכלה וכל מניפולציות ניסיוני נוספות, זבובים מועברים צינורות קצרים כתרים עם רשת, אשר ממוקמים אז צלוחיות זכוכית המכילות נייר סינון KOH-רווי כי מלכודות נשף, CO radiolabeled 2 שנוצר מפני התחמצנות של מצעים רדיואקטיבי כמו אשלגן ביקרבונט, KHCO 3. ביקרבונט radiolabeled זו נמדד על ידי ספירת נצנץ. זהו aquantitative, לשחזור, גישה פשוטה לחקר חמצון דלק. השימוש של גלוקוז רדיואקטיבי, חומצות שומן, חומצות אמינו או מאפשר לקבוע את תרומתו של מקורות דלק שונים אלה לחילוף אנרגיה בתנאים שונים כגון האכלה וצום וב רקע גנטי שונה. זה משלים גישות אחרות המשמשות למדידה במטבוליזם אנרגית vivo וצריך לקדם את ההבנה של ויסות חילוף חומרים.

כמות radiolabeled נשף לכודים CO 2 כי מופק מטבוליזם של מצע רדיואקטיבי צריך לתאם עם מספר הזבובים בתרמיל לטוס כמו גם את משך הזמן החיות לבלות במנגנון אוסף CO 2. כדי לבחון זאת, זבובים שהיו צם במשך 18 שעות הואכלו חומצה פלמיטית רדיואקטיבי (0.02 μCi / מזון μl) עבור 2 שעות ולאחר מכן נבדק לייצור radiolabeled CO 2 בקבוצות של 12 או 25 חיות במשך 3 או 6 incubations hr. כמות ה- CO 2 המיוצרת על ידי 25 זבובים הייתה כמעט כפול הכמות המיוצרת על ידי 12 זבובים, ואת הסכום לכל קבוצה הוכפל כאשר זמן הדגירה, מ -3 שעות עד 6 שעות (איור 2 א). Pmol 14 CO 2 / לטוס / hr היה כמעט שווה ערך בכל קבוצה. צום מגרה את התמוטטות חומצות שומן על ידי SS oxidation; ולכן CO 2 ייצור מפני התחמצנות חומצות שומן צריך להיות מורם בחיות צמות לעומת האכלת חיות. כדי לקבוע אם זה היה המקרה, 18-hr צם זבובים הואכלו חומצה פלמיטית radiolabeled עבור שעה 2. בעקבות דופק האכלה קצר זה, זבובים חולקו לשתי קבוצות והועברו אוכל לטוס ללא תווית או אגר 1% במשך 3 שעות ולאחר מכן הועברו לטוס תרמילים עבור שעה 2. בשני ניסויים נפרדים, זבובים רדפו על CO radiolabeled משמעותית אגרו פיק יותר 2 לעומת זבובים רדפו על מזון (איור 2 ב), המציין כי חמצון ß הוגדל בחי הצם. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig1.jpg" /> איור 1. המנגנון לאיסוף נשף, radiolabeled CO 2. זבובים שכילו מצעים מטבולית רדיואקטיבי הםמכניס &quot;לעוף תרמיל&quot; (FP), צינור צנטריפוגות הפסקה כתרים עם רשת (M). תרמיל הזבוב מושם לתוך בקבוקון נצנץ זכוכית 20 מיליליטר כתרים עם פקק מכסה גומי (S) המכיל חור מחוץ למרכז, דרך אשר ממוקם מרכז היטב (CW) המכיל מסנן נייר GF / B רווי 100 μl 5% KOH. נשף CO 2 מגיב עם KOH והוא לכוד על נייר פילטר כמו ביקרבונט. לכודים, ניתן לכמת CO 2 רדיואקטיבי על ידי ספירת נצנץ של נייר הסינון הרווי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig2.jpg" /> איור 2. 14 וקושרת ייצור CO 2 עם זמן ואת מספר זבוביםPod Fly ומגיב הפד והגבלות צמות. (א) סכום של 14 CO 2 מיוצר זבובים נמאס palmitate radiolabeled בקורלציה עם מספר הזבובים נבדק (n = 12 (ברים פתוחים) או 25 (ברים סגור)) ואת משך הזמן בתוך תרמיל זבוב (3 או 6 שעות ). על בסיס לכל-fly, זבובים מיוצרים 0.99, 1.13, 1.10 ו 1.01 pmol 14 CO 2 / hr (נתונים המפורטים באותו שמאלי כדי בסדר נכון כנתוני גרף). (ב) זבובים נרדפו על אגר מתחמצן יותר radiolabeled palmitate מאשר זבובים כי נרדפו על מזון. ממצאים מתוך שני ניסויים מדווחים כאמצעי סטיית תקן, n = 16 - 17 זבובים / קבוצה (ניסוי 1); n = 10 זבובים / קבוצה (ניסוי 2). * P = 0.017, מבחן t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

מדידת ייצור פחמן דו-חמצני מן radiolabeled מצעים ב<em&gt; תסיסנית</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

measurement-carbon-dioxide-production-from-radiolabeled-substrates

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

9.1K Views.  University of Virginia. This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Video: Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human organs, possess highly conserved metabolic pathways and have a relatively short lifespan that allows the study of different fundamental mechanisms in a short period of time. It is, however, surprising that one of the mechanisms essential for cellular metabolism, the mitochondrial respiration, has not been thoroughly investigated in this model. It is likely because the measure of the mitochondrial respiration in Drosophila usually requires a very large number of individuals and the results obtained are not highly reproducible. Here, a method allowing the precise measurement of mitochondrial oxygen consumption using minimal amounts of tissue from Drosophila is described. In this method, the thoraxes are dissected and permeabilized both mechanically with sharp forceps and chemically with saponin, allowing different compounds to cross the cell membrane and modulate the mitochondrial respiration. After permeabilization, a protocol is performed to evaluate the capacity of the different complexes of the electron transport system (ETS) to oxidize different substrates, as well as their response to an uncoupler and to several inhibitors. This method presents many advantages compared to methods using mitochondrial isolations, as it is more physiologically relevant because the mitochondria are still interacting with the other cellular components and the mitochondrial morphology is conserved. Moreover, sample preparations are faster, and the results obtained are highly reproducible. By combining the advantages of Drosophila as a model for the study of metabolism with the evaluation of mitochondrial respiration, important new insights can be unveiled, especially when the flies are experiencing different environmental or pathophysiological conditions.

In this paper, a method to measure oxygen consumption using high-resolution respirometry in permeabilized thoraxes of Drosophila is described. This technique requires a minimal amount of tissue compared to the classic mitochondrial isolation technique and the results obtained are more physiologically relevant.

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Biochemistry

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

ניטור הלב לתפקד הזחל תסיסנית melanogaster ללימודים פיזיולוגיים

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissection של Oenocytes מן למבוגרים תסיסנית melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

בידוד תסיסנית melanogaster האשכים

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Neuroscience

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

מדידה של קצב חילוף החומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; באמצעות Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

התאמת מיקרו-רספירומטריה לדרוזופילה - תובנות על מטבוליזם מוטנטי של CASK

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable environment. A coulometric microrespirometer consists of an airtight chamber in which O2 is consumed and the CO2 produced by the organism is removed by an absorbent medium. The resulting pressure decrease triggers electrolytic O2 production, and the amount of O2 produced is measured by recording the amount of charge used to generate it. In the present study, the method has been adapted to Drosophila melanogaster tested in small groups, with the sensitivity of the apparatus and the environmental conditions optimized for high stability. The amount of O2 consumed by wildtype flies in this apparatus is consistent with that measured by previous studies. Mass-specific O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and known to be less active, was not different from congenic controls. However, the small size of CASK mutants resulted in a significant reduction in O2 consumption on a per-fly basis. Therefore, the microrespirometer is capable of measuring O2 consumption in D. melanogaster, can distinguish modest differences between genotypes, and adds a versatile tool for measuring metabolic rates.

מחבר זרקור: השפעת הטמפרטורה על Drosophila melanogaster וחיפושיות מותאמות מדבר 

Coulometric respirometry is ideal for measuring the metabolic rate of small organisms. When adapted for Drosophila melanogaster in the present study, measured O2 consumption was within the range reported for wildtype D. melanogaster by previous studies. Per-fly O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and less active, was significantly lower than the wildtype.

מדידת צריכת O2 בדרוזופילה מלנוגסטר באמצעות מיקרו-רספירומטריה קולומטרית

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

מדידת ייצור פחמן דו-חמצני מן radiolabeled מצעים ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video